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CARACTERIZACIN DE LOS RECEPTORES 5HT5A DURANTE LA ONTOGENIA

DEL SISTEMA NERVIOSO DE LA RATA


Valencia Ojeda C. (1); Berumen L.C. (1); Garca-Alcocer G. (1); Rodrguez A. (1); Castillo
Ramos N. (1); Escobar Cabrera J.E. (1); Roman Maldonado E.E. (2)
(1) Facultad de Ciencias Qumicas / Universidad Autnoma de Quertaro
(2) Unidad Acadmica de Ciencias Qumicas/ Universidad Autnoma de Zacatecas.
RESUMEN
La serotonina (5-HT) es un neurotransmisor que se sintetiza principalmente en los ncleos de
rafe del tronco cerebral y se localiza en el sistema nervioso central. Este neurotransmisor ha
sido relacionado con diversos mecanismos fisiolgicos e inhibiciones conductuales en
mamferos, adems en el ser humano se ha demostrado que ste posee efectos en el humor y
el estado mental, siendo estos efectos difciles de determinar. La gama de efectos que la
serotonina posee puede ser explicada debido a la existencia de hasta 14 subtipos diferentes de
receptores. En este trabajo se analiz el receptor 5-ht5A, uno de los receptores de serotonina
menos estudiados y comprendidos. Para este trabajo se utiliz la corteza cerebral de ratas
embrionarias de 14, 16 y 18 das y ratas post- natales de 0, 7, 12, 21, 60 y 120 das; se realiz
una electroforesis SDS-PAGE y un Western Blot, dando como resultado la banda esperada
correspondiente a la protena (de aproximadamente 41kDa), adems de otras protenas de
menor peso molecular posiblemente de inters que el anticuerpo identific como receptores 5ht5A.
INTRODUCCIN
La serotonina (5-hidroxitriptamina, 5-HT) regula una gran variedad de funciones sensoriales,
motoras y las funciones de comportamiento en el sistema nervioso central de mamferos. Este
neurotransmisor es sintetizado por las neuronas de los ncleos del rafe del tronco cerebral que
se proyectan en todo el sistema nervioso central, con la mayor densidad en los ganglios
basales y las estructuras lmbicas (Steinbusch, 1984). La serotonina presenta una gran
diversidad de efectos que son mediados por su unin a diversos receptores especficos de
membrana. Tanto la serotonina como sus receptores estn presentes en el sistema nervioso
central y en el sistema nervioso perifrico, as como en numerosos tejidos no neuronales del
intestino, sistema cardiovascular y clulas sanguneas (Iceta, 2008). Hasta el momento, se han
identificado hasta siete miembros dentro de la familia de receptores de serotonina (5-HT1 a 5HT7) y diversos subtipos incluidos algunos de estos miembros. Ello ha conducido a la
descripcin y consideracin de un total de hasta 14 tipos distintos (Hoyer y Martin, 1997).
El neurotransmisor 5-HT tambin ha sido implicado en tener un papel en la fisiopatologa de
los trastornos como la depresin, la ansiedad, la esquizofrenia y el trastorno obsesivocompulsivo. Un amplio espectro de acciones pueden ser explicadas por la existencia de los
diferentes subtipos de receptores 5-HT con localizaciones y funciones distintas dentro del
sistema nervioso central (Barnes y Sharp, 1999). Farmacolgica y funcionalmente, hay una
mayor comprensin de las familias de receptores 5-HT1, 5-HT2, 5-HT3, y 5-HT4 que de los
subtipos 5-HT5, 5-HT6 y 5-HT7. Las familias de receptores 5-HT son receptores acoplados a
protenas G a excepcin de 5-HT3 que acta a travs de mecanismos de canales inicos. La
familia 5-HT5, ms relacionados con los receptores 5-HT1D comprende a los receptores 5-ht5A
y receptores 5-ht5B. Estudios sobre la localizacin del RNA mensajero, principalmente en el
cerebro humano, y de forma limitada en el cerebro de rata, han mostrado una amplia

distribucin central de estos subtipos (Kinsey y col., 2001), a pesar de ello los receptores 5HT5 son probablemente los menos estudiados de todos los receptores de serotonina y existen
pocos estudios realizados acerca de la respuesta fisiolgica y el sitio especifico de unin de
stos receptores (Iceta, 2008).
METODOLOGA
Preparacin de muestras
Ratas Sprague Dawley embrionarias de 14, 16 y 18 das (correspondiente a tres camadas) y
ratas post- natales de 0, 7, 12, 21, 60 y 120 das (correspondiente a 3 ratas macho por muestra)
fueron sedadas con anestsico comercial y decapitadas para la diseccin y obtencin de su
corteza cerebral. La corteza obtenida fue homogenizada con buffer de extraccin Tris (5OmM
pH 7.4) en presencia de inhibidores de proteasas, todo eso se realiz en un bao de hielo para
evitar la destruccin de la protena.
Para la electroforesis a las muestras se les adicion amortiguador de muestra segn la
cantidad de protena presente, se hirvieron 5 minutos y centrifugaron.
Electroforesis
Se realiz una electroforesis SDS-PAGE con geles de acrilamida (gel separador al 10% y gel
concentrador al 4%), se utilizaron peines de 1 mm de grosor y 15 pozos. Se cargaron 15L de
la solucin de protena y amortiguador por pozo en el siguiente orden: embrionarias (E) de 14,
16 y 18 das, ratas post- natales (P) de 0, 7, 12, 21, 60 y 120 das y 15L de marcador de peso
(PM). Una vez cargados los geles , se colocaron en la cmara de electroforesis con buffer de
electrodo 1X y se corrieron a 100V durante 10 minutos para alcanzar el gel separador y a
150V durante 50 minutos.
Transferencia (Western Blot)
Los geles se equilibraron en el amortiguador de transferencia durante 15 minutos. En un
recipiente diferente, se equilibraron 2 membranas, 4 papeles filtro y 4 fibras; en este
recipiente se arm el cassette de transferencia colocando el lado negro del cassette, una fibra,
un papel filtro, el gel, la membrana, un papel filtro, una fibra, lado blanco del casette,
teniendo especial cuidado en evitar la formacin de burbujas y la contaminacin de la
membrana, el cassette se cerr y se coloc en la cmara de trasferencia ubicando la base del
cassette negro hacia la parte negra y la blanca hacia la roja. Se coloc un agitador magntico y
un recipiente con hielo dentro de la cmara y se llen con buffer de transferencia. Se corri a
200mA durante una hora sobre un agitador magntico para homogenizar la temperatura.
Una vez terminada la corrida se sac el cassette y se retir la fibra y el papel filtro, adems se
marcaron las orillas del gel para poder localizarlo en la membrana as como el flujo de
electrones. Las membranas se lavaron 3 veces con PBS 1X durante 10 minutos en un
recipiente con tapa y en agitacin, despus de los lavados se bloque la membrana con suero
de leche al 3% preparado en PBS por 1 hora; trascurrido el tiempo se retir la solucin de
leche y se realizaron 3 lavados con PBS, igualmente en agitacin constante, una vez
terminados los lavados se incub la membrana con el primer anticuerpo de conejo 5HT5A
SEROT (5L de anticuerpo en 20mL de PBT) durante toda la noche. Por la maana se
recuper el anticuerpo y la membrana se lav 3 veces con PBT durante 10 minutos, despus
de los lavados se procedi a colocar el segundo anticuerpo (7L de anticuerpo Conjugado
cabra Anti-conejo HRP en 20mL de PBT) durante dos horas; transcurridas las 2 horas se

recuper el segundo anticuerpo y la membrana fue lavada 2 veces con PBT por diez minutos
y 2 veces mas con PBS. Terminados los lavados se procedi a revelar.
El revelado fue realizado en un cuarto completamente oscuro para evitar el velado de las
placas. La membrana se incub en ECL durante un minuto y se coloc en una bolsa de
plstico cuidando que no hubiera burbujas que interfirieran. Las luces se apagaron y se coloc
la placa fotogrfica sobre la bolsa, se expuso durante 10 segundos cuidando no mover la placa
al colocarla la primera vez debido a la intensidad de la exposicin. Una vez expuesta se pas
al lquido revelador durante un minuto, al agua durante un minuto y al lquido fijador durante
un minuto ms, una vez terminada la secuencia se paso a un recipiente de agua y se
encendieron las luces para observar resultados.
RESULTADOS Y DISCUSIN
Posterior al revelado se observ la banda ms densa alrededor de los 38kDa, correspondiente
al peso correspondiente para 5-ht5A de alrededor 41kDa, adems se observaron diversas
bandas de menor peso molecular que resultan ser de inters (Figura 1).

Figura 1. Bandas inmuno reactivas para receptor a serotonina, se indica con A la lnea de
bandas con mayor densidad correspondientes a 5-ht5A. Se muestran otras bandas de inters
(B). Edades embriones de 14 das (E14), 16 das (E16), 18 das (E18), ratas recin nacidas
(P0), ratas de 7 das (P7), de 12 das (P12), de 21 das (P21), de 60 das (P60), de 120 das
(P120)
Se observa que las bandas correspondientes a los embriones presentan una menor densidad y
no existe un aumento significativo de los receptores durante esta etapa. Mientras en los postnatales de 0, 7 y 12 das se observa una mayor cantidad de receptores respecto a los
encontrados en las ratas embrionarias as, adems se observa una disminucin de los
receptores a partir del da 21 hasta el da 120 donde la concentracin es mucho menor a la
mostrada en el da 0. En cuanto a las bandas de inters, se cree que pueden ser resultado de
otra forma de la protena (splicing) con un menor peso molecular. Cabe destacar, adems que
la aparicin de una segunda banda de menor peso molecular a las sealadas como posibles
splicing coincide con el comienzo de la disminucin de la banda originalmente estudiada (5ht5A) lo que podra sugerir una perdida de maquinaria para la produccin de receptores ya que
al no haber informacin sobre este tipo de receptor no es posible concluir si las bandas
encontradas resultan ser protenas funcionales, splicing alternativos o residuos de receptores.
CONCLUSIN
La comprensin de los diferentes tipos de receptores a serotonina es fundamental para poder
explicar la regulacin de los diferentes sistemas y comportamientos a los que da lugar y poder

as poder dar un tratamiento clave a algunos trastornos dependientes a la serotonina. En este


trabajo se encontr informacin sobre el desarrollo de los receptores durante la ontogenia de
la rata, as como la posible existencia de diferentes formas del receptor basados en la idea de
la selectividad del anticuerpo; sin embargo es necesaria la realizacin de mas estudios
referentes a este receptor para poder afirmar o negar lo antes dicho y para una mejor
comprensin del mecanismo con el que acta.
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
Barnes, N.M., Sharp, T., A review of central 5-HT receptors and their function.
Neuropharmacology. 38 (8), 10831152. 1999
Hoyer, D., Martin G. R., 5-HT receptor classification and nomenclature: towards a
harmonization with the human genome. Neuropharmacol., 36 (4-5): 419-28. 1997
Iceta-Echave, R. Caracterizacin del transportador de serotonina humano en celulas CACO2: Estudio de los mecanismos de regulacin fisiolgica Tesis de Doctorado, Universidad de
Zaragoza, Espaa, 2008
Kinsey A. M., Wainwright A., Heavens R., Sirinathsinghji D.J.S, Oliver K. R., Distribution
of 5-ht5A, 5-ht5B , 5-ht6 and 5-HT6 receptor mRNAs in the rat brain, Molecular Brain
Research. 88, 194198, 2001
Steinbusch, H. Win Handbook of Chemical Neuroanatomy: Classical Transmitters and
Transmitter Receptors in the CNS, Elsevier, Amsterdam, 1984