Anlisis de Protenas

Electroforesis, Transferencia e Inmunodeteccin

advansta

Anlisis de Protenas

Anlisis de Protenas:
Electroforesis, Transferencia e Inmunoprecipitacin.
Un manual de laboratorio de la empresa Advansta
Western Blot es una tcnica analtica, ampliamente utilizada, para el estudio de protenas.
Este mtodo, descrito por primera vez por Towbin, et. al1, permite la deteccin de una sola
protena dentro de una muestra biolgica. La especificidad de Western Blot se logra mediante la utilizacin de un anticuerpo que reconoce y se une a un eptopo nico de la protena de inters.
Con la tcnica de Western Blot se puede estimar el tamao de una protena, confirmar la
presencia de modificaciones post-traduccionales como la fosforilacin,
y ser utilizado para comparar cuantitativamente los niveles
de protena entre muestras.
Esta gua de laboratorio describe los pasos
involucrados en la realizacin de un Western
blot, incluyendo la preparacin de muestras,
la separacin de protenas, la transferencia y
la deteccin.

ndice de Contenidos

Pgina

1. Western Blot: Visin General

2. Preparacin de las muestras

3. Electroforesis en gel de Poliacrilamida

4. Transferencia Electrofortica

11

5. Hibridacin Anticuerpos

13

6. Deteccin

15

7. Solucin de Problemas

17

8. Herramientas y Referencias Tcnicas

21

1. Towbin, H. et. al. (1979) Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 76(9):4350-4.
Pgina 1

Western Blot:
Visin General

1. Western Blot: Visin General

Consulte los captulos siguientes para obtener ms detalles acerca de cada paso.
a. Preparacin de la muestra
Extraccin de las protenas de
las muestras biolgicas mediante disrupcin mecnica o
qumica.

Los materiales de partida incluyen

planta, tejidos animales, clulas
cultivadas, levadura, o bacterias.

La disrupcin mecnica
con un homogenizador
disgrega los tejidos.
Procesos adicionales
logran el fraccionamiento subcelular

Se usan tampones conteniendo detergentes

para la lisis celular
Figura 1. Preparacin de muestras

b. Electroforesis en gel de
Acrilamida
Las protenas en el extracto se
separan de acuerdo a su tamao mediante electroforesis.
Se prepara un gel de acrilamida, bisacrilamida.
El dodecilsulfato de sodio
(SDS) aadido al gel se une a
las protenas y confiere, de
forma proporcional a la masa
de cada protena, una carga
negativa a cada una de ellas.

Se aade un colorante de carga. As, la

migracin de la muestra se puede monitorizar.

Se utiliza una pipeta para

cargar las muestras en los
pocillos del gel

Una fuente de alimentacin proporciona el voltaje

El gel se coloca dentro de un tanque

de electroforesis lleno de tampn,
que conducir la corriente. La protenas con carga negativa migran desde el nodo.
Figura 2. Electroforesis en Acrilamida

c. Transferencia electrofortica a una membrana

Las protenas son transferidas
electroforticamente a un
soporte rgido o membrana,
dnde quedan inmovilizadas.

El gel y la membrana se coloca

entre papel de filtro y almohadillas
de esponja..

Se aplica voltaje en el
tanque de transferencia y
las protenas migran desde
el gel a la membrana.

Un cartucho aplica presin y

mantiene un estrecho contacto
entre el gel y la membrana.
Figura 3. Transferencia de Protenas a la Membrana

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Anlisis de Protenas

a. Hibridacin del Anticuerpo

La membrana con las protenas inmovilizadas debe tratarse para bloquear las zonas
con ausencia de protenas y
as evitar la unin no especfica de los anticuerpos.
A continuacin se incuba con
un anticuerpo primario dirigido contra el eptopo especfico de la protena diana.
Tras varios lavados de la membrana, se adiciona un anticuerpo secundario marcado
que se unir de forma especfica al anticuerpo primario,
proporcionando una forma
de deteccin.

Los materiales de partida incluyen

tejidos vegetales, tejidos animales,
clulas en cultivo, levadura, o bacterias.

Figura 4. Hibridacin de Anticuerpo

e. Deteccin de las Bandas

Despus de un lavado de la
membrana para eliminar el
anticuerpo no unido, se procede a detectar la localizacin de la banda en la membrana. Para la deteccin de
quimioluminiscencia, se utiliza
un anticuerpo secundario
conjugado con el enzima peroxidasa (HRP); la adicin de
un sustrato de HRP provoca
una reaccin enzimtica que
da como resultado final la
emisin de luz. Dicha luz puede ser detectada en una pelcula de rayos X, o de forma
digital, mediante un sistema
de captacin de imgenes.
La deteccin de fluorescencia se basa en la captacin
de luz emitid por sustancias
fluorforas conjugadas con el
anticuerpo secundario.

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Figura 5. Deteccin quimioluminiscente de las bandas de protenas

Preparacin
de la muestra

2. Preparacin de la muestra
Una adecuada preparacin de la muestra es
esencial para tener xito en un ensayo de Western Blot. En la mayora de ensayos, las protenas
se extraen mediante procesos qumicos y/o
mecnicos. El mtodo elegido depender del
tipo de muestra de partida, de la localizacin
subcelular de la protena y de las condiciones
ptimas que requiera el anticuerpo para reconocer el eptopo proteico. En la tabla 1 se resumen
los mtodos mecnicos que habitualmente se
utilizan en la extraccin de protenas para inmunotransferencia.
A menudo, en muestras tisulares de plantas y animales, se requiere el uso de un proceso mecnico para la disrupcin de la compleja matriz celular. Disrupcin mecnica que suele preceder a un
proceso qumico de lisis celular, mediante el uso
de solucin tampn que contiene detergentes,
que va dirigida a enriquecer la protena de inters
dentro del extracto final. Las clulas en cultivo,
frecuentemente, se suelen lisar utilizando una solucin tampn con detergente y sin la aplicacin
de mtodos mecnicos.
La estructura qumica de los detergentes permite
romper las membranas celulares y solubilizar las
protenas. Estas substancias tienen una parte polar y otra no polar y se pueden clasificar segn las
caractersticas del grupo polar: inicos si el grupo
polar tiene carga positiva o negativa, no inicos si
no poseen carga o zwiterinicos si poseen carga
negativa y positiva y la carga neta es 0.
La eleccin de la substancia detergente, depende en parte de la localizacin, dentro de la clula, de la protena de inters, citoplasmtica, unida a la membrana, dentro de orgnulos celulares
como el ncleo y las mitocondrias, etc...Las protenas citoplasmticas se pueden unir a las protenas del citoesqueleto, afectando as a los procesos de fraccionamiento subcelular.
En la tabla 2 se clasifican las soluciones tampn y
detergentes, ms utilizados habitualmente, segn
el tipo de protena y localizacin subcelular.

Tabla 1. Mtodos fsicos para la dirupcin de muestras

Mtodo

Descripcin

Tipo de muestra

Licuadora

La muestra se tritura
mediante cuchillas
rotatorias

Gran cantidad de
tejido

Homogenizador
Dounce

Tubo de vidrio con

pistn ajustado maja
las clulas por accin de corte.

Clulas tisulares; til

para protocolos de
enriquecimiento de
protenas mitocondriales o nucleares

Homogenizador de
ultrasonidos

Ondas de sonido
Clulas, tejidos, bacemitidas por una
terias.
sonda para romper
las membranas celulares

Pulverizacin en
Nitrgeno lquido

La muestra se pulve- Tejido animal o o

riza utilizando un
vegetal
mortero y una almirez refrigerados

Perlas de vidrio

La ruptura celular se Levaduras

produce por agitacin de las perlas de
vidrio

Tabla 2. Soluciones Tampn y detergentes, segn el tipo de protena de inters y la localizacin subcelular
Tipo/Localizacin
Protena de inters

Detergente o Solucin Tampn

TComentarios

Nativa (no desnaturalizada)

Detergente suave
no inico

Evitar detergentes
desnaturalizantes
(SDS, Deoxicolatos)

Citoplasmticos
(soluble)

Tris-HCl

Puede combinarse
con mtodos mecnicos, tales como el
homogenizador
Dounce

Citoplasmtico
(unida a citoesqueleto)

Tris-Triton

Los detergentes
Triton son suaves y
no inicos

Membrana mitocon- NP-40, RIPA

drial o nuclear
(multiples detergentes), Triton X-100

Lisado total de clulas

Para antgenos con

niveles bajos de
expresin pueden
ser necesarios procesos de enriquecimiento

NP-40, RIPA,
Triton X-100

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Anlisis de Protenas
Con la rotura celular, se liberan enzimas proteasas
que pueden degradar la protena de inters. Por
tanto, es importante evitar, durate la preparacin
de la muestra, cualquier actividad protesica.

Tabla 3. Inhibidores de fosfatasas y proteasas utilizans en la extraccin de protenas.

Inhibidores Proteasas

Concentracin en Enzimas diana

el Tampn de lisis

La siguiente estrategia ayuda a evitar la degradacin de protenas:

Aprotinina

1-2 g/ml

Proteasas de Serina

EDTA

1-10 mM

Mg++/Mn++ Metaloproteasas

EGTA

1-10 mM

Ca++ Metaloproteasas

Leupeptin

1-2 g/ml

Proteasas de Serinas,
Cisteinas

Pepstatina A

1g/ml

Proteasas de Aspartico

PMSF

(17-170 g/ml)
O,11 mM

Proteasas de Serina

Inhibidores
Fosfatasas

Concentracin en
el Tampn de lisis

Enzimas diana

- Glicerofosfato

1 mM

Fosfatasas Serina/
Treonina

EDTA

1-10 mM

Mg++/Mn++ Metaloproteasas

EGTA

1-10 mM

Ca++ Metaloproteasas

Leupeptin

1-2 g/ml

Proteasas de Serinas,
Cisteinas

Pepstatina A

1g/ml

Proteasas de Aspartico

PMSF

(17-170 g/ml)
O,11 mM

Proteasas de Serina

Evitar excesivos ciclos de congelacin/

descongelacin.
Trabajar rpido y mantener las muestras en
fro durante todo el proceso.
Aadir inhibidores de la proteasa en el
tampn de lisis.
Adems de inhibir la actividad de la proteasa,
puede ser interesante reducir la actividad de la
fosfatasa alcalina, en particular en estudios de
fosforilacin.
En la tabla 3 se muestran los inhibidores deproteasa y fosfatasa de uso ms habitual.

3. Electroforesis en Acrilamida
Las protenas del extracto se separan mediante
electroforesis en gel de poliacrilmaida (PAGE). En
primer lugar, las protenas, se revisten con carga
negativa, mediante la accin del detergente Dodecilsulfato Sdico (SDS), as Las protenas, se
pueden separar en el gel segn su tamao (SDSPAGE).
Medicin de protena total
Previamente a la electroforesis, es importante determinar la concentracin de protenas por las
siguientes razones:
1. Asegurar la carga de la cantidad correcta de
protenas en el gel.
La cantidad de protena ptima a cargar depender de la prevalencia de la protena de
inters y de la sensibilidad del anticuerpo primario.
Cargar mucha cantidad puede dar lugar a un
mayor ruido de fondo y unin no especfica de
los anticuerpos. A menudo, para determinar la
carga de protena apropiada, se requiere
hacer experimentos preliminares con cantidades seriadas de protenas.

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Nota: con el kit Afyon SDS-PAGE de preparacin de

muestra, se puede controlar la cantidad de carga de la protena mediante la cantidad de resina utilizada, evitando la
necesidad de determinar la concentracin de protena. Por
ejemplo, para 5 g de protena se utilizan 20 l de resina Afyon.

Informacin para pedidos

K-02101-025

Afyon SDS-PAGE ssmple preparation kit

Electroforesis
en Acrilamida
2. Realizacin de Western Blots cuantitativos o
semi-cuantitativos.
Si la cantidad de protena cargada por carril
es la misma, se pueden comparar los niveles
relativos de la protena de inters. Un experimento de Western Blot cuantitativo es til para
estudio de cambios de expresin de protenas
o de modificaciones proteicas como la fosforilacin.
Descripcin del mtodo

Tabla 4. Mtodos fsicos para la dirupcin de muestras

Ensayo

Descripcin

Ventajas

Inconvenientes

Bradford

El colorante
azul de Coomasie se une a
las protenas y
sufre un cambio de absorvancia

La realizacin
de los ensayos
son generalmente rpidos
y sencillos

Interferencia
de SDS o de
otros detergentes a
altas concentraciones
.
Rango lineal
pequeo.

BCA

Reduccin de Compatible
iones de Cu2+
con la mayo
mediante interacin con las
ra de deterprotenas, el
gentes
ComercialBCA se une a
los iones de
mente dispoCu1+ y forman
nible en forun producto
mato comcoloreado que
patible con
se puede meagentes
dir espectroforeductores.
metricamente Menos varia(reaccin de
cin proteBiuret)
na-protena
que en el
mtodo
Bradford.

Lowry

Similar al BCA
(reaccin de
Biuret)

Existen diversos mtodos para medir la protena

total de una muestra. Los ms habituales son los
mtodos Lowry, Bradford y cido Bincocinico
(BCA) (Tabla 4). Estos ensayos colorimtricos se
basan en las reacciones que se producen entre
las protenas de la muestra y los reactivos de deteccin.
Con el fin de determinar la concentracin de protenas totales en una muestra, se debe realizar
una curva estndar en cada ensayo. Esto se logra
con la realizacin de un ensayo de concentracin crecientes, de protena pura. El estndar utilizado con mayor frecuencia es la albmina de
suero bovino (BSA), aunque se puede utilizar cualquier protena producida en el laboratorio o disponible comercialmente.
En la figura 6 se muestra un ejemplo de una curva
estndar. Los valores de absorvancia se trazan en
funcin del contenido conocido de la protena
estndar utilizada. El contenido de la protena de
inters en la muestra (lnea verde) se puede determinar mediante la extrapolacin de la absorvancia obtenida a la cantidad o concentracin
de protena correspondiente.

Interferencia
con agentes
quelantes o
reductores del
Cobre

Muy bien cita- El tiempo de

da en literatura
ensayo puede ser mayor
que en otros
mtodos
No es prctico para
grupos grandes de
muestras
Se pueden
formar precipitados

Hay muchos kits de determinacin de protenas

disponibles comercialmente. La eleccin depende de muchos factores:
El equipo de lectura disponible en el laboratorio (espectrofotmetro, lector de placas,
etc).
Los reactivos del tampn de lisis - revisar el
protocolo del fabricante para identificar
sustancias interferentes.
La cantidad de muestra disponible.
La facilidad/rapidez del ensayo.

Absorvancia

Eleccin de un ensayo de protenas

Protena (mg)
Figura 6. Ejemplo de la curva estndar de un ensayo de protenas. Se representa la absorvancia de las soluciones estndar
que contienen la protena conocida (lnea roja). La concentracin de la protena de inters se puede determinar extrapolando la absorvancia obtenida en la curva patrn o estndar
(lnea verde de puntos).

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Anlisis de Protenas

Tampn de carga de muestras

Una vez se tienen las muestras de protena, se
pueden conservar congeladas, teniendo cuidado en evitar ciclos repetitivos de congelacin/
descongelacin. Alternativamente, se pueden
utilizar inmediatamente, combinndolas con un
tampn de carga y cargar la muestra en un gel
de electroforesis. Los componentes del tampn
de carga varan, dependiendo de las condiciones deseadas. Los ingredientes tpicos de un
tampn de carga para detectar protenas bajo
condiciones desnaturalizantes/reductoras se describen en la Tabla 5. No se utilizarn ni SDS, beta
mercaptoetanol o ditiotreitol, si se necesitan condiciones no desnaturalizantes /no reductoras.
Previamente a la carga del gel, las muestras se
someten a una incubacin a 95C durante 5-10
minutos, para asegurar que la desnaturalizacin/
reduccin es total. En condiciones no desnaturalizantes/no reductoras, esta incubacin no es necesaria. En la Figura 7 se ilustra cual es el mecanismo de desnaturalizacin del SDS.

La protena se encuentra en su
estado conformacional, manteniendo su carga intrnseca

SDS

El SDS se une a la protena y da

lugar a una linearizacin y a una
uniformidad de la carga negativa
de sta.
Figura 7. Mecanismo de desnaturalizacin por SDS de las protenas.

Tabla 5. Componentes del tampn de carga.

Reactivo

Propsito

Glicero.

Aportan Viscosidad/densidad para arrastrar

la muestra la fondo del pocillo y evitar que se
extienda a los pocillos adyacentes.

Azul de Bromofenol

Molcula colorante pequea:

Da color a la muestra para ayudar a
la carga.
Migra por delante de las protenas, de
modo que se puede hacer el seguimiento del movimiento de las muestras
en el gel.

SDS

Detergente desnaturalizante
Cola hidrofbica que rodea la esqueleto peptdico.
Unin a la protena de forma regular,
aportando carga negativa de forma
proporcional al tamao de la protena.
Evita las interacciones hidrofbicas y
rompe los enlaces de hidrgeno.
Destruye la estructura secundaria/
terciaria y lineariza la protena.

Beta Mercaptoetanol o DTT

Agentes reductores
Evita la oxidacin de cistenas.
Completan la linearizacin de la protena al romper los puentes disulfuro.

Tampn Tris Pepstatina A

Mantiene el pH adecuado

Nota: Los tampones de carga permiten ahorrar tiempo y

garantizan que las muestras se separan de forma reproducible, carril a carril y gel a gel. Advansta dispone de tampones
de carga reductores y no reductores.

Informacin para pedidos

R 03018-B10 Non-reducing protein sample loading buffer (2x)
R-03019-B10

Pgina 7

Reducing protein sample loading buffer (2x)

Electroforesis
en Acrilamida
Gel de Electroforesis
Si se requieren condiciones naturales para que el
anticuerpo pueda detectar el eptopo, en la
electroforesis no se aadir SDS ni en el gel ni en
el tampn de electroforesis. En esta situacin,
tambin conocida como PAGE nativo, las protenas mantienen su estructura tridimensional y la
migracin en el gel depende de su masa: relacin de carga de la protena por encima de su
tamao. Sin embargo, la mayora de ensayos
Western Blot, se realizan en geles de poliacrilamida conteniendo SDS (SDS-PAGE) en condiciones
desnaturalizantes. Bajo estas condiciones desnaturalizantes y de reduccin, las protenas cargadas negativamente, cuando se someten a un
campo elctrico, migran al electrodo positivo.
Debido a que el SDS iguala la carga en todas las
protenas, la tasa de migracin viene determinada por su peso molecular. Las molculas ms pequeas migran ms rpidamente que aquellas
con pesos moleculares mayores.

Tabla 6. Componentes del gel de acrilamida en las electroforesis

de protenas
Reactivos

Propsito

Acrilamida

Molculas que polimerizan para formar

cadenas.

Bisacrilamida

Forman uniones con las cadenas de acrilamida para formar un entramado.

SDS

Mantiene la linearidad y la uniformidad

de carga de las protenas segn la electroforesis.

Tampn Tris

Mantiene el pH adecuado.

Persulfato de Amonio

Generacin de radicales libres que catalizan la reaccin de polimerizacin.

TEMED

Aumenta la generacin de radicales

libres por el persulfato de amonio.

Los geles de SDS-PAGE estn disponibles comercialmente o se pueden elaborar en el propio laboratorio. Los geles pre-fabricados son muy
prcticos pero debido al coste, no son tan rentables como los elaborados por el usuario. En la tabla 6, se describen los componentes qumicos de
un gel de SDS-PAGE.
Eleccin del grosor del gel y del tamao de poro
El tipo de muestra y el peso molecular de la protena de inters dictan el espesor y tamao de
poro del gel.

Los espaciadores de gel (ver Figura 8) controlan el espesor del gel. Estn disponibles en
diversos tamaos.
Los geles con mayor espesor, pueden aceptar mayor volumen de carga. Tambin se
procesarn ms lentamente y requieren
tiempos de transferencia mas largos que los
geles ms delgados
El porcentaje del gel, segn la cantidad de
acrilamida y bisacrilamida, determina el tamao del poro. A ms porcentaje menos
tamao de poro.

Tabla 7. Rango de separacin de protenas segn el porcentaje

de acrilamida.
Porcentaje

Rango Peso Molecular (kDa)

7,5

25-500

10

15-300

12

10-200

15

10-45

20

5-40

El tamao de poro determina la ratio de separacin de las protenas. (tabla 7).

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Anlisis de Protenas

Elaboracin del gel

Si el gel de acrilamida esta elaborado en el laboratorio, los distintos reactivos se mezclan y se vierte en el molde, formado por el conjunto de dos
cristales, espaciadores lateral, espaciador inferior,
peines y un sistema de sujecin (Figura 8), dnde
la acrilamida se polimeriza en aproximadamente
30 minutos. Para mejorar la nitidez de la banda el
gel resolutivo se corona con una acrilamida de
menor porcentaje (stacking gel).

1. Colocar los espaciadores de la parte inferior y laterales entre

los cristales.
2. Tras fijacin de los lados, verter el gel resolutivo y esperar que
el gel se polimerice.
3. Colocar el peine en la parte superior del gel.

Diseo Experimental; Controles y Estndares

Antes de la carga del gel, es importante disear
el experimento incorporando los controles y
estndares necesarios para la validacin de los
resultados. Los tipos de estndares y controles utilizados incluyen:

4. Verter el stacking gel y quitar el peine una vez el gel haya

polimerizado. Lavar los pocillos con ddH20. El gel est listo
para cargar las muestras y la electroforesis.
Figura 8. Preparacin del gel de electroforesis para la separacin de protenas.

1. Marcadores de Peso Molecular.

Son una mezcla de protenas purificadas de

peso molecular conocido.

Se utilizan para verificar si la protena de inters est dentro del rango de tamao apropiado.

Disponible en diversos intervalos de pesos

moleculares, as como teidos o incoloros.
Las versiones preteidas se utilizan para
controlar el progreso de la electroforesis y
comprobar la eficacia de la posterior transferencia.

Pueden estar marcadas por la deteccin

por fluorescencia o quimioluminiscencia.

Controles de carga

Como norma general se utilizan protenas con

niveles de expresin constante para todas las
muestras. Similar a los housekeeping genes
en Biologa Molecular.

Algunos tratamientos pueden alterar la expresin de estas protenas housekeeping.

Se utiliza para verificar que la carga de protena por carril es ms o menos igual, as los niveles de protenas se pueden comparar de forma
cuantitativa.

La expresin cuantitativa de la protena de inters puede normalizarse con la del control de

carga para cada muestra.

2. Controles Positivos.

Para verificar si el anticuerpo primario se une

a la protena correcta.

Generalmente, si est disponible, son una

muestra de la protena de inters purificada.

Puede ser una lnea celular que sobreexprese la protena de inters.

Puede ser una muestra de tejido del que se

conozca que expresa altos niveles de la protena de inters. Se pueden utilizar otras especies como tejido de control si el anticuerpo tiene reactividad cruzada apropiada.

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Pptidos de bloqueo

Algunos proveedores ofrecen pptidos de bloqueo para sus anticuerpos.

El pptido de bloqueo se mezcla con el anticuerpo primario antes de la incubacin con la

membrana y evita la unn del anticuerpo a la
protena diana. Por tanto no se detectar ninguna banda.

Estos estudios demuestran que el anticuerpo

utilizado se une de forma especfica a la protena de inters.

Electroforesis
en Acrilamida
Inicio de Electroforesis
Muestra (pH 6,8)

Las muestras se cargan en los pocillos del gel mediante una pipeta. Normalmente se cargan de 20
a 40 g de protena total por carril. Es importante
conocer de antemano, el volumen que se puede
cargar por pocillo, para as evitar sobrecargas
que pueden dar lugar a la prdida de muestra o
derrames en pocillos adyacentes. Una vez finalizada la carga, el gel se somete a un campo elctrico generado por una fuente de alimentacin. El
tampn utilizado durante la electroforesis, contiene Tris (mantiene el pH), Glicina (conductor electricidad) y SDS (mantiene las protenas cargadas
negativamente). El progreso en el gel se monitoriza observando el frente coloreado por el colorante presente en el tampn de carga y la posicin
de los marcadores de tamao siempre que estos
estn teidos.
La tcnica de electroforesis ms habitualmente
utilizada es la de Laemmli. En este mtodo, los
valores de pH de la capa de gel de apilamiento
o concentracin (Stacking Gel) y el gel de resolucin (Resolving Gel) son diferentes. La figura 9 ilustra el flujo de iones durante la electroforesis.

Gly
Proteinas
CL-

Stacking Gel
pH 6,8

Gly
Proteinas

Resolving Gel
pH 8,8

Tampn de Electroforesis (pH 8,3)

La glicina tiene carga negativa en el tampn de electroforesis a pH 8,3.

Con la aplicacin de un campo elctrico, la glicina, en el

Stacking Gel, se aleja del electrodo negativo.

La glicina empieza a perder su carga a pH 6,8 y ralentiza

su movimiento. Los iones de cloruro avanzan por delante
de la Gly. El aumento de la resistencia, obliga a las protenas a alejarse, de forma apilada, del electrodo negativo.

La glicina, debido a un mayor pH del Resolving Gel, aumenta su carga negativa y se mueve por delante de las
protenas.

Las protenas se separan segn su peso molecular por el

Figura 9. Concentracin de bandas de protenas por el flujo

inico en el sistema discontinuo de Laemmli.

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Anlisis de Protenas

4. Transferencia a una Membrana

Una vez la electroforesis del gel ha terminado, las
protenas se transfieren a una membrana. La
membrana es un soporte slido que une e inmoviliza las protenas, permitiendo as que la hibridacin de un anticuerpo las pueda detectar. La
mayora de los sistemas de transferencia utilizan la
generacin de un campo elctrico para conducir a las protenas desde el electrodo negativo al
positivo. Los sistemas de transferencia estn disponibles en formato semiseco o hmedo. Los sistemas semisecos son ms rpidos y requeiren menor
cantidad de volumen de Tampn que los sistemas hmedos, sin embargo no son apropiados
para transferencia de protenas de gran tamao
(>70 kDa) y pueden causar, segn el sistema de
deteccin, un mayor ruido de fondo. Ambos
mtodos requieren, para una transferencia efectiva de las protenas, un estrecho contacto entre el
gel y la membrana.
Aunque ambas funcionan bien en experimentos
de inmunotransferencia, las diferencias en sus caractersticas puden influir a la hora de la eleccin.
La membrana de PVDF, ofrece una mayor resistencai mecnica, resistencia la SDS y una mayor
unin que la nitrocelulosa. La membrana de nitrocelulosa tiene la ventajas de proporcionar un menor ruido de fondo y que no requieren un pretratamiento con metanol. Recientemente se han
desarrollado, con el objetivo de reducir el ruido
de fondo al utilizar mtodos de deteccin de fluorescencia, membranas PVDF de baja autofluorescencia.
Previamente a la transferencia, tanto el gel como
la membrana se equilibran en una solucin
tampn pre-enfriada. Tpicamente, el tampn de
transferencia contiene Tris, Glicina, SDS (opcional)
y metanos (para membranas de nitrocelulosa). La
figura 10 ilustra como se ensamblan el gel y la
membrana en un transferencia semiseca o hmeda.

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Figura 8. Transferencia de protenas a una membrana.

Nota: Advansta suministra membranas de transferencia pre

-cortadas de nitrocelulosa o PVDF aptas de tamao de minigel. El uso de membranas pre-cortadas permite ahorrar tiempo y elimina la contaminacin accidental de las membranas
con guantes o tijeras contamindas.

Informacin para pedidos

L-08001-010

Membrana PVDF baja fluorescencia 7x9 cm

L-08002-010

Membrana Nitrocelulosa 0,45 m 8x10 cm

L-08003-010

Membrana Nitrocelulosa 0,22 m 8x10 cm

Electroforesis
en Acrilamida
A continuacin se describen algunas sugerencias
para la consecucin exitosa de una transferencia:

Evitar la manipulacin de las membranas con

las manos desnudas. Las protenas y aceites de
la piel pueden adherirse a la membrana y pueden dar lugar a manchas no deseadas en la
membrana.

Las burbujas de aire entre el gel y la membrana pueden causar transferencia defectuosa y
desigual. Se pueden eliminar haciendo rodar
suavemente una pipeta Pasteur por encima
del sndwich formado por el gel/
membrana/papel de filtro.

No permitir un sobrecalentamiento durante la

transferencia. Es aconsejable utilizar tampn
frio, un sistema de refrigeracin o hacer la
transferencia en una cmara fra. Disminuir el
voltaje o el tiempo si fuera necesario.

Ajustar las condiciones de transferencia al tamao de la protena. Las protenas ms pequeas se transferirn ms rpidamente y pueden
atravesar la membrana. Reducir o eliminar el
SDS o utilizar una membrana con un tamao
de poro menor puede ayudar a una mayor
retencin de la protena. Incrementar la cantidad de SDS y disminuir la concentracin de
Metanol pueden facilitar la transferencia de
protenas de gran tamao.

La aparicin de marcadores de tamao preteidos en la membrana es indicacin que se ha

completado la transferencia.

El colorante Ponceau S puede utilizarse para

teir la membrana y asegurarse de la eficacia
de la transferencia. La membrana debe ser
desteida antes del proceso de transferencia.
La tincin con Coomassie puede usarse para
la tincin del gel una vez realziada la transferencia y comprobar los residuos de protena en
el gel.

Bloqueo
El bloqueo de la membrana se lleva a cabo incubando con una solucin diseada para reducir los
lugares de unin no especficos al anticuerpo. A menudo, son soluciones a base de protenas, como la
leche descremada en polvo o la albmina de suero
bovino (BSA). La primera eleccin, cuando se inicia
un nuevo protocolo, es la utilizacin de la leche descremada en polvo, ya que es ms rentable que el
BSA, sin embargo y debido a la presencia de biotina
en las fosfoprotenas, puede que no sea la mejor
eleccin cuando se van a utilizar anticuerpos fosfoespecficos o en mtodos de deteccin de biotina.
Es preferible, para estas y otras situaciones, el uso
de agentes bloqueantes no proteicos.

El agente bloqueante se diluye en TBS (Tampn

Tris salino) o en PBS (Tampn Fosfato salino); se
puede aadir tambin detergente Tween 20.
Una
incubacin
durante
una
hora
(temperatura ambiente o a 4C) suele ser suficiente para un bloqueo de los lugares de unin
no especficos del anticuerpo. Si los niveles del
ruido de fondo son demasiados altos, se pueden seleccionar otras soluciones de bloqueo
alternativas.

Nota: Advansta ofrece soluciones optimizadas de bloqueo

y de lavado para su lnea de reactivos de deteccin, WesternBright, as como soluciones tampn en polvo de PCS, TBS,
...que facilitan una rpida y fcil preparacin

Informacin para pedidos

R-03024-D50

AdvanWashTM, 500 ml

R-03023-D20

AdvanBlockTM-PF, 200 ml

R-01038-020

AvantTM Buffer Pouches - PBS

R-01039-020

AvantTM Buffer Pouches - TBS

Pgina 12

Anlisis de Protenas

5. Hibridacin del Anticuerpo.

Despus del proceso de bloqueo, la membrana
se incuba con el anticuerpo primario. En general,
los anticuerpos reconocen una secuencia de
aminocidos pequea (eptopo) que queda expuesta al eliminar la estructura tridimensional de
la protena en condiciones desnaturalizantes y
reductoras. Los geles nativos se pueden utilizar
cuando los anticuerpos requieren de la protena
plegada para el reconocimiento del antgeno.

Tabla 8. Anticuerpos Policlonales vs Monoclonales.

Anticuerpos Primarios:
Monoclonal vs Policlonal.
En la transferencia Western se pueden utilizar, tanto anticuerpos primarios monoclonales como policlonales. Los dos tipos tienen distintas ventajas y
desventajas y se diferencian segn la forma en la
que se sintetizan. El primer paso en la produccin
de ambos anticuerpos, es la inyeccin de un antgeno en un animal, para provocar una respuesta
inmune. Los anticuerpos policlonales se obtienen
directamente a partir del suero del animal,
comnmente conejo, cabra, burro u oveja y son
finalmente purificados y probados. Los anticuerpos policlonales reconocen mltiples eptopos del
antgeno y en cambio los monoclonales reconocen un nico eptopo de la protena. Para la sntesis de un anticuerpo monoclonal, las clulas que
sintetizan anticuerpos se aslan del bazo del animal y se fusionan con clulas del mieloma. Lo
hibridomas resultantes secretan anticuerpos al
medio de cultivo, el cual se analiza y determina
la afinidad al antgeno. Los hibridomas con secrecin ms estable se seleccionan y pueden ser cultivados indefinidamente. Algunas caractersticas
de los anticuerpos monoclonales y policlonales se
describen en la Tabla 8.

Pgina 13

Anticuerpos
Monoclonales

Anticuerpos
Policlonales

Reconocimiento
epitopo y
sensibilidad

Reconocimiento
de un nico eptopo
Menos sensibilidad debido a
que slo un anticuerpo se une a
cada protena

Reconocimiento
mltiples eptopos
en una protena
Ms sensible debido a los multiples
lugares de unin
de anticuerpo en
cada protena.
Bueno para protenas poco abundantes.

Reactividad cruzada potencial

Reactividad cruzada menos

probable.
Potencial para
reconocer otras
protenas que
contengan el
eptopo.

Reactividad cruzada ms probable.

Mayor ruido de
fondo potencial
debido al reconocimiento de multiples eptopos.
Reactividad cruzada con otras especies ms probable.

Tiempo requerido
para su produccin

Largo

Ms corto

Coste de Preparacin

Mayor coste - reMenor coste

quiere personal
capacitado y equipamiento especializado.

Variabilidad

Los lotes de un mismo hibridoma son

muy estables.

Tolerancia a condiciones variables

Poca tolerancia Ms tolerante a conpuede dejar de

diciones variables.
reconocer al antgeno en condiciones de desnaturalizacin/reduccin
de la protena, o
por modificaciones
qumicas
(glicosilacin fosforilacin) o por diferencias en la secuencia peptdica
debido a la presencia de polimorfismos.

Propenso a cierta
variabilidad entre
lotes.

Hibridacin
Anticuerpos
Incubacin de los anticuerpos
El anticuerpo primario se diluye en tampn de
bloqueo, TBST o en un tampn de disolucin de
anticuerpo comercial. El fabricante puede recomendar una cantidad inicial, pero a menudo la
concentracin ptima de anticuerpo debe determinarse empricamente. La afinidad del anticuerpo, la abundancia de la protena en la muestra y
la sensibilidad del sistema de deteccin afectarn a la cantidad de anticuerpo a utilizar.

Generalmente, un periodo de incubacin

de 1 hora a temperatura ambiente suele ser
suficiente. Tambin es posible una incubacin a 4C durante toda la noche.

Durante la incubacin, la membrana debe

someterse a agitacin suave y sumergida en
la disolucin, e incubar en un agitador de
vaivn. Un menor volumen puede utilizarse si
la membrana se sella dentro de una bolsa e
incuba en un agitador orbital.

En algunos casos, la disolucin con el anticuerpo, puede reutilizarse. Si se utiliza acida

sdica como conservante, debe ser totalmente lavada de la membrana, ya que
puede eliminar la actividad de la peroxidasa
e interferir en los mtodos de deteccin.

Despus de la incubacin con el anticuerpo primario, se procede a la eliminacin del excedente

mediante tampones de lavado (TBS, PBS, TBST o
PBST). En mtodos de deteccin indirectos
(seccin 6), es necesario un anticuerpo secundario apropiado. A continuacin se describen las
consideraciones a tener en cuenta a la hora de la
eleccin de un anticuerpo secundario:

Las especie del primer Ac dicta la eleccin

del Ac secundario. Si el primer Ac es de conejo, el segundo Ac debe ser anti-conejo, o
sea, deber ser producido en otra especie
distinta a conejo.

Para anticuerpos monoclonales se debe

considerar la clase de Inmunoglobulina (IgG,
IgM, IgA, IgD, IgE) y posiblemente la subclase
(IgG1, IgG2a,). Un anticuerpo con amplia
especificidad inmunoglobulnica debera ser
suficiente, ya que los anticuerpos especficos
para sub-clases se utilian mayoritariamente,
en experimentos de doble etiquetado u
otras aplicaciones.

Nota: Advansta ofrece una lnea completa de anticuerpos

secundarios marcados para deteccin mediante quimioluminscencia o fluorecencia.

Informacin para pedidos

R-05051-050

IgG conjugado APC-cabra-anti-conejo, 50 l

R-05051-250

IgG conjugado APC-cabra-anti-conejo, 250 l

R-05052-050

IgG conjugado RPE-cabra-anti-ratn, 50 l

R-05051-250

IgG conjugado RPE-cabra-anti-ratn, 250 l

R-05071-500

Anticuerpo Secundario conjugado HRP

cabra-anti-ratn, 500 l

R-05072-500

Anticuerpo Secundario conjugado APC

cabra-anti-conejo, 500 l

Pgina 14

Anlisis de Protenas

6. Deteccin.
La deteccin de la protena se puede hacer mediante mtodos directos o indirectos, cada uno
con sus ventajas e inconvenientes. Los mtodos
directos utilizan un anticuerpo primario conjugado con un marcaje detectable, como un enzima,
biotina o molcula fluorescente. Los anticuerpos
se pueden marcar mediante kits disponibles en le
mercado u obtenerlos ya marcados. Lo mtodos
indirectos utilizan dos anticuerpos; un anticuerpo
primario y un anticuerpo secundario contra la especie del primer anticuerpo. En la deteccin indirecta, es el anticuerpo secundario el que est
conjugado con un marcaje detectable. La figura
11,ilustra los mtodos de deteccin directos e indirectos y en la Tabla 9 se resumen las ventajas e
inconvenientes de los dos mtodos.
Mtodos de deteccin.
Los mtodos ms comnmente utilizados para
detectar protenas son: 1. Quimioluminiscencia, 2.
Fluorescencia y 3. Colorimetra.

Figura 11 . Deteccin directa e indirecta de protenas

Tabla 9. Ventajas e Inconvenientes de los mtodos de deteccin
Indirecto
Ventajas

Amplificacin de Menos pasos.

seal debido a la Menos posibilidaunin de mltides de unin no
ples Ac secundaespecfica.
rios a cada Ac
primario.
Verstil - el mismo Ac secundario puede utilizarse para diversos
anticuerpos de
la misma especie.

Inconvenientes

Mayor posibilidad de unin no

inespecfica.
Ms pasos.

1. Quimioluminiscencia.
Los mtodos de deteccin de quimioluminiscencia utilizan comnmente anticuerpos secundarios
conjugados con peroxidasa (HRP). La reaccin
entre el encima y el substrato produce luz, que
puede ser detectada mediante la exposicin de
la membrana a una pelcula de rayos X o captada de forma digital utilizando una cmara CCD.

Directo

Ventajas: muy sensible, la membrana puede tratarse para re-utilizarse, se pueden hacer multiples
exposiciones en pelculas de rayos X, fcil de documentar.

Puede ser ms
costoso.
La inmunorreactividad del Anticuerpo puede estar
afectada por el
marcaje.

Inconvenientes: requiere una habitacin oscura

(pelcula rayos X) o sistemas de imagen caros, semicuantitativa - porque se basa en una reaccin
enzimtica, la pelcula tiene un rango dinmico
limitado, la intensidad de la seal puede variar
con la incubacin o el tiempo de exposicin, no
son posibles detecciones multiplex (deteccin de
mas de una protena, slo un color de reaccin)

Nota:

LucentBlueTM es una pelcula que ha sido optimizada para

la deteccin de seales de quimioluminiscencia en experimentos

realizados con los substratos WesternBright HRP, incluyedo WesternBrightTM ECL, Westernbright Quantum y WesternBright Sirius.

Pgina 15

Informacin para pedidos

L07014-100

Pelcula Rayos X LucentBlueTM , 20x25 cm, 100 uds

L07013-100

Pelcula Rayos X LucentBlueTM , 13x18 cm, 100 uds

Deteccin

2. Fluorescencia.

Re-utilizacin de la membrana

El anticuerpo secundario se une a un fluorforo,

que cuando es excitado emite luz. La luz emitida, se detecta mediante un dispositivo capaz de
medir la fluorescencia o mediante una cmara
CCD provista con los filtros de longitud de onda
apropiada. La imagen se digitaliza para su anlisis.

Despus de captar la imagen, la membrana puede ser tratada para volver a ser utilizada para la
deteccin de otra protena. Este procedimiento
puede conservar las muestras, pero consume mucho tiempo. Con la deteccin multiplex de fluorescencia, se pueden detectar mltiples protenas
de forma simultanea, es ideal para comparar la
protena de inters con un control de carga, o
diferentes isoformas de la protena. Las membranas PVDF son preferibles a la de nitrocelulosa en
protocolos de lavados para reutilizacin.

Ventajas: sensibilidad (la sensibilidad puede incrementarse utilizando el sistema streptavidina/

biotina), apto para ensayos multiplex con mltiples colorantes, amplio rango dinmico, no se
requiere el uso de una cmara oscura, aporta
datas cuantificables, fcil documentacin de resultados, pueden usarse Ac primarios marcados
(para protenas abundantes) y eliminar pasos.
Inconvenientes: los reactivos y el equipamiento
pueden ser costosos, no es tan sensible como la
quimioluminiscencia (puede no ser apropiado
para protenas poco abundantes).
3. Colorimetra.
Los mtodos colorimtricos utilizan un Ac secundario que ha sido conjugado previamente a un
enzima (peroxidasa o fosfatasa alcalina). El enzima convierte el colorante en un producto insoluble que es visible en la membrana. La cantidad
de colorante convertido es proporcional al cantidad en la muestra. La intensidad de la tincin
puede ser medida por espectrofotometra o por
un densitmetro.
Ventajas: sencilla de realizar, no requiere cmara
oscura, las membranas se pueden documentar
fcilmente mediante fotografa.
Inconvenientes: no es tan sensible como los otros
dos mtodos, el color se desvanece con el tiempo.

Nota: WesternBright

TM

MCF permite la deteccin, mediante la

deteccin fluorescente multicolor, de dos protenas en una

sola membrana. Perfecto para aquellos experimentos en los
que se necesite comparar la protena de inters con un control
de carga.

Informacin para pedidos

K-12021-010 WesternBrightTM fluorescent Western blotting kit

Nota: Advansta suministra una lnea completa de reactivos

de deteccin de quimioluminiscencia optimizados para los
diferenentes mtodos, concentracin de muestra y tipos experimentales.

Informacin para pedidos

K-12042-D10

WesternBrightTM Quantum Western Blotting HRP

Substrate (para 1000 cm2 de membrana)

K-12042-D10

WesternBrightTM Sirius Western Blotting HRP Substrate (para 1000 cm2 de membrana)

K-12045-D20

WesternBrightTM ECL Western Blotting HRP Substrate (para 2000 cm2 de membrana)

K-12042-D10

WesternBrightTM ECL Spray

Pgina 16

Anlisis de Protenas

7. Solucin de Problemas

Solucin de problemas con Western Blot

A. No se puede
ver la protena
de inters

B. Tamao incorrecto de la
banda

Preparacin
Muestra
(ver 1)

La protena es
menor de lo
esperado
(ver 7)

Transferencia
Inadecuada
(ver 2)

Unin ineficiente del Anticuerpo (ver 3, 4)

Problemas con
los reactivos
(ver 5, 6)

La protena es
mayor a lo esperado
(ver 8, 9)

C. Bandas artefactuales

D. Problemas en
la electroforesis

E. Ruido de fondo excesivo

Bandas
Incompletas
(ver 12)

El gel polimeriza
demasiado
rpido o demasiado lento
(ver 17,18,19)

Bloqueo
Insuficiente
(ver 24)

Bandas Difusas
(ver 13)

Rayas
Verticales
(ver 14)
Bandas Mltiples (ver 10)

Las bandas
aparecen muy
altas o muy
bajas en el gel
(ver 11)

El gel corre demasiado rpido

o demasiado
lento
(ver 20,21)

Distorsin
Lateral
(ver 15)

Frente corre
curvado
smiling
(ver 22)

Bandas distorsionadas
(ver 16)

Frente corre
inclinado
(ver 23)

Lavado
inapropiado
(ver 25)

Contaminacin
Reactivos
(ver 26)

Eleccin de
Membrana
(ver 27)

Unin no especfica del

Anticuerpo
(ver 28)

Revelado de la
pelcula
(ver 29)

Pgina 17

Solucin de
Problemas
A. Problema

Causa(s)

Solucin

1. Preparacin Muestra

Extraccin ineficiente

Intentar mtodos alternativos; incluir control positivo en el gel

Baja expresin de la protena en el tejido

o las clulas

Cargar ms cantidad de protena total en

el gel; concentrar utilizando Afyon, juntar
mltiples muestras

La protena se ha degradado durante la

extraccin

Usar inhibidores de proteasa en le tampn

de lisis

2. Transferencia indadecuada

3. Unin ineficiente del Anticuerpo primario

Tampn de transferencia preparado inco- Revisar el protocolo/disminuir metanol

rrectamente/demasiado metanol en el
tampn
Protenas de mayor tamao necesitan
mas tiempo/voltaje

Repetir con un tiempo mayor/mayor voltaje

Contacto insuficiente entre el gel y la

membrana

Revisar la almohadilla de fibra; sustituir si es

muy delgada

Baja afinidad del anticuerpo por la prote- Incrementar la concentracin del Antina o el anticuerpo es antiguo/dbil
cuerpo; comprar un anticuerpo nuevo y
almacenarlo de forma apropiada
El Anticuerpo tiene reactividad cruzada
dbil con las especies de inters

Probar con un Anticuerpo primario de diferente origen

El Anrticuerpo se ha eliminado con el lava- Usar menor numero de lavados; disminuir

do
la concentracin de sales el tampn de
lavado

4. Unin ineficiente del Anticuerpo secundario

Antgeno enmascarado por el agente

bloqueante (ej.: Leche,)

Utilizar un agente de bloqueo alternativo

(ej.: BSA,)

Eleccin de especies errnea

Usar Anticuerpos dirigidos contra la especie del Anticuerpo primario

Concentracin insuficiente del Anticuerpo Aumentar concentracin o comprar uno

o Anticuerpo antiguo
Anticuerpo nuevo
5. Conjugado/Substrato Inac- Reactivos viejos o inestables
tivo
Peroxidasa (HRP) inactiva por azida sdica

Mezclar conjugado + substrato en un tubo; o luminiscencia en oscuridad - conseguir un nuevo reactivo si no hay seal
Evitar utilizar disoluciones conteniendo
este agente conservante

6. Reactivo de deteccin
(ECL)

La disolucin es antigua o est almacena- Comprar reactivo nuevo

da de forma inapropiada

B. Problema

Causa (s)

Solucin

7. Protena ms pequea de
lo esperado

Protelisis; Congelacin/descongelacin
de la muestra

Uso de inhibidores de proteasa/muestras

frescas

Protena variante (Splicing)

Consultar literatura/utilizar controles apropiados

Protenas modificadas de forma natural

(glicosilacin, fosforilacin, acetilacin,
etc)

Consultar literatura para encontrar aditivos que puedan eliminar grupos qumicos

Cambio de la expresin de la protena en

la lnea celular

Utilizar cultivos anteriores; incluir un control

positivo

8. Protena ms larga de lo
esperado y/o bandas mltiples

9. Protena ms larga de lo
esperado

Agregado de protenas - puentes disulfuro Uso de DTT en tampn de muestra; pulso

intactos
de centrfuga previo a la carga de la
muestra
Pgina 18

Anlisis de Protenas

B. Problema
(continuacin)

Causa(s)

Solucin

10. Bandas Extras

Unin no especfica del Anticuerpo prima- Disminuir concentraciones; intentar un

rio o secundario
experimento de bloqueo de pptido
(eliminar la protena de inters)

11. La protena aparece muy Porcentaje errneo/no ptimo del gel

alta o muy baja en la membrana

Incrementar el porcentaje para protenas

de pequeo tamao; disminuir para protenas de gran tamao

C. Problema

Causa(s)

Solucin

12. Bandas Incompletas

Burbujas entre el gel y la membrana

Usando una pipeta, hacer rodar por encima del paquete gel/membrana para forzar la salida de las burbujas

13. Bandas difusas

Migracin lenta

Incrementar voltaje; asegurarse de la correcta preparacin del tampn

Las muestras no se han calentado correctamente

Asegurarse que las muestras se han incubado durante 2 min a 90C antes de cargarlas en el gel

El SDS del tampn es antiguo

Preparar SDS nuevo para le tampn de

muestra

14. Rayas en los carriles

Alta concentracin de sales en la muestra Disminuir la concentracin de sal en el

tampn de muestra
Muestra muy concentrada o insuficiente
SDS

Incrementar concentracin/usar ms SDS

15. Distorsin lateral de las

bandas

Difusin de la muestra en los pocillos durante la carga

Minimizar el tiempo de carga

16. Distorsin de las bandas

Fallo en la completa polimerizacin de los Incrementar TEMED/AP

pocillos
Presin aplicada excesiva a la hora de
montar el gel

No apretar en exceso los tornillos del sistema, apretar hasta encontrar primera resistencia

Burbujas en el gel debido al uso de cristales sucios

Usar guantes en la preparacin de los geles

Uso de Etanol y H2O desionizada en la limpieza de los cristales

Burbujas introducidas en el gel por el dispositivo de llenado (jeringa o pipeta)

No expulsar totalmente el volumen de la

mezcla del gel

Burbujas de aire atrapadas por el peine

Insertar el peine en ngulo y antes que se

polimerice el gel

D. Problema

Causa (s)

Solucin

17. El gel no polimeriza

Fallo al aadir el TEMED y AP

Repetir con TEMED y AP

La disolucin AP es estable durante dos o

tres das a 4C

Preparar AP fresco

El oxgeno inhibe la polimerizacin

Aplicar isopropanol antes de verter el gel

de apilamiento (stacking gel)

TEMED/AP Insuficiente

Incrementar la cantidad de TEMED/AP

La disolucin de AP ha perdido su actividad

Preparar disolucin fresca de AP

18. El gel polimeriza muy lento

Pgina 19

Solucin de
Problemas
D. Problema
(continuacin)

Causa(s)

Solucin

19. El polimeriza demasiado

rpido

Cantidad excesiva de TEMED/AP

Reducir la cantidad de TEMED/AP, manteniendo la relacin entre ambos

20. Tiempo de carrera inusualmente largo

Buffer de electroforesis demasiado concentrado

Revisar protocolo; diluir el tampn en caso

necesario

Voltaje insuficiente

Incrementar voltaje

21. Tiempo de carrera inusualmente corto

Tampn demasiado diluido

Revisar el protocolo; reemplazar tampn

en caso necesario

22. Frente curvado (smiling)

Migracin demasiado rpida

Disminuir voltaje

Generacin de calor

Disminuir voltaje; refrigerar

23. Frente inclinado

Burbuja atrapada entre los cristales en la

parte inferior del gel

Aguantar el gel en ngulo; colocar una

esquina en el tanque inferior del sistema
de electroforesis; lentamente volver a posicin vertical

E. Problema

Causa(s)

Solucin

24. Bloqueo insuficiente

La presencia de Biotina en la leche es incompatible con el uso de Estreptavidina,

o la leche contiene el antgeno de inters

Usar BSA

Si utiliza AdvanBlock-PF con WesternBright

MCF, algn Anticuerpo primario puede
requerir un bloqueante proteico

Incluir BSA o leche en la disolucin AdvanBlock-PF utilizada en la dilucin del Anticuerpo primario

La disolucin est demasiado diluida

Incrementar con un 5% la disolucin

Tiempo de bloqueo muy corto

Incrementar el tiempo de incubacin

Algunos detergentes no son efectivos a

bajas temperaturas

Incubar a temperatura ambiente en vez

de toda la noche a 4C

Nmero insuficiente de lavados

Incrementar el nmero de lavados o la

duracin de cada uno de ellos

25. Condiciones de lavado

inapropiadas

Concentracin insuficiente de detergente Incrementar la concentracin de detergente o usar detergentes ms fuertes

(SDS, NP-40)
26. Contaminacin de los
reactivos

Crecimiento bacteriano o fngico en los

tampones

27. Eleccin de tipo de mem- Las membranas PVDF pueden tener ms

brana
ruido de fondo que las de Nitrocelulosa

28. Unin no especfica del

Anticuerpo primario o secundario

29. Sobreexposicin de la
imagen

Revisar la turbidez de los tampones; preparar nuevos

Elegir membranas de Nitrocelulosa

Algunas membranas tienen alta autofluorescencia

Utilizar nicamente membranas PVDF con

baja autofluorescencia con Western Blots
fluorescentes

Membrana seca

Estar seguro que la membrana esta hmeda durante todo el proceso

Concentracin muy alta del Anticuerpo o

no purificado por afinidad

Disminuir la concentracin de Anticuerpo;

intentar con Anticuerpo monoclonal o
purificado por afinidad

Mucha cantidad de protena en el gel

Disminuir la cantidad de protena

El tiempo excesivo de exposicin a la pel- Reducir los tiempos de exposicin; si no es

cula o al CCD
posible incrementar la dilucin de los Anticuerpos o cargar menor cantidad de
muestra

Pgina 20

Anlisis de Protenas

8. Herramientas y Referencias Tcnicas

g de Soluto
Molaridad de una disolucin =
[Masa molecular de Soluto (g/mol) x (L de disolucin)
Tabla 10. Cdigo gentico y abreviaciones de los aminocidos

Segunda Posicin
U

Primera posicin

UUU
UUC

Fenilalanina
(Phe, F)

UUA
UUG

Leucina
(Leu, L)

CUU
CUC
CUA
CUG

Leucina
(Leu, L)

AUU
AUC
AUA

Isoleucina
(Ile, I)

AUG

Metionina
(Met, M)

GUU
GUC
GUA
GUG

Valina
(Val, V)

UCU
UCC
UCA
UCG

Serina
(Ser, S)

CCU
CCC
CCA
CCG

Prolina
(Pro, P)

ACU
ACC
ACA
ACG

Treonina
(Thr, T)

GCU
GCC
GCA
GCG

Alanina
(Ala, A)

UAU
UAC

Tirosina
(Tyr, T)

UGU
UGC

Cisteina
(Cys, C)

UAA
UAG

STOP

UGA

STOP

UGG

Triptfano
(Trp, W)

CAU
CAC

Histidina
(His, H)

CGU
CGC
CGA
CGG

Arginina
(Arg, R)

CAA
CAG

Glutamina
(Gln, Q)

AAU
AAC

Asparagina
(Asn, N)

AGU
AGC

Serina
(Ser, S)

AAA
AAG

Lisina
(Lys, K)

AGA
AGG

Arginina
(Arg, R)

GAU
GAC

A. Asprtico
(Asp, D)

Glicina
(Gly, G)

GAA
GAG

A. Glutmico
(Glu, E)

GGU
GGC
GGA
GGG

Tabla 11. Conversin entre masa y moles de protena

Tabla 12. Absorvancia a 280 nm de Proteinas habituale

Peso molecular
(Da)

1 g

1 nmol

Proteina

10.000

100 pmol o 6x1013 molculas

10 g

IgG

1,35

20.000

20 pmol o

1,2x1013

50 g

IgM

1,2

100.000

10 pmol o 6x1012 molculas

100 g

IgA

1,3

150.000

6,7 pmol o 4x1012 molculas

150 g

Proteina A

0,17

Avidina

1,5

Estreptavidina

3.4

Albumina suero bovino

0,7

Pgina 21

molculas

A280 Uds por 1 mg&ml

Herramientas y
Referencias
Tabla 13. Prefijos mtricos
mega

106

Kilo

103

mili

10-3

micro

10-6

Tabla 16. Masa molecular media de los aminocidos

nano

10-9

Cdigos Aminocidos

pico

10-12

Ala

71,08

femto

10-15

Cys

103,1

atto

10-18

Asp

115,1

Glu

129,1

Tabla 14. Abreviaciones

Phe

147,2

ds

doble cadena ( como en dsDNA)

Gly

57,05

ss

cadena sencilla (como en ssDNA)

His

137,1

bp

pares de base

Ile

113,2

kb

kilobase; 1.000 bases o pares de base

Lys

128,2

Da

Dalton, unidad de masa molecular

Leu

113,2

mol

mol

Met

131,2

molaridad, moles de soluto por litro de disolucin

Asn

114,1

Peo

91,12

n
K
f
a

Masa molecular media

Gln

128,1

Tabla 15.. Vida media de los Radioistopos ms habituales

Arg

156,2

Radioistopo

Vida media

Ser

87,08

Carbono-14 (14C)

5.730 aos

Thr

101,1

Iodo-125 (125I)

60 das

Val

99,07

Fsforo-32 (32P)

14,3 das

Trp

186,2

Azufre-35 (35S)

87,4 das

Tyr

163,2

Tritio (3H)

12,4 aos

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