Documentos de Académico
Documentos de Profesional
Documentos de Cultura
ISBN 978-607-7908-62-3
Impreso y hecho en Mxico Printed in Mexico
ndice
Agradecimientos
Prlogo
9
11
Introduccin
13
19
47
Adriana Palafox Alejo, ngel Hctor Hernndez Romero, Jaime Lpez Luna,
Mara del Carmen Cuevas Daz
87
107
127
Agradecimientos
10
Prlogo
Ania Mendoza Cant
que ya se encuentran afectados o para evaluar los impactos de los derrames que
eventualmente se produzcan. Las pruebas de toxicidad (bioensayos y biomarcadores) son herramientas que nos permiten caracterizar dichos impactos y tambin
evaluar la eficiencia de los mtodos de remediacin. El presente libro busca, por
tanto, brindar a los investigadores, estudiantes y profesionistas involucrados en
estas tareas, procedimientos detallados para realizar esas pruebas en algunos de los
organismos o las especies ms utilizadas con esos fines en Mxico y en el mundo.
Este libro est integrado por cuatro captulos en los que se describen cuidadosamente los protocolos para llevar a cabo las pruebas con organismos representativos de diferentes niveles dentro de la red alimenticia de los ecosistemas terrestres.
En cada uno de ellos se detalla su campo de aplicacin; los materiales, reactivos
y soluciones necesarios; el procedimiento de prueba, paso por paso; y los clculos
para evaluar los resultados. Asimismo, se incluye un quinto captulo con recomendaciones generales sobre el aseguramiento y el control de calidad de las pruebas, un
aspecto fundamental para obtener resultados confiables y comparables.
Este es un libro que rene la experiencia alcanzada por varios investigadores
mexicanos tras varios aos de aplicar estas pruebas, y es una de las pocas publicaciones en espaol enfocada a la aplicacin de las pruebas de toxicidad especficamente en suelos contaminados con hidrocarburos.
12
Introduccin
Mara del Carmen Cuevas Daz y
ngeles Martnez Toledo
En el estudio de las ciencias ambientales se reconoce que las sustancias forman parte
integral del planeta Tierra. Desde los primeros tiempos, el hombre ha dependido de
los recursos que la naturaleza le proporciona, desde los minerales hasta las sustancias
obtenidas de plantas y animales. No obstante, el avance cientfico y tecnolgico, aunado al rpido crecimiento poblacional, al desarrollo agrcola e industrial acelerado y a
los cambios en los estilos de vida, lo han llevado a buscar nuevas fuentes de recursos
y a producir sustancias sintticas, incluso totalmente desconocidas para la naturaleza
(Theodorakis et al., 1998; Staniskiene et al., 2006; Zheng et al., 2007).
Actualmente es difcil concebir alguna actividad en la sociedad moderna en
la cual no intervenga o haya intervenido el uso de combustibles y de una gran
variedad de productos qumicos naturales y sintticos, tanto en el hogar como en
los lugares de trabajo e incluso en las actividades de recreacin. De ah que se
considere que numerosas sustancias son o han sido la base del progreso, y que su
aprovechamiento en una gran variedad de procesos productivos sea identificado
como un factor que genera desarrollo, ingreso y empleo para millones de personas.
Sin embargo, este proceso no solo ha trado beneficios, sino tambin importantes
problemas ambientales derivados del manejo de las sustancias peligrosas y del incremento en la generacin de residuos y emisiones contaminantes que afectan a
los ecosistemas y a la propia humanidad.
Las sustancias pueden ocasionar distintos efectos adversos; algunos de los ms
conocidos son los siguientes (Yarto et al., 2007):
13
Envenenamientos y enfermedades diversas que se presentan tanto en los humanos como en especies de la flora y la fauna.
Daos a los materiales que entran en contacto con ellas.
Deterioro de la calidad de los diferentes compartimentos del ambiente (aire,
agua, suelo, sedimento y alimentos).
Accidentes que involucran explosiones, incendios, fugas o derrames.
Hasta principios de la dcada de 1970 se pensaba que la contaminacin era
un fenmeno circunscrito a las zonas donde se generaban los contaminantes. Por
ello, en cada pas la preocupacin se limitaba a las regiones ms contaminadas.
Sin embargo, poco a poco se ha cobrado conciencia de que la contaminacin es
un problema que afecta a todos y que, por lo mismo, su control es responsabilidad
de todos. Por lo tanto, el problema de la contaminacin se ha vuelto un fenmeno
global (Flores, 2004), al cual Mxico no es ajeno.
En Mxico, al igual que en el resto del mundo, las principales actividades productivas, como la minera, la extraccin y la refinacin del petrleo, la petroqumica
y la industria qumica bsica, han trado sin duda grandes beneficios econmicos;
sin embargo, al mismo tiempo han ocasionado graves problemas ambientales
(Volke y Velasco, 2002). Entre ellos, la generacin de grandes cantidades de desechos y residuos peligrosos y la incidencia de fugas, derrames y accidentes qumicos han incrementado el nmero de sitios contaminados. En nuestro pas no
existe un registro cabal de todos estos sitios; no obstante, las estimaciones ms
conservadoras registran un nmero de varios miles, la mayora de los cuales no han
sido suficientemente caracterizados para identificar el riesgo que representan para
los ecosistemas y la poblacin humana (Cortinas de Nava, 2000). De acuerdo
con datos publicados por el Instituto Nacional de Estadstica y Geografa (INEGI,
2000), la superficie de suelo degradado por causas atribuibles a la contaminacin
fue de 25 967 km2 en 1999.
Con respecto a los sitios industriales o de disposicin de residuos registrados en
2009, se detectaron 11 sitios contaminados con hidrocarburos en Veracruz, 5 en
Tamaulipas y 8 en Oaxaca (SEMARNAT, 2010). Por su parte, en referencia a las
emergencias ambientales, Sarmiento et al. (2003) reportan que en el periodo de
1993 a 2003 se present en Mxico un promedio de 521 emergencias asociadas
con materiales y residuos peligrosos. Dentro de los compuestos peligrosos ms comnmente involucrados se identificaron el petrleo, con el 42.1 % y sus derivados,
14
con el 20.02 % (gasolinas, combustleo, disel); el gas licuado del petrleo, con el
3.19 %, el natural, con el 2.30 %, y otras sustancias que constituyeron el 27.71
%. Estas estadsticas muestran la magnitud de los impactos ocasionados por los
hidrocarburos.
Varios autores han desarrollado diversas investigaciones sobre los efectos de
distintos tipos de hidrocarburos (hidrocarburos aromticos, compuestos orgnicos
voltiles, hidrocarburos halogenados, dioxinas y furanos, etc.) sobre los compartimentos ambientales y sobre la salud de los seres humanos y la biota (Castellas
et al., 1995; Ekundayo et al., 2001; Bostrm et al., 2002; Timmerman et al.,
2003). Con respecto a los compartimentos ambientales, se ha encontrado que el
suelo es particularmente vulnerable a estos compuestos, ya que su presencia puede afectar las funciones edficas, ya sea al alterar negativamente sus propiedades
fsicas y qumicas o al daar sus procesos biolgicos y ecolgicos, como son los
ciclos de nutrientes, los flujos de energa o las interacciones entre organismos. En
relacin con los efectos sobre los organismos, los estudios han mostrado que los
hidrocarburos ejercen una accin txica variada, la cual depende principalmente de
la concentracin y la frecuencia de la exposicin (ATSDR, 1995 y 1998). Estos
contaminantes ejercen su accin txica sobre los sistemas respiratorio, endcrino,
nervioso central, digestivo, inmunolgico y reproductivo de los seres vivos, con
efectos directos sobre los rganos encargados de las funciones principales en tales
sistemas (Klaassen, 2001; Albert, 2006).
Ante esta problemtica, es necesario evaluar la salud de los ecosistemas a travs de herramientas de monitoreo. Una de estas herramientas la constituye el uso
de bioensayos y biomarcadores, los cuales no solo permiten determinar el grado de
contaminacin inicial en un sitio, sino tambin evaluar la eficiencia de las medidas
de remediacin emprendidas para sanearlo.
Los bioensayos, tambin llamados pruebas de toxicidad, y los biomarcadores
han sido ampliamente utilizados en el campo de la ecotoxicologa, la cual se ocupa
del estudio del efecto y el destino de los agentes txicos en los ecosistemas acuticos y terrestres (Larrain, 1995). Se usan como una medida de las respuestas biolgicas que permiten estimar la presencia o la concentracin de las sustancias txicas
(Suter, 2007) en el medioambiente. Adems, son herramientas tiles para la evaluacin de riesgos ecolgicos debido a que permiten llevar a cabo diversas acciones:
demostrar que los contaminantes estn biodisponibles; caracterizar el efecto txico
que producen los contaminantes (por ejemplo, una reduccin de la supervivencia,
el crecimiento o la reproduccin, o una alteracin en el comportamiento); caracteI ntroduccin
15
16
Referencias
Agency for Toxic Substances and Disease Registry (ATSDR). 1995. Toxicological profile
for polycyclic aromatic hydrocarbons. US Department of Health and Human Services.
Public Health Service, EUA.
Agency for Toxic Substances and Disease Registry (ATSDR). 1998. Toxicological profile
for chlorinated dibenzo-p-dioxins. US Department of Health and Human Services. Public Health Service. EUA.
Albert, L. 2006. Curso bsico de toxicologa ambiental. Captulos 4 y 5. Centro Panamericano de Ecologa Humana y Salud, Organizacin Panamericana de la Salud, Organizacin Mundial de la Salud. Editorial Limusa. Mxico.
Bostrm, C.E., Gerde, P., Hanberg, A., Jernstrm, B., Johansson, C., Kyklund, T., Rannug, A.,
Trnqvist, M., Victorin, K., Westerholm, R. 2002. Cancer risk assessment, indicators,
and guidelines for polycyclic aromatic hydrocarbons in the ambient air. Environmental
Health Perspectives. 110 (Supl. 3), 451-489.
Castellas, M., Fernndez, P., Bayona, J.M., Solanas, A. M. 1995. Bioassay-directed chemical analysis of genotoxic components in urban airborne particulate matter from Barcelona (Spain). Chemosphere. 30, 725-740.
Cortinas de Nava, C. 2000. Comunicacin de Riesgos para el Manejo de Sustancias Peligrosas con nfasis en Residuos Peligrosos. Instituto Nacional de Ecologa, Secretaria
de Medio Ambiente y Recursos Naturales, Mxico.
Ekundayo, E.O., Emede, T.O., Osayande, D.I. 2001. Effects of crude oil spillage on growth
and yield of maize (Zea mays L.) in soil of Midwestern Nigeria. Plant Food and Human Nutrition. 56, 313-324.
Flores, J. 2004. Efectos globales de la contaminacin. En: L. Albert (editora). Toxicologa Ambiental. Universidad Autnoma de Ciudad Jurez. Ciudad Jurez, Chihuahua,
Mxico.
Fox, G.A. 2001. Wildlife as sentinels of human health effects in the Great LakesSt.
Lawrence Basin. Environmental Health Perspectives. 109, 853-861.
Instituto Nacional de Estadstica, Geografa e Informtica (INEGI) e Instituto Nacional de
Ecologa (INE). 2000. Indicadores de Desarrollo Sustentable en Mxico. Mxico.
Klaassen, C.D. 2001. Casarett and Doulls: Toxicology the basic science of poisons. Captulos 2 y 4. Sexta edicin. McGraw-Hill. EUA.
Larrain, A. 1995. Criterios ecotoxicolgicos para evaluar alteraciones ambientales y establecer parmetros de control: importancia de los bioensayos de toxicidad. Ciencia y
Tecnologa del Mar. Volumen especial, 39-47.
I ntroduccin
17
Sarmiento, M.R., Ortiz E., lvarez, J. 2003. Emergencias ambientales asociadas a sustancias qumicas en Mxico. Gaceta ecolgica. 66, 54-63
Secretara de Medio Ambiente y Recursos Naturales (SEMARNAT). 2010. Contaminacin y remediacin anual de sitios afectados por emergencias ambientales. Base de
datos estadsticos del Sistema Nacional de Informacin Ambiental y Recursos Naturales (SNIARN).. Consultado en agosto de 2010.
Staniskiene, B., Matosevicius, P., Budreckiene, R., Skibniewska, K. A. 2006. Distribution of
heavy metals in tissues of freshwater fish in Lithuania. Polish Journal of Environmental
Studies.15, 585-501
Suter, G.W.II. 2007. Ecological risk assessment. Segunda edicin. CRC Press. Florida,
EUA.
Theodorakis, C.W., Bickham, J.W., Elbl, T., Shugart, L.R., Chesser, R.K. 1998. Genetics
of radionuclide-contaminated mosquitofish populations and homology between Gambusia affinis and G. holbrooki. Environmental Toxicology and Chemistry.10, 19921998.
Timmerman, M.D., Fuller, L.G., Burton, D.L. 2003. The effects of a crude oil spill on microbiological indices of soil biological quality. Canadian Journal of Soil Science. 83,
155-165.
United States Environmental Protection Agency (USEPA). 1994. Using toxicity tests in
ecological risk assessment. Bulletin ECO. 2, 1-6.
Volke, T., Velasco, J.A. 2002. Tecnologas de remediacin para suelos contaminados.
Instituto Nacional de Ecologa, Secretara de Medio Ambiente y Recursos Naturales.
Mxico.
Yarto, M., Ize, I., Gaviln, A. 2007. El Universo de las sustancias qumicas peligrosas y su
regulacin para un manejo adecuado. Instituto Nacional de Ecologa, Secretara de
Medio Ambiente y Recursos Naturales. Mxico. http://www2.ine.gob.mx/publicaciones/gacetas/422/universo.html. Consultado en abril de 2010.
Zheng, Z., Li, H., Jin, L., Zhen-bin, W. 2007. Analysis of heavy metals of muscle and intestine tissue in fish in Banan Section of Chongqing from three gorges reservoir, China.
Polish Journal of Environmental Studies. 16, 949-958.
18
Introduccin
La calidad y la salud de los suelos se miden a travs de distintos indicadores que
evalan su funcionamiento (Doran et al., 1999). Para medir la calidad, se considera qu tan adecuadas son sus propiedades fsicas y qumicas para permitir el
intercambio de gases, la retencin de humedad y de nutrientes, la penetracin de
races, entre otros. Por su parte, para medir la salud del suelo se toma en cuenta la
eficiencia de procesos como los ciclos de nutrientes y los flujos de energa. En este
contexto, uno de los indicadores que se ha utilizado es la magnitud de la actividad
de diferentes enzimas involucradas en los procesos antes mencionados.
Las enzimas son molculas de naturaleza protenica producidas por los seres vivos
y que se encargan de acelerar reacciones qumicas o hacer posibles aquellas reacciones que de otra manera no se produciran. Dicho de otro modo, son catalizadores biolgicos que, al reducir la energa de activacin necesaria para las reacciones, transforman las sustancias involucradas en el metabolismo celular (incluyendo el anabolismo
o reacciones de construccin, y el catabolismo o reacciones de destruccin). La velocidad de la reaccin catalizada por una enzima depende del pH, de la fuerza inica, de
la temperatura y de la presencia o ausencia de inhibidores (Burns, 1982). La mayora
de las enzimas actan dentro de las clulas, pero algunas son extracelulares.
La actividad enzimtica del suelo es importante porque refleja el estado en
el que se encuentran sus poblaciones microbianas y su relacin con la biolo19
21
Campo de aplicacin
Esta tcnica es til para evaluar suelos contaminados con hidrocarburos, como
disel y petrleo, para suelos biorremediados, y tambin para medir la actividad
enzimtica en el ciclo del nitrgeno en suelos agrcolas y naturales.
Material y equipo
Bureta de 25 mL
Matraces volumtricos de 10, 25, 50, 100
y 1000 mL
Pinzas para bureta
Pipetas volumtricas de 1, 5 y 10 mL
Soporte universal
Autoclave
Balanza analtica
Estufa de incubacin
Equipo de destilacin microkjeldhal
Mufla
Potencimetro
Reactivos
cido brico (H3BO4) de 99.5 % de pureza
cido sulfrico (H2SO4) de 98 % de pureza
Agua destilada
Amortiguador TRIS (hidroxi metil aminometano) grado ultrapuro ( 99 %)
Cloruro de potasio (KCl) grado analtico
Etanol de 95 % de pureza
Hidrxido de sodio (NaOH) de 98.7 % de pureza
Indicador de rojo de metilo
Indicador de verde de bromocresol
xido de magnesio (MgO) grado analtico
22
Soluciones
Solucin de cido sulfrico 0.005 M. Disolver 0.2 mL de cido sulfrico al 98 %
en un matraz aforado que contenga 500 mL de agua destilada y aforar a 1000
mL.
Solucin de amortiguador TRIS 50 mM pH 9. Disolver 6.1 g de TRIS en 700 mL
de agua destilada, ajustar el pH a 9.0 con H2SO4 (0.2 M) y aforar con agua
destilada a 1000 mL.
Solucin de cloruro de potasio 2.5 M y sulfato de plata. Disolver 100 mg de
Ag2SO4 y 188 g de KCl en 700 mL de agua destilada y aforar a 1000 mL con
agua destilada.
Solucin indicadora de cido brico. Disolver 0.066 g de verde de bromocresol y
0.033 g de rojo de metilo en etanol (95 %) y aforar a 100 mL. Tomar 10 mL
de la solucin indicadora y agregarlos en un matraz volumtrico de 500 mL.
Mezclar 10 g de H3BO4 con 350 mL de agua destilada caliente hasta disolver
perfectamente. Despus, enfriar y aadir la solucin al matraz. Agregar gota a
gota la solucin de NaOH0.05 M hasta observar un vire de color rosa a verde
ligero. Finalmente, aforar con agua destilada.
Solucin estndar de amonio. Disolver 0.234 g de NH4SO4 en agua destilada y
diluir en 1000 mL. La concentracin final de N-NH4 en esta solucin es de
50 g/mL.
Solucin de hidrxido de sodio 0.05 M. Colocar 0.2 g de NaOH y adicionar 500
mL de agua destilada agitando lentamente y aforar a 1000 mL.
Solucin de xido de magnesio. Calentar 1 g de MgO por muestra de suelo a analizar a 600-700 C en mufla durante 2 h. Esperar a que disminuya la temperatura en la mufla y guardar en un desecador.
Solucin de urea 0.2 M. Disolver 0.12 g de urea en 8 mL de amortiguador TRIS
y aforar a 10 mL. Es necesario preparar la solucin diariamente y guardar a 4
C.
Tcnicas
23
Procedimiento
Incubacin de las muestras
Colocar 5 g de suelo en un matraz volumtrico de 50 mL, agregar 0.2 mL de tolueno y 9 mL del amortiguador TRIS, mezclar perfectamente. Adicionar al matraz
1 mL de la solucin de urea y mezclar, tapar el matraz e incubar por 2 h a 37 C
(figura 1.1).
Una vez concluido el periodo de incubacin, agregar 35 mL de solucin de KClAgSO42.5 M, agitar y dejar reposar la solucin a temperatura ambiente durante 5
min. Aforar el contenido a 50 mL con KCl-AgSO4, con agitacin.
Figura 1.1. Incubacin de las muestras de suelo para determinar la actividad de la ureasa
Controles
Los controles se preparan mediante el procedimiento descrito anteriormente, pero
aadiendo 1 mL de la solucin de urea 0.2 M despus de haber agregado la solucin de KCl-AgSO4 (Alef y Nannipieri, 1998; Quintero-Lizaola et al., 2005).
Estimacin del amonio desprendido
Tomar 20 mL de la muestra incubada y verterlos en un matraz de destilacin de
100 mL, agregar 0.2 g de MgO y destilar hasta colectar 20 mL en un matraz
24
Clculos
La actividad de la ureasa en suelos se expresa en g de N-NH4/g de suelo
seco por 2 h. Para obtener la actividad de cada muestra se utiliza la siguiente
frmula:
V(M - C) x 70
Au =
sh x ss
Donde
g N - NH4
Au = activudad de la ureasa, en
g de suelo sexo x 2h
Tcnicas
25
Au =
g N - NH4
g de suelo seco x 2
(50)(6.0 - 5.7) x 70
5 x 0.7
Control de calidad
La reaccin de la ureasa sigue un curso lineal hasta por 5 h; pasado este tiempo
las soluciones no presentarn un resultado ptimo.
Todo el material debe encontrarse en condiciones estriles debido a que las
enzimas ureasas son muy sensibles y puede haber respuestas de interferencia por
factores diversos.
Cuadro 1.1. Resumen de las condiciones recomendadas para la prueba de la actividad enzimtica de la ureasa
Duracin de la prueba
Temperatura de incubacin
26
3h
37 C
2h
50 g
3 o ms
Amonio liberado
Adicin de urea posterior a la
adicin de KCl-Ag2SO4
27
para las diferentes enzimas hidrolasas, incluidas las lipasas. Se ha observado que
esta actividad no aumenta en el caso de suelos contaminados con hidrocarburos aromticos policclicos, pero s en suelos contaminados con disel (Mills et al.,
1978; Margesin et al., 2000a).
Existen varios mtodos para determinar la actividad de la lipasa, que incluyen los basados en titulacin, los que detectan productos fluorescentes (Cooper y
Morgan, 1981) y los colorimtricos, que usan cromgenos como los p-nitrofenilsteres (Shirai y Jackson, 1982). El mtodo que aqu se describe es el colorimtrico desarrollado por Margesin et al. (2002). En este mtodo, el p-nitrofenilbutirato
(p-NPB) acta como sustrato, y la actividad cataltica de la lipasa se determina
al cuantificar el p-nitrofenol (p-NP) producido por la hidrlisis del sustrato, a pH
ptimo (7.25). La actividad de la lipasa se incrementa a medida que hay mayor
contaminacin por hidrocarburos (Margesin et al., 2002; Margesin, 2005). Esta
tcnica es rpida y sencilla, y no es costosa como los mtodos fluorimtricos.
Campo de aplicacin
Esta tcnica puede aplicarse a suelos contaminados con hidrocarburos, como
disel y petrleo, as como para controlar los procesos de biorremediacin de
suelos.
Material y equipo
Matraces aforados de 10, 25, 100 y
500 mL
Pipetas de 5 mL
Tubos de 10 mL
Tubos de ensaye de 10 mL
Autoclave
Balanza analtica
Bao mara
Centrfuga refrigerada
Espectrofotmetro UV-VIS
Reactivos
Agua destilada
Fosfato monobsico de sodio (NaH2PO4)
Hidrxido de sodio (NaOH)
p-nitrofenilbutirato (p-NPB) de 98 % de pureza
28
Soluciones
Solucin amortiguadora de fosfatos 100 mM pH 7.25. Pesar 6 g de NaH2PO4 y
disolverlos en 400 mL de agua destilada, ajustar el pH a 7.25 con una solucin
de NaOH 1N y aforar a 500 mL con agua destilada. Guardar en refrigeracin a
4 C durante 15 das.
Solucin de hidrxido de sodio 1N. Disolver 4 g de NaOH en agua destilada (fra
y previamente hervida) y aforar a 100 mL. La solucin puede permanecer a
temperatura ambiente durante 15 das.
Solucin de p-nitrofenol (p-NP) 100 g/mL. Disolver 2.5 mg de pNP en la solucin amortiguadora de fosfatos y aforar a 25 mL con la misma solucin.
Guardar en refrigeracin a 4 C durante una semana. Antes de utilizarla, verificar que el pH de la solucin sea de 7.25.
Solucin de p-nitrofenilbutirato (p-NPB)100 mM. Tomar 175.8 L equivalente a
209.2 mg de pNPB, disolver y aforar a 10 mL con 2-propanol. Guardar a -20
C durante 15 das o preparar cada vez que se utilice.
Procedimiento
Incubacin de la muestra y cuantificacin del p-nitrofenol
Agregar en un tubo para centrfuga 0.1 g de suelo hmedo, adicionar 5 mL de la
solucin amortiguadora de fosfatos y preincubar en bao mara a 30 C durante
10 min.
Posteriormente, adicionar 50 L de solucin de p-NPB, mezclar e incubar en
bao mara a la misma temperatura durante 10 min. Inmediatamente despus,
colocar los tubos en un bao con hielo durante 10 min, con el objetivo de detener
la reaccin.
Centrifugar los tubos a 2000 rpm durante 5 min a una temperatura de 2 a 4
C. Enseguida, introducir los tubos en el bao de hielo, pipetear el sobrenadante y
medir su absorbancia a 400 nm (Margesin, 2005). Si los valores de absorbancia
son muy altos, diluir las muestras con la solucin amortiguadora de fosfatos.
Tcnicas
29
1
0.25
4.75
2
0.50
4.50
3
0.75
4.15
4
1.00
4.00
5
1.25
3.75
25
50
75
100
125
Clculos
La actividad de la lipasa en suelos se expresa en g de p-NP/g de suelo seco por 10
min. Los valores obtenidos de absorbancia en las muestras analizadas son interpo30
lados en la curva de calibracin para obtener la concentracin de p-NP. Para obtener la actividad de cada muestra se utiliza la siguiente frmula (Margesin, 2005):
AL =
M-C
sh x sc
Donde
AL = actividad de la lipasa, en
g p - NP
g de suelo seco x 10 min
(267.47 - 122.75) g p - NP
0.1 x 0.0788 g
AL = 18,892.87
g p - NP
g de suelo seco x 10 min
Control de calidad
Se recomienda hacer la curva de calibracin de p-NP en presencia de una muestra de suelo, debido a que el p-NP producido durante la reaccin se adsorbe a
esta matriz en diferentes proporciones dependiendo de las caractersticas del
suelo.
Este bioensayo requiere de mantener el pH dentro de los lmites de 7.2 a 7.3
debido a que el enlace ster de p-NPB es muy lbil.
Tcnicas
31
Cuadro 1.3. Resumen de las condiciones recomendadas para la prueba de la actividad enzimtica de la lipasa
Cantidad de suelo
Temperatura de incubacin
Tiempo de incubacin
pH
Nmero de rplicas
Control negativo
Material de los recipientes de prueba
10 g
30 C
10 min
7.2 a 7.3
3 o ms
Sin adicin de suelo
Vidrio
Tcnicas
33
Campo de aplicacin
La actividad de la deshidrogenasa es utilizada para monitorear los suelos contaminados con hidrocarburos de petrleo, como el disel, y durante los procesos
para su biorremediacin.
Material y equipo
Embudos de separacin
Matraces aforados de 50 y 100 mL
Papel aluminio
Pipetas graduadas de 1, 5 y 10 mL
Tubos de ensayo de 16 x 150 mm
Balanza analtica
Espectrofotmetro UV-VIS
Estufa de incubacin
Vrtex
Reactivos
Acetona o metanol grado analtico
cido clorhdrico grado analtico
Agua destilada
Amortiguador TRIS (hidroxi metil aminometano) grado ultrapuro ( 99 %)
Carbonato de calcio (CaCO3) grado analtico
Cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC) de 98 % de pureza
1,3,5-trifenilformazano (TPF) de 98 % de pureza
Soluciones
Solucin de cido clorhdrico 0.2 M. Disolver 8.14 mL de cido clorhdrico al 38 % en
un matraz aforado que contenga 250 mL de agua destilada y aforar a 500 mL.
Solucin amortiguadora de TRIS pH 7.6.
Disolver 12.1 g de TRIS en 700 mL de agua destilada, ajustar el pH a 7.6 con HCl
(0.2 M) y aforar con agua destilada a 1000 mL.
Solucin de 1,3,5-trifenilformazano (TPF). Disolver 50 mg de TPF en 80 mL de
metanol (o acetona) y aforar a 100 mL con el mismo disolvente.
Solucin de cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC) al 3% (en peso/volumen).
Disolver 3 g de cloruro de 2,3,5-TTC en 75 mL de agua destilada y aforar a
100 mL.
34
Procedimiento
Incubacin de las muestra
Se pesan, por separado, tres porciones de suelo de 2 g cada una y se colocan en
tubos de ensayo forrados con papel aluminio (ya que el TTC y el TPF son sensibles
a la luz). A cada tubo se le adicionan 0.0335 g de CaCO3, 0.5 mL de la solucin
de TTC al 3 % y 1.75 mL de agua destilada. Los contenidos son mezclados en el
vrtex. Los tubos son incubados durante 24 h a 37 oC. Todo este procedimiento
debe realizarse con luz difusa.
Extraccin y medicin del 1,3,5-trifenilformazano
Al finalizar la incubacin, el TPF formado por la reduccin del TTC se extrae en
un embudo de separacin con 5 mL de metanol (figura 1.3), agitando durante 5
minutos. Despus, se filtra. Este procedimiento se repite aadiendo metanol hasta
llegar a un volumen de 40 mL. El extracto total se deposita en un matraz de 50
mL para aforar. Se analizan las muestras en el espectrofotmetro a una longitud de
onda 485 nm, usando metanol como blanco.
Figura 1.3. Extraccin de 1,3,5-trifenilformazano (TPF)
Tcnicas
35
Clculos
La actividad de la deshidrogenasa en suelos se expresa como g TPF/g suelo
por da. Los valores obtenidos de absorbancia en las muestras analizadas son
interpolados en la curva de calibracin para obtener la concentracin del TPF.
Como blanco se utilizan los controles de suelo. Para obtener la actividad de
cada muestra se utiliza la siguiente frmula:
AD =
V {[TPF]M - [TPF]C}
sc
Donde:
AD = actividad de la lipasa, en
g TPF
g de suelo seco x d
[TPF]M = concentracin de TPF en la muestra de suelo, en g/mL
[TPF]C = concentracin de TPF en la muestra de suelo, en g/mL
sc = peso del suelo en base seca de 1 g de suelo hmedo, en g
V = volumen de metanol (o acetona) adicionado a la suspensin, en mL
36
Ejemplo
Clculo de la actividad enzimtica de la deshidrogenasa de una muestra de suelo
cuyo anlisis reporta que contiene 2.72 g TPF/mL. Para este clculo se considera los siguiente: a) el peso seco de 1 g de suelo sin secar es 0.6634 g; b) la
concentracin de TPF del blanco es 0.82 g TPF/mL; y c) el volumen de metanol
adicionado a la suspensin fue de 40 mL.
AD = 114.56
g TPF
g de suelo seco x d
Control de calidad
Este mtodo no debe utilizarse en suelos contaminados con cobre, ya que este
elemento puede inhibir la actividad de la deshidrogenasa, por reduccin de la absorbancia de TPF (Garca et al., 2003). El TTC puede ser txico para los microorganismos (Howard, 1972).
La lectura debe realizarse en oscuridad o luz difusa para evitar que los resultados se alteren.
Cuadro 1.4. Resumen de las condiciones recomendadas para la prueba de la actividad enzimtica de la deshidrogenasa
Cantidad de suelo
Luz
Temperatura de incubacin
Tiempo de incubacin
Nmero de rplicas
Control negativo
Cuantificacin
Material de los recipientes de prueba
Tcnicas
20 g
Difusa u oscuridad
37 C
24 h
3 o ms
5 mL de TRIS, sin adicin de TTC
Espectrofotomtrica 485 nm
Vidrio
37
Campo de aplicacin
Este ensayo es aplicable a suelo contaminado con hidrocarburos (como petrleo o disel) y a suelo biorremediado.
Material y equipo
Cantidad de suelo
Luz
Temperatura de incubacin
Tiempo de incubacin
Nmero de rplicas
Control negativo
Cuantificacin
Material de los recipientes de prueba
20 g
Difusa u oscuridad
37 C
24 h
3 o ms
5 mL de TRIS, sin adicin de TTC
Espectrofotomtrica 485 nm
Vidrio
Reactivos
cido sulfrico (H2SO4) al 98 % de pureza
Agua destilada
Permanganato de potasio (KMnO4) grado analtico
Perxido de hidrgeno (H2O2) al 30 % de pureza
Oxalato de sodio grado analtico
Soluciones
Solucin de cido sulfrico 1.5 M. Se depositan 82.6 mL de H2SO4 de 98 % en
matraz aforado y se lleva a 1000 mL.
Solucin de permanganato de potasio 0.01 M. Se pesan 1.5804 g de KMnO4 y se
Tcnicas
39
Procedimiento
Pesar 0.5 g de suelo (tamizado en una malla con tamao de poro < 2 mm) y
depositarlo en un matraz Erlenmeyer, agregar 40 mL de agua destilada, tapar el
matraz y agitar por 30 min en agitador rotatorio (a una velocidad aproximada
de 30 vueltas por min).
Transcurrido el tiempo, adicionar 5 mL de la solucin de H2O2 (1:100), tapar
nuevamente y agitar por 10 min. Aadir 5 mL de la solucin de H2SO41.5 M con
la finalidad de parar la reaccin enzimtica y estabilizar el H2O2 remanente; posteriormente se filtra.
Medicin del perxido de hidrgeno remanente
Se toma una alcuota de 25 mL del filtrado de cada muestra y se titula lentamente
con la solucin de KMnO4 0.01M, con agitacin (con agitador magntico). Para
llegar al vire se debe ser muy observador, ya que las primeras gotas del permanganato se decoloran lentamente pero luego la reaccin se hace ms rpida. El punto
final de la valoracin lo seala la aparicin del primer color rosa permanente.
Controles
Los controles se preparan sustituyendo los 5 mL de H2O2 por un volumen igual de
agua destilada y se adicionan al suelo; se procede de la misma forma que para las
muestras problema.
Tambin se prepara un blanco con 40 mL de agua destilada, 5 mL de H2O2
(1:100) y 5 mL de H2SO41.5 M. A este blanco no se le adiciona suelo, pero s
40
H2O2. Sirve para indicar la cantidad de H2O2 que podra poseer la muestra como
remanente al final de la incubacin, si la actividad de la catalasa fuese nula. Se obtiene una solucin de perxido 8.8 mM (con 0.44 mmoles de H2O2).
El procedimiento de titulacin es igual, tanto para los controles como para el
blanco. La concentracin inicial del H2O2 que se aade al suelo se determina por la
valoracin con la solucin de KMnO4 0.01M del blanco sin suelo y con H2O2.
Clculos
Para calcular la actividad de la catalasa del suelo, se emplea la siguiente
frmula:
[B - (M - C)] x N x V x 1
AC =
SS
Donde
AC = actividad de la catalasa, en
g de suelo seco x h
B = cantidad de KMnO4 (en mL) gastados en la valoracin del blanco sin suelo
y con H2O2
M = cantidad de KMnO4 (en mL) gastados en la valoracin de las muestras
C = cantidad de KMnO4 (en mL) gastados en la valoracin del control correspondiente a cada muestra de suelo
N = normalidad exacta de la solucin de KMnO4
0.5 = valor constante que procede del clculo para conocer los mg de H2O2 que
reaccionan con el KMnO4 [peso molecular del H2O2 (34 dividido por estado de
oxidacin de (2)] y del clculo para obtener la cantidad de H2O2 en mmoles (1/
peso molecular del H2O2)
V = factor de dilucin; en este caso es 50 mL/25 mL
ss = factor relativo a la cantidad de suelo seco utilizado (aqu se toma una
muestra de 0.5 g de suelo hmedo y se pone a secar en la balanza de humedad.
Al final se reporta el peso que corresponde en suelo seco y ese valor es al que se
refiere G)
t = factor de tiempo (6) porque son 10 minutos; se reporta hora (60/10
=6)
Tcnicas
41
Ejemplo
Clculo de la actividad enzimtica de la catalasa de una muestra de suelo de la
cual se tienen los siguientes datos:
B = 10.4 mL de KMnO4
M = 10.7 mL de KMnO4
C = 0.1 mL de KMnO4
N = 0.0145 N
V=2
G = 0.3770 g de suelo seco
Al sustituir en la frmula se obtiene el siguiente resultado:
AC = 0.2076
Control de calidad
En esta tcnica enzimtica el color rosa plido indica el viraje. Ya que el H2O2
es muy inestable y la muestra antes de titular es de color transparente, se debe
finalizar la titulacin en cuanto aparezca el primer color rosa permanente durante la titulacin.
Cuadro 1.5. Resumen de las condiciones recomendadas para la prueba de la actividad enzimtica de la catalasa
Cantidad de suelo
Nmero de rplicas
Control negativo
Blanco de prueba
Cuantificacin
Material de los recipientes de prueba
Cuantificacin
Material de los recipientes de prueba
42
10 g
3 o ms
5 mL de agua destilada sustituyen a 5
mL de H2O2
Sin suelo pero con H2O2
Permanganimetra
Vidrio
Espectrofotomtrica 485 nm
Vidrio
Para garantizar resultados reproducibles en los mtodos descritos en este captulo, deben atenderse las siguientes consideraciones:
La limpieza del material de vidrio y su proteccin del polvo son muy importantes para evitar interferencias. Se recomienda lavar el material de vidrio con un
detergente no inico.
Con la finalidad de asegurar un buen procedimiento, los materiales para las
determinaciones enzimticas se deben separar. Los recipientes de prueba deben
ser resistentes a las reacciones y no deben adsorber el sustrato o los productos
generados en la reaccin.
Cada tcnica debe realizarse de acuerdo con el procedimiento descrito ya que
si se cambian algunos valores, como por ejemplo la concentracin del sustrato, se
pueden obtener resultados incorrectos.
En cuanto a la utilizacin de solucin tampn o amortiguadora, existen diferencias segn los mtodos; algunos autores (Kandeler y Gerber, 1988; Von Mersi
y Schinner, 1991) no utilizan ninguna, pero otros s la utilizan para ajustar el pH
del suelo (Sinsabaugh et al., 2000). En la mayora de los mtodos enzimticos
descritos la solucin amortiguadora empleada es la que se aade al suelo antes de
su incubacin. Cualquier cambio de tipo o concentracin de tampn puede afectar
los resultados, por lo cual deben comprobarse los efectos que el cambio tendra
sobre la actividad enzimtica.
La temperatura y el tiempo de incubacin deben ser los indicados para cada
tcnica, usualmente 37 C. El incremento de la temperatura aumenta la velocidad
de reaccin; sin embargo, si esta llega a ser muy alta, las enzimas pueden desnaturalizarse. Si el tiempo no es correcto se obtendran resultados errneos porque la
relacin de actividad por unidad de tiempo cambiar (Garca et al., 2003).
Referencias
Alef, K., Nannipieri, P. 1998. Enzyme activities: Catalase activity. En: Alef, K., Nannipieri,
P. (editores). Methods in applied soil microbiology and biochemistry, Academic Press.
Gran Bretaa.
Barajas-Aceves, M. 2008. Ensayos de metabolismo microbiano en suelo: actividad deshidrogenasa y tasa de mineralizacin de nitrgeno. En: Ramrez-Romero, P., MendozaTcnicas
43
Makoi, J.H., Ndakidemi, P.A. 2008. Selected soil enzymes: examples of their potential
roles in the ecosystem. African Journal of Biotechnology. 7, 181-191.
Margesin, R., Zimmerbauer, A., Schinner, F. 1999. Soil lipase activity a useful indicator of
oil biodegradation. Biotechnology Techniques. 13, 859863.
Margesin, R., Walder, G., Schinner, F. 2000a. The impact of hydrocarbon remediation (diesel oil and polycyclic aromatic hydrocarbons) on enzyme activities and microbial properties of soil. Acta Biotechnologica. 20, 313-333.
Margesin, R., Zimmerbauer, A., Schinner, F. 2000b. Monitoring of bioremediation by soil
biological activities. Chemosphere. 40, 339346.
Margesin, R., Feller, G., Hmmerle, M. Stegner, U. Schinner, F. 2002. A colorimetric method for the determination of lipase activity in soil. Biotechnology Letters. 24, 27-33.
Margesin, R. 2005. Determination of enzyme activities in contaminated soil. En: Margesin, R., Schinner, F. Manual for soil analysis monitoring and assessing soil bioremediation. Vol. 5. Springer Publishing Company. EUA.
Mills, A.L., Breuil, C., Colwell, R.R. 1978. Enumeration of petroleum-degradating marine
and estuarine microorganisms by the most probable number method. Canadian Journal of Microbiology. 24, 552-557.
Paolini, J.E. 2003. Las enzimas del suelo y su aplicacin en la caracterizacin bioqumica
de sitios. Instituto Venezolano de Investigaciones Cientficas.
Quintero-Lizaola R., Ferrera-Cerrato R., Etchevers-Barra J.D. 2005. Manual para la medicin de actividades enzimticas en compost y vermicompost. Colegio de Postgraduados. Campus Montecillo. Mxico.
Ros-Velzquez, C., Curbalo, D., Falto, L., Gonzlez, L., Negrn, C., Prez, C., Santiago, J.,
Torres, L., Velzquez, A. 2008. Deshidrogenasas. Departamento de Biologa. Universidad
de Puerto Rico, Recinto Universitario de Magagez. Puerto Rico. http://www.slideshare.
net/espiroquetos/info-escrito-deshidrogenasas. Consultado en octubre de 2010.
Rodrguez-Zavala, J.S. 2006. Problema bioqumico. Determinacin del paso limitante en
aldehdo deshidrogenasas atpicas de Escherichia coli. Revista de Educacin Bioqumica. 25, 26-27.
Snchez-Ferrer, A. 1998. Recuperacin, purificacin y caracterizacin de lipasas producidas por Candida rugosa. Aplicacin a la resolucin de compuestos quirales y diseo del
reactor enzimtico. Tesis de doctorado. Escola Tecnica Superior dEnginyeria. Universitat Autnoma de Barcelona. Barcelona, Espaa.
Subhani, A., Changyong, H., Zhengmiao, X., Min, L., El-ghamry, A.M. 2001. Impact of soil
environment and agronomic practices on microbial/dehydrogenase. Enzyme activity
in soil. A review. Pakistan Journal of Biology Sciences. 4, 333- 338.
Tcnicas
45
46
Introduccin
Las lombrices de tierra son un grupo fundamental de la fauna del suelo, ya que
constituyen gran parte de la biomasa animal edfica en varios ecosistemas, tanto
en zonas templadas como tropicales. Asimismo, desempean un papel ecolgico
primordial por su influencia en la descomposicin de la materia orgnica, el desarrollo de la estructura del suelo y el ciclo de los nutrientes (Ros, 2005).
Las lombrices causan importantes modificaciones fsicas en el suelo (galeras,
madrigueras y hoyos) que mejoran el ambiente para el desarrollo de otros organismos (como los microorganismos) e incrementan la disponibilidad de hbitats
y alimento para las plantas y otros animales (Lavelle, 1997; Brown et al., 2000).
Adems, aumentan la porosidad, facilitan la formacin de agregados y mejoran la
estructura del suelo, promueven la oxigenacin y la infiltracin de agua, incrementan el transporte de nutrientes y compuestos qumicos agrcolas hasta las capas
profundas (Subler et al., 1997; Edwards y Bohlen, 1992), contribuyen a la formacin del suelo y a reducir la erosin. Sus efectos son especialmente importantes en
suelos con estructura pobre (Ros, 2005).
Durante su proceso de alimentacin, succionan o chupan la tierra de las galeras que excavan y digieren de ella las partculas vegetales y animales en descomposicin. De esta manera, transforman los residuos orgnicos en humus, el cual
devuelven al suelo al expulsarlo por el ano junto con la tierra. As, participan en la
47
fertilizacin del suelo al incrementar su carga microbiana y su contenido de nitrgeno (Elliot et al., 1990). Adems, participan de manera importante en el ciclo del
carbono, ya sea incrementando su mineralizacin o disminuyendo su descomposicin al formar agregados estables en los cuales este elemento queda protegido
(Ros, 2005).
La contaminacin del suelo con compuestos orgnicos, metales pesados, plaguicidas y lluvia cida puede afectar a las poblaciones de lombrices. Estos contaminantes se acumulan en sus tejidos y pueden constituir un problema para el gran
nmero de animales que se alimentan de ellas, debido a su potencial biomagnificacin (Edwards y Bohlen 1992).
Las lombrices se emplean con frecuencia como organismos de prueba para evaluar la toxicidad de los suelos (Cuevas-Daz et al., 2008). La especie de lombriz
ms utilizada en las pruebas estandarizadas es Eisenia andrei (Bouch, 1972). Esta
especie se distribuye naturalmente en casi todo el hemisferio norte; es considerada
un bioindicador de la calidad de los suelos, ya que solo es capaz de desarrollarse y
reproducirse en condiciones adecuadas de humedad (85 %), temperatura (25 a
30 C), pH del suelo (6.5 a 7.5) y alimentacin (material orgnico agropecuario,
industrial y domstico). Adems, E. andrei es un organismo de fcil manejo en el
laboratorio (Kaplan et al., 1980), casi no contrae enfermedades, tiene un ciclo reproductivo corto (alcanza su madurez sexual en aproximadamente 2 meses) y es
extremadamente prolfica (deposita cada 7 a 10 das una cpsula o huevo con un
contenido que flucta de 2 a 20 embriones) (Domnguez et al., 2005; Santamara
y Ferrera, 2002). Cuando est sexualmente madura, desarrolla una estructura sobre la epidermis que se denomina clitelo, donde crecen los cocones o cpsulas en
los cuales uno o varios huevos son depositados. Posteriormente esta cpsula pasa
hacia los segmentos anteriores de la lombriz y es colocada en el suelo. Los juveniles
se desarrollan dentro de la cpsula y despus emergen de ella.
Campo de aplicacin
Los bioensayos con lombrices se emplean para evaluar la toxicidad de suelos contaminados con hidrocarburos, porque de esta manera se puede predecir el impacto
de las mezclas complejas de compuestos como el petrleo e hidrocarburos aromticos policclicos sobre los organismos.
Estas pruebas tambin son tiles para monitorear la biorremediacin de suelos
contaminados con hidrocarburos, tanto en laboratorio como en campo (Salanitro,
48
Material y equipo
Recipientes de vidrio (dimetro de 4.5
Balanza analtica
cm y altura de 7 cm)
Guantes
Micropipeta de 100 a 1000 L
Papel aluminio
Potencimetro
Papel filtro
Pinzas
Pipetas volumtricas (capacidad de
1-100 mL)
Puntas para micropipeta de 100 a 1000
L
Tela sinttica (organza)
Reactivos
Agua desionizada
2-cloroacetamida 99 %
Soluciones amortiguadoras comerciales para medir pH de 4, 7 y 10
E valuacin
49
Soluciones
Solucin stock de 2-cloroacetamida. Se pesan 225 mg de 2-cloroacetamida y se
diluyen en 10 mL de agua (o 4.5 g en 200 mL de agua). Esta solucin equivale a 22.5 mg de 2-cloroacetamida por mL de agua. Se prepara nicamente la
solucin stock que se va utilizar en la prueba.
Organismos de prueba
Para esta pruebas se usan lombrices de la especie E. andrei que presenten clitelo y
con un peso promedio de 0.30 g.
Estas lombrices se cultivan en contenedores o en lechos de 1.0 m de ancho
por 1.5 m de largo, en un sitio con sombra, rodeado de tela mosquitero para evitar
que otros animales penetren y se alimenten de las lombrices. En el laboratorio son
mantenidas en contenedores plsticos. Las lombrices pueden ser alimentadas con
estircol equino o vacuno, o residuos agroindustriales, como cachaza o bagazo de
caa de azcar, as como residuos de jardinera (con pH cercano a 7 y conductividad inica menor a 6 mS). Siempre se debe administrar el mismo tipo de alimento
para evitar variaciones en el crecimiento de las lombrices (OECD, 1984; CuevasDaz et al., 2008). Se ha probado una mezcla 50:50 de estircol precomposteado
de equino y cachaza de caa de azcar, la cual ha funcionado bien. Para producir
suficientes lombrices se deben colocar aproximadamente 20 kg de residuos por
1 kg de lombrices. El precomposteo consiste en dejar el estircol y la cachaza en
composteo durante 10 a 15 das previos a la colocacin de lombrices, para que la
etapa termoflica en donde la temperatura llega alcanzar hasta 65 C no inhiba el
desarrollo de la lombriz (Santamara, 1996). Se ajustan la humedad y el pH para
que posteriormente las lombrices sean depositadas.
Las lombrices se pueden conseguir del cultivo que se mantiene en la seccin
de lombricompostaje de la Facultad de Ingeniera en Sistemas Agropecuarios de la
Universidad Veracruzana, ubicada en Acayucan, Veracruz (figura 2.1)
Suelo
Se recomienda realizar los bioensayos inmediatamente despus de la toma de
muestras del suelo problema; pero si esto no es posible, las muestras pueden ser
preservadas a 4 C en la oscuridad hasta 15 das en recipientes de vidrio.
50
de
Ingeniera
en
Sistemas
El suelo se pasa por una malla para tener un tamao de partcula menor o
igual a 4 mm, ya que en este caso los organismos se introducen en el suelo. Para
la prueba se requiere una cantidad total de 1000 g de suelo problema. De este
se toman 100 g para determinar la humedad (WSDE, 1996; DOF, 2003), el pH
(DOF, 2003; OECD, 1984) y el contenido de hidrocarburos totales del petrleo (HTP) o hidrocarburos aromticos policclicos (HAP), conforme lo indica la
NOM-138-SEMARNAT/SS-2003 (DOF, 2005). Se requieren cuatro rplicas del
suelo problema, adems de un control negativo (suelo no contaminado) y un control positivo (suelo con 2-cloroacetamida) para comprobar la sensibilidad de las
lombrices. El control negativo debe ser un suelo no contaminado y con la misma
textura que el suelo problema, al cual se le ajusta la humedad de la misma forma
en que se procedi para el suelo problema. Tambin se puede utilizar como control
negativo un suelo artificial.
E valuacin
51
Hs =
[Pi - Pf]
x 100
[M - (Pi - Pf)]
Donde
Hs = humedad del suelo (%)
Pi = peso inicial (peso de la muestra + peso constante de la cpsula, en g)
Pf = peso final despus de secar (peso de la muestra seca + peso constante de
la cpsula, en g)
M = peso inicial de la muestra utilizada (25 g)
Ejemplo:
Hs =
[41 - 36]
x 100 = 25%
[25 - (41 - 36)]g
M x Hf x f
100
Donde
W = cantidad de agua para adicionar (mL)
M = peso de la muestra (g)
f = factor de conversin (1mL/g)
Hf = humedad a adicionar o faltante en el suelo (%)
Ejemplo
Clculo del agua requerida para tener una muestra de suelo de 50 g (M) con 45 %
de humedad (Hr), sabiendo que su humedad inicial es de 25 % (Hs).
Hf = (45 - 25)% = 20%
W=
50 g x 20% x 1 mL/g
= 10 mL de agua
100
53
1 kg
x 38.5
1000 g
mg
kg
CTOX = 11.55 mg
Para determinar la cantidad de solucin stock de 2-cloroacetamida para adicionar al suelo, se realiza el clculo siguiente (WSDE, 1996):
VS =
CTOX
S
Donde
VS = volumen de solucin stock a adicionar (mL)
CTOX = cantidad de 2-cloroacetamida (mg)
S = concentracin de la solucin stock (mg/mL)
Ejemplo: considerando el resultado obtenido de la cantidad de 2-cloroacetamida (CTOX) que es necesario agregar a una muestra de suelo de 300 g, as como
la concentracin de la solucin stock igual (S), se calcula el volumen de solucin
stock a adicionar.
VS =
11.25 mg
= 0.51 mL
22.5 mg/mL
De manera que si se tiene un suelo control de 300 g con una humedad requerida de 45 %, entonces:
VSD = 300 g x 0.45 = 135 g = 135 mL
Lo anterior es la cantidad de solucin stock diluida en agua (VSD) que es ne54
cesario agregar al suelo control. La cantidad de agua y stock que forman dicha
dilucin se calcula de la siguiente manera:
Vw = VSD - VS = (135.00 - 0.51) mL = 134.49 mL
Lo anterior significa que debemos diluir 0.51 mL de la solucin stock en 134.49
mL de agua y agregarlos al suelo control; dicho paso debe realizarse en una campana de extraccin, utilizando para el suelo un contenedor plstico o de vidrio.
Procedimiento
Preparacin de los organismos
La prueba de mortalidad tiene una duracin de 14 das. Antes de iniciar las pruebas, las lombrices deben vaciar sus intestinos, para lo cual se depositan en cajas de
Petri sobre papel filtro humedecido con agua desionizada durante 5 h (figura 2.2).
Finalmente, son lavadas, secadas y pesadas.
Figura 2.2. Lavado de los organismos
E valuacin
55
Desarrollo de la prueba
En los recipientes de vidrio se depositan de 50 a 100 g de suelo problema con una
humedad del 45 % y un pH entre 6 y 7. El suelo control y las rplicas deben mantenerse en las mismas condiciones de humedad y pH. Posteriormente se depositan
10 lombrices por recipiente (figura 2.3), y estos se cubren con la tela sinttica
(organza). La tela evita la prdida de humedad, pero permite que exista circulacin
de aire dentro de los recipientes (figura 2.4).
Figura 2.3. Colocacin de los organismos en los recipientes de prueba
Al trmino de la prueba (14 das), las lombrices son sacadas de los recipientes y depositadas en unos nuevos para determinar la mortalidad. Se cuentan los
organismos vivos, el movimiento y las reacciones ante los estmulos de tacto. Las
lombrices que no responden a esos estmulos se consideran muertas. Tambin se
pesan para registrar su ganancia de peso al trmino de la prueba. Finalmente, se
mide la humedad y el pH de los suelos (problema y controles).
Clculos
Se calcula la concentracin letal media (CL50) por el mtodo de Probit o SpearmanKarber recortado. Para ello, se incluye el control y las rplicas.
Mtodo Spearman-Karber
Se determinan los logaritmos naturales de las concentraciones, y los datos de mortalidad se convierten en probabilidad considerando las muertes y el nmero total de
lombrices en la prueba; se establecen intervalos de los logaritmos de las concentraciones. Para obtener la frecuencia relativa, se calcula la diferencia de las probabilidades de muerte en el intervalo. Posteriormente se multiplica la frecuencia relativa
E valuacin
57
Reporte
Para elaborar el reporte se recomienda incluir los siguientes puntos:
58
Control de calidad
La mortalidad en el suelo control no puede exceder el 10 %. El peso de las lombrices en el suelo control no debe ser mayor del 20 %, en relacin con el peso
inicial. Se debe asegurar que las lombrices se encuentren saludables antes del
experimento, para lo cual deben responder a los estmulos de tacto y escapar
de la luz (Bembridge, 1998; Frnd et al., 2010). Se debe conservar la misma
temperatura durante todo el experimento. Los resultados no se consideran aceptables si en el control negativo, o sea sin compuestos txicos, la supervivencia
es menor del 90 %.
Se debe probar la sensibilidad del organismo antes de la toma de muestra de
suelo con el control positivo. Las lombrices deben provenir de una misma poblacin para evitar variaciones en la prueba. En la tabla 2.1 se resumen las condiciones
generales del bioensayo.
Tabla 2.1. Resumen de las condiciones recomendadas para la prueba aguda con lombriz de
tierra
14 das
22 2 C
45 %
6.5-7
Recipientes de vidrio
200 a 400 g
50 a 100 g
59
Eisenia andrei
Ms de 2 meses (clitelada)
10
4
Sin alimento
Supervivencia
Suelo no contaminado
2-clorocetamida
Material y equipo
Frascos de vidrio (dimetro de 4.5 cm y
altura de 7 cm)
Guantes
Papel aluminio
Papel filtro
Pinzas
Pipetas volumtricas de 1 a100 mL
Puntas para micropipeta de 100 a 1000 L
Tela sinttica (organza)
60
Contenedor de prueba
Balanza analtica
Micropipeta de 100 a 1000 L
Potencimetro
a)
8.3 cm
2 arcos de 0.5 x 1 cm
20 cm de dimetro
b)
10 cm de
altura
Seguros
25 cm de dimetro
E valuacin
61
c)
10 cm de altura
Dimetro de 6 cm y 1
cm de altura
Reactivos
Agua desionizada
cido brico > 98 % grado analtico o 2-cloroacetamida de pureza del 99 %
Soluciones amortiguadoras comerciales para medir pH de 4, 7 y 10
Soluciones
Solucin stock de 2-cloroacetamida o de cido brico. Se puede utilizar la solucin
stock de 2-cloroacetamida del bioensayo agudo de 14 das (ver seccin anterior)
o se puede preparar una solucin stock de cido brico. En este ltimo caso, para
625 g de suelo en base seca, se pesan 25 g de H3BO3, se depositan en un matraz
y se afora a 1 L con agua desionizada.
Organismos de prueba
Se emplean lombrices adultas cliteladas de la misma especie que en la prueba de
mortalidad (E. andrei), con un peso de 0.250 a 0.500 g cada una. El cultivo y
62
Suelo
El suelo problema (4 kg) se tamiza a travs de una malla de 4 mm. Se determina
su pH y su capacidad de retencin de agua. En funcin de los resultados de estas
determinaciones se realiza el ajuste a un pH de 6.5 a 7.0 y un contenido de humedad del 70 %. Las concentraciones de muestra provienen del suelo contaminado y
de las fases del proceso de biorremediacin, por lo que se obtienen suelos o muestras con concentraciones diversas.
Para la prueba se utilizan diferentes concentraciones del suelo problema, as
como un control negativo y uno positivo.
63
Procedimiento
Preparacin de los organismos
Previamente a la prueba, las lombrices se depositan en cajas de Petri con papel
filtro humedecido con agua desionizada, para que vacen sus intestinos durante 5
h. Posteriormente son lavadas, secadas y pesadas.
Desarrollo de la prueba
Se pesan 100 g del suelo problema y del suelo control, y se colocan en el contenedor de seis cmaras, alternando el suelo control y el suelo contaminado en diferentes concentraciones. Posteriormente se depositan 10 lombrices en la cmara
central. La migracin de la lombriz es lenta, por lo que, si despus de 10 min no se
observa migracin, se acerca una lmpara para disminuir el tiempo de espera y acelerar el movimiento hacia los compartimentos, cuidando de no daar a la lombriz
(figura 2.6). Cada contenedor tendr cuando menos cuatro rplicas.
Para evitar que las lombrices escapen, los contenedores deben ser cubiertos con
tela de organza y papel aluminio perforado con pequeos orificios, lo cual facilitar
la circulacin de oxgeno dentro del contenedor y evitar la prdida excesiva de humedad. Los contenedores deben ser colocados en un lugar donde la luz sea mnima
y la temperatura no exceda los 25 C (Hund y Wiechering, 2001).
64
Al trmino de 48 h, las paredes de las cmaras son tapadas con una placa divisoria con dimensiones de 12 cm de altura, 8.3 cm de ancho y espesor de 0.5 mm
(figura 2.7) para evitar el movimiento de la lombriz hacia las cmaras vecinas. El
suelo y los organismos de cada cmara debern ser sacados para registrar el nmero de lombrices en cada una de ellas, as como para evaluar su movimiento ante los
estmulos de tacto y registrar su peso al final de la prueba.
Figura 2.7. Contenedor con placa intermedia
Placa divisoria
E valuacin
65
Clculos
Si es una prueba de concentraciones mltiples, que tienen cuatro o ms concentraciones y un contenedor por cada concentracin (alternando suelo limpio y contaminado), la evasin se determina aplicando la siguiente frmula a cada rplica
(ISO, 2008; De Silva y Van Gesten, 2009):
E=
C-P
L x 100
Donde
E = evasin (%)
C = nmero de lombrices en el control
P = nmero de lombrices en el suelo problema
L = nmero total de lombrices expuestas
Con estos datos se puede calcular la CE5, que es la concentracin de suelo contaminado que genera una respuesta evasiva del 50 %. En ocasiones, como margen de
seguridad ante la alta toxicidad de los suelos contaminados, se establece la CE20, que
es la concentracin que provoca una evasin del 20 %. Ambos indicadores toxicolgicos se calculan por el mtodo Probit o Spearman-Karber. El manejo del software libre,
como el Trimmed Spearman Karber Method (USEPA, 1999b) y el Probit Program
(USEPA, 1999a) es muy sencillo: simplemente se ingresan los datos en orden creciente de concentracin con su respectiva respuesta, y el programa automticamente
hace una comparacin entre el suelo control y los tratamientos. Cabe destacar que el
programa Trimmed Spearman Karber Method solo permite calcular la CE50 o la CL50.
Los indicadores adicionales, como el CE20, deben obtenerse con el programa Probit.
Si es una prueba con un solo nivel de contaminacin y al menos cinco rplicas, alternando suelo contaminado con suelo control (por ejemplo para probar la
toxicidad de un suelo biorremediado), se registra el nmero de lombrices supervivientes en el suelo control y en el problema. Se determinan los promedios y la
desviacin estndar de las cinco rplicas. El software estadstico se puede encontrar en siguiente liga de la pgina de USEPA: http://www.epa.gov/eerd/stat2.
htm#probit.
66
Reporte
Para elaborar el reporte se recomienda incluir los siguientes puntos:
E valuacin
67
Control de calidad
Cada mes o cada vez que se efecte el bioensayo se debe realizar una prueba con
el control positivo para determinar la viabilidad de los organismos.
Para que los resultados de la prueba de evasin sean vlidos, el nmero de
lombrices muertas o perdidas debe ser menor del 10 % por tratamiento. Se
debe controlar en todo momento las condiciones de temperatura durante la
prueba.
68
Tabla 2.2. Resumen de las condiciones recomendadas para la prueba de evasin o migracin
de lombrices de tierra.
Duracin del bioensayo
Temperatura
Humedad del suelo
pH del suelo
Contenedores
Cantidad total de suelo requerida
Cantidad de suelo requerida por rplica
Especie de prueba
Edad del organismo al inicio de la prueba
Nmero de organismos por rplica
Nmero de rplicas
Rgimen
Respuesta a medir
Control negativo
Control positivo
48 h
22 2 C
45-70 %
6.5-7
Redondos de seis cmaras
4 kg
100 kg
Eisenia andrei
Ms de 2 meses (clitelada)
10
4
Sin alimento
Movimientos migratorios
Suelo no contaminado
cido brico
E valuacin
Balanza analtica
Micropipeta de 100 a 1000 L
Potencimetro
69
Reactivos
Agua desionizada
Carbendazim con pureza mayor al 97 %
cido brico (H3BO3) con pureza mayor al 98 %
Soluciones amortiguadoras comerciales para medir pH de 4, 7 y 10
Soluciones
Solucin stock de carbendazim
Se pesan 6 mg de carbendazim y se mezclan en 10 mL de acetona, lo que proporciona una concentracin de 0.6 mg de carbendazim/mL.
Solucin stock de cido brico (H3BO3)
Para preparar esta solucin se sigue el mismo procedimiento descrito para la prueba de evasin.
Organismos de prueba
El organismo de prueba utilizado es la lombriz de tierra de la misma especie que
en las pruebas anteriores (E. andrei). Al inicio de la prueba, los organismos deben
haber alcanzado la edad adulta, y presentar clitelo y un peso promedio de 0.300 g,
con un rango de 0.300 a 0.600g.
Para cultivar y alimentar a las lombrices se deben seguir los procedimientos
descritos en la prueba aguda.
Suelo
Se requieren 1000 g de suelo problema, previamente cribado a travs de una malla
de 4 mm. Se toman 100 g de este suelo para determinar su capacidad de retencin
70
Procedimiento
Preparacin de los organismos
Antes de realizar la prueba, las lombrices son colocadas durante 5 h en cajas de
Petri con papel filtro humedecido con agua desionizada, con el fin de vaciar sus
intestinos. Posteriormente son lavadas, secadas y pesadas.
Desarrollo de la prueba
Este bioensayo se desarrolla en un tiempo de 8 semanas (56 das), evaluando la
respuesta de las lombrices cada 7 das.
Se adicionan 50 a 100 g de suelo problema en los recipientes de vidrio y se
aade el 5 % de una mezcla (50:50) de estircol equino precomposteado y cachaza de caa de azcar, como alimento. Se ajusta la humedad del suelo a entre
45 y 60 % de la capacidad de campo, y el pH a un valor entre 6.0 y 7.0. Con los
controles se realizan los mismos ajustes.
Se depositan 10 lombrices en cada recipiente y se cubren con organza y papel
aluminio perforado para evitar la prdida de humedad y permitir la circulacin de
aire dentro de los recipientes. Se pesan los recipientes para llevar el control de
E valuacin
71
humedad por diferencia de peso; otra opcin es utilizar una balanza de humedad,
como el analizador marca Kern, en donde se deposita un gramo de muestra.
Se preparan los controles negativo y positivo con cuatro rplicas, al igual que el
suelo problema (Kula y Larink, 1997).
Los contenedores se mantienen a una temperatura de 22 2 C, con un fotoperiodo de 18 h de luz y 6 de oscuridad (ISO, 1998). Las lombrices son alimentadas cada semana, adicionando un 5 % de mezcla de estircol equino y cachaza en
proporciones de 50:50.
A los 7 das de haber iniciado la prueba, se vaca el recipiente de cada una de
las rplicas sobre uno nuevo y se determina la mortalidad de las lombrices por la
ausencia de movimientos o reacciones ante estmulos de tacto. Posteriormente,
las lombrices supervivientes son colocadas de nuevo en los recipientes originales
de prueba para proseguir con el desarrollo de la prueba. Se mide el contenido de
humedad del suelo y, si es necesario, se ajusta nuevamente.
A los 28 das de prueba, las lombrices adultas son separadas para ser contadas y pesadas, y para examinar y registrar los cambios en su morfologa o
comportamiento ante los estmulos de tacto. Una vez contados, las lombrices
jvenes y los capullos (figura 2.8) se dejan en el contenedor durante las siguientes cuatro semanas.
Cada una de las rplicas y controles se revisa cada 7 das hasta finalizar los
56 das (8 semanas), para llevar un registro del nmero de lombrices muertas,
los movimientos, el peso y el nmero de capullos producidos por las lombrices
supervivientes. Al trmino de los 56 das, los contenedores se vacan para realizar
la cuenta de las lombrices jvenes y de los capullos. Las lombrices juveniles son
observadas para determinar sus movimientos y su peso, y tambin se pesan las
lombrices adultas. Se mide la humedad y el pH del suelo (EC, 2004; Cuevas-Daz
et al., 2008).
Para facilitar la cuenta de lombrices juveniles, los contenedores se pueden colocar en un bao mara a una temperatura de 50 a 60C; despus de 20 min, las
lombrices juveniles tienden a subir a la superficie, y as se pueden retirar para contarlas (ISO, 1998).
Clculos
Para evaluar los efectos en la reproduccin, se emplean los siguientes parmetros:
72
Reporte
Para elaborar el reporte, al igual que en las otras pruebas, se recomienda incluir los
siguientes puntos (USEPA, 1996a; ISO, 1998; OECD, 2004):
El tipo de contaminante presente en el suelo problema y su concentracin.
Las caractersticas del suelo problema (pH, contenido de humedad y capacidad
de campo) antes, durante y al trmino de la prueba.
Las caractersticas de los organismos de prueba (especie, nombre, edad al inicio
de la prueba, condiciones de cultivo, fuente de alimento, nmero de organismos utilizados en cada equipo de prueba, etc.).
Detalles de preparacin del suelo.
Descripcin de los contenedores usados y el volumen de suelo empleado.
E valuacin
73
Control de calidad
Los capullos, lombrices juveniles y adultas deben manipularse lo menos posible
para evitarles daos y estrs. Cuando la manipulacin sea necesaria, como en el
caso de mover los organismos del rea de cultivo al contenedor, se debe realizar de
forma rpida y correcta, utilizando guantes o pinzas con puntas redondas.
Se debe llevar el control de la humedad para evitar que la falta de esta afecte a
las lombrices. No debe presentarse una diferencia en humedad del suelo mayor del
10 % entre el inicio y el final (ISO, 1998).
Para que los resultados de esta prueba sean vlidos, la variacin en reproduccin
entre las rplicas del control negativo debe ser menor al 30 %, o su productividad
debe ser de al menos un promedio de 3 lombrices juveniles por adulto, y la mortalidad
del total de lombrices debe ser menor al 10 % despus de 28 das (Kula, 1997).
Tabla 2.3. Resumen de las condiciones recomendadas para la prueba de reproduccin con
lombrices de tierra
Tiempo de prueba
Temperatura
Contenido de humedad del suelo
pH del suelo
Alimento
74
56 das
22 2 C
45 a 70 %
6 a7
Estircol de equino y vacuno, residuos de
jardinera y cachaza
75
Edwards, C.A., Bohlen, P.J. 1992. Effects of toxic chemicals on earthworm. Reviews of
Environmental Contamination and Toxicology. 125, 23-99.
Elliot, P.W., Knight, E., Anderson, J.M. 1990. Denitrification in earthworm cast and soil
from pasture under different fertilizer and drainage regimes. Soil Biology and Biochemistry. 22: 601-605.
Environment Canada (EC). 2004. Biological Test Method: Tests for Toxicity of Contaminated Soil to Earthworms (Eisenia andrei, Eisenia fetida, or Lumbricus terrestris). Environmental Protection Series. EPS 1/RM/43 2004. Method Development and Application Section. Environmental Technology Center, Ottawa, Canad.
Feisthauer, N. 2003. Using earthworm behaviour to assess contaminated soil. Environmental Science and Engineering. www.esemag.com/archive/0503/earthworm.html.
Consultado en mayo de 2009.
Frnd, H.C., Butt, K., Capowiez, Y., Eisenhauer, N., Emmerling, C., Ernst, G., Potthoff, M.,
Schdler, M., Schrader, S. 2010. Using earthworms as model organisms in the laboratory: Recommendations for experimental implementations. Pedobiologia. 53, 119125.
Hamilton, M.A., Russo, R.C., Thurson, R.V. 1977. Trimmed Spearman-Karber method for
estimating median lethal concentrations in toxicity bioassays. Environmental Science
and Technology. 11, 714-719.
Hund, R.K., Wiechering, H. 2001. Earthworm avoidance test for soil assessments. Journal
of Soils and Sediments. 1, 15-20.
Hund, R.K., Achazi, R., Rmbke, J., Warnecke, D. 2003. Avoidance test with Eisenia fetida
as indicator for the habitat function of soil. Journal of Soils and Sediments. 3, 7-12.
Hund R.K, Lindemann, M. y Markus Simon, M. 2005. Experiences with Novel Approaches
in Earthworm Testing Alternatives. Journal of Soils and Sediments. 5, 233-239.
International Standard Organization (ISO).1998. Soil quality-effects of pollutants on
earthworms (Eisenia fetida).Parte 2. Determination of effects on reproduction. ISO11268-2(E). Suiza.
International Standard Organization (ISO). 2008. Soil quality-Avoidance test for determining the quality of soils and effects of chemicals on behaviour. Parte 1: Test with
earthworms (Eisenia fetida and Eisenia andrei).ISO-17512-1. Suiza.
Kapanen, A., Itvara, M. 2001. Ecotoxicity tests for compost applications. Ecotoxicology
and Environmental Safety. 49, 1-16.
Kaplan, D.L., Hartenstein, R., Neuhauser, E.F., Maleckit, M.R. 1980. Physicochemical requirements in the environment of the earthworm Eiseniafoetida. Soil Biology and Biochemistry. 12, 347-352.
E valuacin
77
Kula, C. 1997. Endpoints in laboratory testing with earthworms experience with regard
to regulatory decisions for plant protection products. En: Sheppard, S., Bembridge,
J.,Holmstrup, M., Posthuma, L. (editores). Advances in earthworm ecotoxicology. Society of Environmental Toxicology and Chemistry, EUA.
Kula, H., Larink, O. 1997. Development and standarization of test methods for the prediction of sublethal effects of chemicals on earthworms. Soil Biology and Biochemistry.
29, 635-639.
Lavelle, P. 1997. Faunal activities and soil processes: adaptative strategies that determine
ecosystem function. Advances in Ecological Research. 24: 93-132.
Meier, J.R., Chang, L.W., Jacob, S., Torsella, J. Meckes, M.C., Smith, M.K. 1997. Use of
plant and earthworm bioassays to evaluate remediation of soil from a site contaminated with polychlorinated biphenyls. Environmental Toxicology and Chemistry. 16:
928-938.
Organization for Economic Cooperation and Development (OECD). 1984. Earthworm,
Acute Toxicity Test. Guidelines for testing of chemicals. No. 207. Pars, Francia.
Organization for Economic Cooperation and Development (OECD). 2004. Earthworm
reproduction test (Eisenia fetida/Eisenia andrei). Guidelines for testing of chemicals.
No 222. Pars, Francia.
Ortiz, V. B y Ortiz, S.C.A. 1990. Edafologa. Univesidad Autnoma de Chapingo, Departamento de suelos. Chapingo, Mxico.
Phillips, T.M., Liu, D., Seech, A.G., Lee, H., Trevors, J.T. 2000. Monitoring bioremediation
in creosote-contaminated soils using chemical analysis and toxicity tests. Journal of
Industrial Microbiology and Biotechnology. 24, 132-139.
Presley, M.L., McElroy, T.C., Diehl, W.J. 1996. Soil moisture and temperature interact
to affect growth survivorship, fecundity, and fitness in the earthworm Eisenia fetida.
Comparative Biochemistry and Physiology A-Physiology. 114, 319-326.
Ricardo, T., Maitre, M.I. Rodrguez, A.R. 2010. Efectos subletales de la lambda-cialotrina
sobre Eisenia fetida (Annelida, Oligochaeta, Lumbricidae). Ciencia del Suelo. 28, 3946.
Ros, Y. 2005. Importancia de las Lombrices en la Agricultura. En: Nieves, D., Vivas, J.,
Zambrano, C. (editores). Sistemas integrados de produccin con especies no rumiantes. VIII Encuentro de Nutricin y Produccin de Animales Monogstricos. Universidad
Nacional Experimental de los Llanos Occidentales Ezequiel Zamora, Venezuela.
Salanitro, J.P. 1997. Crude oil hydrocarbon bioremediation and soil ecotoxicity assesssment. Environmental Science and Technology. 31, 1769-1776.
Santamara, R.S. 1996. Aspectos biotecnolgicos del proceso de lombricomposteo y su
78
E valuacin
79
Concentracin
(mg/kg)
Logaritmo natural
de la concentracin
Nmero de
lombrices
Nmero de muertes
Probabilidad de
muerte (p muerte)
Contenedor
1
2
10
50
3
200
4
800
5
3000
2.303
3.912
5.298
6.685
8.006
10
10
10
10
10
0
0
2
0.2
6
0.6
10
1
10
1
Posteriormente se establecieron intervalos de los logaritmos de las concentraciones y se calcul la frecuencia relativa de las muertes por diferencia de probabilidad en dichos intervalos (p muerte en 3.912 p muerte en 2.303 = 0.2 0 =
0.2).
Entonces se obtuvo la sumatoria del producto de la frecuencia relativa y el promedio de los intervalos (= 4.860) para calcular CL50= e4.860 = 129.024 mg/kg.
En la siguiente tabla se resumen dichos clculos.
1
80
Intervalos
del logaritmo
natural de la
concentracin
Frecuencia
relativa
(2.3033.912)
(3.9125.298)
(5.2986.685)
(6.6858.006)
Total
0.2
0.4
0.4
Promedio por
intervalo
2X3
=4.860
3.107
4.605
5.991
0.621
1.842
2.396
CL50= CL50= 129.024 mg/kg
e4.860
7.345
0
4.860
E valuacin
3.912
5.298
6.685
In de la concentracin
8.006
81
Se genera una nueva tabla de valores con probabilidades de 0.1 a 0.9, donde se conservan los valores logartmicos del intervalo de concentracin, pero se
recalculan las probabilidades considerando el recorte del 10 % que se hizo en el
lmite superior e inferior, quedando una p total del 80 % (0.8). Con este ajuste se
normaliza la probabilidad y se obtiene un rango que va nuevamente del 0 al 100
% (0 a 1). Con estos nuevos valores se establecen los intervalos de concentracin
y se sigue el procedimiento explicado anteriormente para calcular la CL50. La tabla
siguiente resume esos clculos.
Nuevos datos
Logaritmo natural de las
concentraciones
Nueva probabilidad (p-0.1)/0.8
1 Intervalos del logaritmo natural
de las concentraciones
Frecuencia relativa
3 Promedio por intervalo
2X3
=4.923
3.107
3.912
5.298
0
(3.1073.912)
0.125
3.509
0.439
LC50=
e4.923
0.125
0.625
(3.912(5.2985.298)
6.338)
0.5
0.375
4.605
5.818
2.302
2.182
CL50=137.414 mg/kg
6.338
1
Total
1
4.923
82
%
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0
3.72
4.16
4.48
4.75
5.00
5.25
5.52
5.84
6.28
1
2.67
3.77
4.19
4.50
4.77
5.03
5.28
5.55
5.88
6.34
2
2.95
3.82
4.23
4.53
4.80
5.05
5.31
5.58
5.92
6.41
3
3.12
3.87
4.26
4.56
4.82
5.08
5.33
5.61
5.95
6.48
4
3.25
3.92
4.29
4.59
4.85
5.10
5.36
5.64
5.99
6.55
5
3.36
3.96
4.33
4.61
4.87
5.13
5.39
5.67
6.04
6.64
6
3.45
4.01
4.36
4.64
4.90
5.15
5.41
5.71
6.08
6.75
7
3.52
4.05
4.39
4.67
4.92
5.18
5.44
5.74
6.13
6.88
8
3.59
4.08
4.42
4.69
4.95
5.20
5.47
5.77
6.18
7.05
9
3.66
4.12
4.45
4.72
4.97
5.23
5.50
5.81
6.23
7.33
%
99a
0.0
7.33
0.1
7.37
0.2
7.41
0.3
7.46
0.4
7.51
0.5
7.58
0.6
7.65
0.7
7.75
0.8
7.88
0.9
9.09
E valuacin
83
Responsable tcnico
Observaciones y comentarios
Datos iniciales
Fecha: ___ / ___ /___
Humedad pH Temperatura
(%)
(C)
Lombrices
vivas
Da 7
Da 14
Datos da 14
Fecha: ___ /___ / ___
Humedad pH
Temperatura Lombrices
(%)
(C)
vivas
Tipo
Porcentaje
Efectos subletales
(da 14)
Tipo de lombriz
84
Datos generales
Duracin de la prueba
Fecha de inicio
Tipo de lombriz
Tipo de contaminante
Datos especficos
pH de la muestra de suelo
Nmero de lombrices
Nmero de rplicas
Total de lombrices en el control negativo
Lombrices vivas en el control negativo
Observaciones y comentarios
Responsable tcnico
E valuacin
85
Introduccin
Las plantas son esenciales en los ecosistemas porque son las responsables de transformar la energa solar en energa qumica, al tiempo que absorben dixido de carbono. De esta manera proveen de alimento y oxgeno al resto de los organismos.
Adems, las plantas son uno de los componentes ms importantes de los ecosistemas terrestres porque proporcionan refugio y sitio de anidamiento para numerosos
organismos, y participan de forma primordial en el reciclaje de nutrientes y en la
estabilizacin de los suelos (Wang y Freemark, 1995).
El dao a las plantas por los contaminantes puede afectar directamente a la
estructura y la funcin de un ecosistema, al reducir la produccin primaria, incrementar el lavado y erosin del suelo y degradar el hbitat de la vida silvestre. Los
efectos letales de los contaminantes sobre las plantas pueden significar prdidas
ecolgicas y econmicas muy importantes; incluso los efectos subletales tienen un
impacto significativo sobre la produccin de alimentos y el desarrollo de la vegetacin natural, e implicaciones adversas para los organismos pertenecientes a niveles
superiores en la cadena alimenticia (Wang y Freemark, 1995).
En los bioensayos de toxicidad con semillas se evalan los efectos adversos
de los contaminantes en el proceso de germinacin y en el desarrollo de las plntulas durante los primeros das de crecimiento. Como respuesta se determina la
inhibicin en la germinacin y de la elongacin de la radcula y del hipoctilo. Es
87
medias (CE50), las cuales representan las concentraciones de los extractos de suelo
que ocasionan una inhibicin del 50 % en cada una de estas respuestas, comparadas con la respuesta mxima observada en el control negativo.
Material y equipo
Cajas de Petri
Contenedores de vidrio Pyrex de 150 x 75
mm
Vasos de precipitados Pyrex de 125 y 300
mL
Matraz Soxhlet
Matraz volumtrico de 100 mL
Papel filtro del No. 1 o 40
Pipeta graduada de 10 mL
Regla graduada o vernier
Matraz aforado de 500 mL
Balanza analtica
Cmara oscura con temperatura controlada
Horno
Reactivos
cido brico (H3BO3) con pureza > 98 %, de preferencia 99.5 %
Agua destilada
2,3,5-cloruro de trifeniltetrazolio con pureza > 98 %
Diclorometano grado HPLC
Hipoclorito de sodio (NaClO) al 5 % o blanqueador comercial
Sulfato de sodio anhidro (NaSO4) grado analtico
Soluciones
Solucin de cloruro de trifeniltetrazolio al 1 %. Pesar 10 g de 2,3,5-cloruro de trifeniltetrazolio y depositar en matraz aforado de 1000 mL, aforando y mezclando
suavemente con agua destilada. El pH debe estar entre 6 y 8.
Solucin de hipoclorito de sodio al 5 %. En un matraz aforado de 500 mL, adicionar
25 mL de NaClO y aforar con agua destilada, agitando lentamente. Se puede
utilizar blanqueador comercial, que contiene comnmente 6 % de hipoclorito.
Solucin de cido brico. Pesar 25 g de H3BO3, depositar en un matraz y aforar a
1 litro con agua desionizada.
E valuacin
89
Extractos de suelo
Se depositan 40 g de suelo en charolas de vidrio o aluminio para su secado a
temperatura ambiente (25-30 C) durante 48 h; no colocar al sol. Se realiza una
trituracin hasta obtener partculas finas y homogneas, con la finalidad de mejorar
la extraccin del hidrocarburo. Finalmente se coloca en un frasco limpio y seco.
Los extractos de suelo pueden ser preparados mediante la extraccin con diclorometano empleando el mtodo de Soxhlet. Para ello se mezclan de 5 a 10 g
de suelo seco y triturado. Se le adiciona sulfato de sodio anhidro en relacin 1:1
suelo:sulfato, y se deposita en un cartucho de celulosa. El cartucho se coloca dentro de la columna de extraccin del Soxhlet (USEPA, 1996b; Fernndez-Linares
et al., 2006). Se adicionan 140 mL de diclorometano en el matraz baln, y de 4 a
5 perlas de ebullicin para evitar proyecciones del disolvente por el calentamiento.
Las parrillas deben mantenerse a 55 C. A partir del primer reflujo, se cuenta el
tiempo para lograr un total de 6 reflujos por h durante 6 h.
Finalizada la extraccin, se pasa el matraz bola a un rotavapor y se evapora a
sequedad. Se recupera el concentrado en un vial de 50 mL; este concentrado sirve
como solucin para realizar las diluciones, en funcin de las concentraciones deseadas y de la concentracin existente en el suelo muestra.
Se preparan cinco concentraciones del extracto de suelo en orden logartmico,
por ejemplo 0.1 1, 10, 100, 1000 mg/L. Para ello, se usa la concentracin mayor
y de esta se preparan las diluciones. Por ejemplo, si se requieren 100 mL de extracto con una concentracin de 1000 mg/L y se parte de una de una concentracin
de 10000 mg/L, se toman 10 mL de esta solucin y se lleva a 100 mL con el
disolvente empleado. De la solucin de 1000 mg/L se toman 10 mL y se afora a
100 mL para obtener una concentracin de 100 mg/L, y as sucesivamente.
Organismos de prueba
En estos bioensayos se utilizan semillas de trigo (Triticum aestivum), sorgo
(Sorghum vulgare), maz (Zea mays), soya (Glycine max), lenteja (Lens culinari)
o jitomate (Lycopersicum esculentum). Todas las semillas deben ser certificadas o
de tipo orgnico. Como control de calidad de las semillas debe realizarse una prueba de viabilidad antes de realizar los ensayos de toxicidad. Una vez determinada la
viabilidad de los lotes de semillas, estos deben guardarse en recipientes a prueba de
humedad a 5 C, en oscuridad y ambiente seco.
90
Prueba de viabilidad
Antes de realizar los bioensayos de toxicidad, se deber determinar la viabilidad de
las semillas mediante el mtodo qumico de cloruro de trifeniltetrazolio (Moore,
1985) modificado. Este mtodo, tambin llamado prueba rpida de germinacin,
consiste en probar en un periodo de 24 a 48 h la capacidad de germinacin de un
lote (ms una rplica) de 50 semillas tomadas al azar.
Esta prueba se basa en la actividad de las enzimas deshidrogenasas, particularmente las deshidrogenasas del cido mlico, que reduce la sal de tetrazolio en
los tejidos vivos de las semillas. En esta reaccin los iones H+ son transferidos a la
referida sal. Cuando la semilla se sumerge en la solucin de cloruro de trifeniltetrazolio, ocurre la reaccin de reduccin en las clulas vivas y se forma un compuesto
de color rojo (trifenilformazn) que indica la presencia de actividad respiratoria en
las mitocondrias y, consecuentemente, que el tejido es viable. Los tejidos muertos
(no viables) no reaccionan con la solucin y conservan su color natural (Russi et
al., 2007).
Para llevar a cabo la prueba de viabilidad se siguen los pasos que a continuacin
se describen:
1 Se remojan 50 semillas de la especie seleccionada en agua destilada o en
papel filtro humedecido con agua destilada durante 4 a 18 h a temperatura
ambiente.
2 Si se usan semillas grandes, como las del maz, estas se tien en un vaso de precipitados de 250 mL adicionando aproximadamente de 150 a 200 a mL de la
solucin de cloruro de trifeniltetrazolio. Si son semillas ms pequeas, como las
de tomate, se utiliza un vaso de precipitado de 125 mL y se adicionan de 80 a
E valuacin
91
Desarrollo de la prueba
preparadas con el extracto de suelo. Se colocan 15 semillas de las especies seleccionadas en cada caja de Petri, dejando suficiente espacio entre ellas. En el caso del
control negativo, slo se adicionan 2 mL de agua destilada al papel filtro y se depositan las 15 semillas. De la misma manera, se prepara un tratamiento control con
el disolvente empleado para preparar los extractos del suelo (Fernndez-Linares et
al., 2006), as como un control positivo agregando 2 mL de la solucin de cido
brico (EC, 2005). Una vez preparadas, todas las cajas de Petri deben ser colocadas en la cmara oscura a una temperatura controlada de 22 2 C.
Cuando se observe que al menos el 65 % de las semillas en el control negativo
han germinado y sus radculas muestran un tamao de al menos 5 mm de largo,
deben evaluarse las variables de respuesta en todos los tratamientos. Para ello, se
extraen las plntulas de las cajas de Petri. Con la regla o el vernier se mide la altura
de las plntulas (longitud del hipoctilo) y la longitud de la radcula (figura 3.2).
Para determinar la produccin de biomasa, se pesan las plntulas en una balanza
analtica, para lo cual previamente se colocan en cajas de Petri y se meten en la
estufa a 75 C durante 20 a 24 h para eliminar la humedad.
Figura 3.2. Plntulas de trigo
E valuacin
93
Clculos
Una vez que los datos han sido registrados, se realizan los siguientes clculos:
El porcentaje de viabilidad de cada especie seleccionada.
El porcentaje de las semillas germinadas en cada especie.
El promedio, la desviacin estndar y el porcentaje de produccin de biomasa
y de elongacin de la radcula y el hipoctilo de las plntulas de cada especie
seleccionada.
Parmetros toxicolgicos
Con los datos de germinacin, produccin de biomasa y elongacin radicular y del hipoctilo, se elabora una curva dosis-respuesta donde se marcan los siguientes parmetros toxicolgicos: la CE50 (concentracin efectiva media), la NOAEC (concentracin
mxima en la que no se observan efectos adversos) y la LOAEC (concentracin mnima en la que se observan efectos adversos). La CE50 se calcula con el mtodo Probit
(USEPA, 1999a; Daz-Baez et al., 2004) o de Spearman-Karber recortado (Hamilton
et al., 1977) para cada una de las especies seleccionadas. Dichos mtodos se describen
en el captulo 2. Los valores de la NOAEC y la LOAEC se obtienen estadsticamente
mediante el anlisis de comparacin de medias por una prueba de Dunnett.
En este tipo de pruebas no se puede establecer con precisin la mortalidad
(CL50) de una plntula, por lo que se utilizan otros parmetros, como los ya descritos, que indiquen otros efectos txicos. Sin embargo, los bioindicadores, como
germinacin, produccin de biomasa y elongacin de raz y tallo, deben estandarizarse previamente, puesto que el software disponible est diseado para calcular
concentraciones letales (CL50). Para estandarizar los datos, la germinacin promedio de los tratamientos se establece como porcentaje en relacin al control, el cual
se asume como 100 %. Posteriormente, se consideran solo los efectos negativos,
que se obtienen calculando la disminucin del porcentaje de germinacin de los
tratamientos con respecto al control (100-% de germinacin con respecto al control). Con estos datos se construye la curva dosis-respuesta y se calcula la CE50
utilizando el software libre Trimmed Spearman Karber Method (USEPA, 1999b).
Antes de ingresar los datos en el programa, se establece que el nmero total
de individuos de prueba en el control y en cada concentracin de los tratamientos
equivale a 100 (100 %).
94
E valuacin
95
Tabla 3.2. Resumen de las condiciones recomendadas para las pruebas de semillas expuestas
a extracto de suelo
Duracin de la prueba
Temperatura
Condiciones de iluminacin
Recipientes de prueba
Cantidad de extracto de suelo requerida por rplica
Especie de prueba
Control negativo
Control positivo
14 das
22 2 C
Oscuridad hasta germinacin
Cajas de Petri con papel filtro humedecido
2 mL
Trigo (Triticum aestivum), sorgo (Sorghum vulgare),
maz (Zea mays), soya (Glycine max), lenteja (Lens
culinari) o jitomate (Lycopersicum esculentum)
15
3
Inhibicin de la germinacin, de la elongacin de
la radcula y el hipoctilo, y de la produccin de
biomasa
Agua destilada y el disolvente empleado en la
extraccin
cido brico
96
Material y equipo
Bolsas plsticas de 0.05 X 0.015 m o frascos de vidrio Pyrex con dimetro de 5.5 cm y
5 cm de altura
Cajas de Petri
Cristalizadores de vidrio de dimetro de 15
cm y 7.5 cm de altura, o de 8 cm de largo, 6
cm de ancho y 4 cm de altura
Matraz volumtrico de 100 mL
Papel filtro del No. 1 o 40
Pipeta graduada de 10 mL
Regla o vernier
Balanza analtica
Balanza granataria
Cmara con temperatura y fotoperiodo
controlados
Criba de malla 10 con abertura de 2 mm
Estufa
Mortero
Reactivos
Acetona o diclorometano grado HPLC
cido brico (H3BO3) con pureza mayor al 98 %
Agua destilada
Agua tipo II
Arena o suelo sin contaminar
2,3,5-cloruro de trifeniltetrazolio de 98 % de pureza
Hipoclorito de sodio (NaClO) grado analtico
Soluciones
Solucin de cloruro de trifeniltetrazolio al 1 %. Adicionar 10 ml de cloruro de trifeniltetrazolio en 500 ml de agua, mezclar y aforar a 1000 mL.
Solucin de hipoclorito de sodio al 5 %. Tomar 25 mL de NaClO y depositar en un
matraz aforado que contenga 100 mL de agua destilada, aforar a 500 mL con
agua destilada y mezclar.
Solucin de cido brico. Pesar 25 g de H3BO3, depositar en un matraz y aforar
a 1 litro con agua desionizada, mezclar depositando una barra magntica en el
matraz Erlenmeyer y agitar durante 15 min.
E valuacin
97
Suelo
Para las pruebas en las que solo se evala la toxicidad del suelo problema como
tratamiento nico, el suelo se seca a temperatura ambiente. Posteriormente se
tritura con un mortero para homogenizarlo y se criba para eliminar las piedras. Se
depositan 8 g de suelo en las bolsas de plstico, para facilitar el crecimiento de las
plantas. Se ajusta el contenido de humedad del suelo con agua destilada a un valor
entre el 28 y el 30 % de la capacidad de campo.
Para las pruebas en las que se evalan distintas concentraciones del suelo problema, este se mezcla con suelo similar al del sitio contaminado para obtener diluciones de 0, 25, 50, 75 y 100 %. Para ello se pesan 30 g de suelo de las diferentes
diluciones y se depositan en los frascos de vidrio (Meier et al., 1997). Otra forma
es realizar el bioensayo con el suelo contaminado y el suelo tratado (biorremediado) sin realizar mezclas. Cada tratamiento debe realizarse por triplicado.
Organismos de prueba
Para las pruebas directas en suelo, se recomiendan las mismas especies mencionadas anteriormente en este captulo.
Procedimiento
Prueba de viabilidad
Antes de realizar los ensayos de toxicidad, se debe probar la viabilidad de las semillas de las especies seleccionadas. Para ello se sigue el procedimiento descrito con
anterioridad en este captulo.
98
nico
99
semillas del control negativo (Saterbak et al., 2000). Despus de este periodo, las
plntulas se mantienen bajo un rgimen de 16 h de luz y 8 de oscuridad.
Dependiendo del ciclo de cada especie, se determina el porcentaje de germinacin despus de varios das. Un crecimiento de la radcula mayor a 5 mm se
considera un indicador de la germinacin. Diariamente se observan las plantas y se
anota cualquier cambio que se aprecie, como cambios en la coloracin o necrosis
de las hojas. Posteriormente, al finalizar la prueba, se determinan los parmetros de
produccin de biomasa y de elongacin del tallo y la raz, como se describi anteriormente en este captulo.
Durante toda la prueba es necesario mantener un contenido de humedad del
suelo de 70 5 % de la capacidad de campo (USEPA, 1996a). Para ello, cada
tercer da se adiciona agua tipo II (con una conductividad especfica 1.0 umhos/
cm a 25 C, cuenta total bacteriana de 0/mL y valor mximo de materia de 0.1
mg/l) a cada bolsa o frasco, en forma manual con una pipeta graduada o mediante
atomizacin, hasta alcanzar el peso exacto del suelo (considerando el peso de la
bolsa o el frasco).
Clculos
Al trmino de la prueba se realizan los siguientes clculos:
El porcentaje de viabilidad de las semillas estudiadas
El porcentaje de las semillas germinadas en cada especie seleccionada
El promedio, la desviacin estndar y el porcentaje de produccin de biomasa y
de elongacin de la raz y el tallo de las plantas de cada especie
Parmetros toxicolgicos
Con los datos anteriores se elabora una curva dosis-respuesta y se calculan los
parmetros toxicolgicos de la CE50, la NOAEC y la LOAEC para la germinacin,
la elongacin de la raz y el tallo y la produccin de biomasa. Los parmetros toxicolgicos se obtienen como se describi previamente, con la excepcin de que
los valores de concentracin quedarn expresados como porcentaje de adicin de
suelo contaminado, es decir, la CE50 equivaldr a la proporcin (%) de suelo contaminado que provoca el 50 % de disminucin de la germinacin con respecto a
un suelo control libre de contaminantes. La LOAEC sera la proporcin de suelo
contaminado mnima que genera un efecto adverso, y la NOAEC sera la propor100
Tipo de prueba
Temperatura
Duracin
Tipo de contenedores
Cantidad de suelo requerida por contenedor
Organismo prueba
E valuacin
Directa en suelo
22 2 C
De 10 a 21 das en funcin de la especie
Recipientes de vidrio de 4.5 cm de dimetro
y 7 cm de altura o bolsas plsticas
30 g
Trigo (Triticum aestivum), sorgo (Sorghum
vulgare), maz (Zea mays), soya (Glycine
max), lenteja (Lens culinari) o jitomate
(Lycopersicum esculentum)
10
De 3 a 4
Suelo no contaminado
cido brico
101
Control de calidad
El protocolo 208 de la OECD (1984) y la gua OPPTS 850.4200 de la USEPA
(1996a) establecen que deben considerarse los siguientes aspectos durante estas
pruebas:
Las pruebas de tratamientos mltiples deben contar con un mnimo de tres
concentraciones y un control negativo.
Se debe sembrar por rplica como mnimo cinco semillas, que deben ser lo ms
homogneas posible en cuanto a tamao.
El tamao de los recipientes de prueba debe ser adecuado para permitir el crecimiento normal de las semillas.
Las plantas deben ser regadas segn los requerimientos de su especie.
Debe buscarse que las semillas que se usen en estas pruebas presenten un porcentaje de germinacin mayor al 90 %, as como baja variabilidad (CV < 30 %) en
la elongacin de la radcula y el hipoctilo. Debe garantizarse que la germinacin
ocurra a la temperatura ptima de la especie y probar si este proceso de da mejor
en presencia o ausencia de luz.
Si no es posible tener un lote de semillas con una germinacin mayor o igual al
90 %, se debe aumentar el nmero de semillas por rplica hasta un mnimo de 18
semillas germinadas. Si existe variacin en elongacin de la radcula o del hipoctilo
en el control negativo, se debe aumentar el nmero de rplicas para reducir el error.
Si las semillas son de diversos tamaos, deben eliminarse los extremos, es decir, las ms grandes y las ms pequeas, y utilizar solo la fraccin de semillas de
tamao medio.
En el caso en que el control negativo no alcance ms del 50 % de germinacin,
debe repetirse la prueba, estableciendo seis concentraciones como mnimo (incluyendo aquellas en donde se encontr efecto adverso) y el control negativo.
Observaciones
La inhibicin de la elongacin de la radcula y el hipoctilo constituyen indicadores
subletales muy sensibles para la evaluacin de efectos biolgicos en vegetales, que
aportan informacin complementaria a la proporcionada al estudiar el efecto en la
germinacin.
102
Referencias
Adam, G., Duncan, H. 2002. Influence of diesel fuel on seed germination. Environmental
Pollution. 120, 363-370.
Daz-Baez, M.C., Bulus-Rossini, G.D., Pica-Granados, Y. 2004. Mtodos estadsticos para
el anlisis de resultados de toxicidad. En: Castillo, G. (editora). Ensayos Toxicolgicos y Mtodos de Evaluacin de Calidad de Aguas. Estandarizacin, Intercalibracin,
Resultados y Aplicaciones. Centro Internacional de Investigaciones para el Desarrollo,
Instituto Mexicano de Tecnologa del Agua. Mxico.
Del Valle, G.C., 2008. Calidad fisiolgica y efecto de la presencia de semillas verdes de
soja (Glycine max L) en lotes destinados a simiente. Tesis de maestra. Facultad de
Ciencias Agropecuarias, Universidad de Crdoba. Argentina.
Environment Canada (EC). 2005. Biological test method: test for measuring emergence
and growth of terrestrial plants exposed to contaminants in soil. EPS 1/RM/45/
2005 with 2007 amendments. Method Development and Application Section. Environmental Technology Center. Ottawa, Canad.
Fernndez-Linares, L.C., Rojas-Avelizapa, N.G., Roldn-Carrillo, T.G., Ramrez-Islas, M.E.,
Zegarra-Martnez, H.G., Uribe-Hernndez, R., Reyes-vila, R.J., Flores-Hernndez, D.,
Arce-Ortega, J.M. 2006. Manual de tcnicas de anlisis de suelos aplicadas a la remediacin de sitios contaminados. Instituto Nacional de Ecologa, Secretaria de Medio
Ambiente y Recursos Naturales. Mxico.
Hamilton, M.A., Russo, R.C., Thurson, R.V. 1977. Trimmed Spearman-Karber method for
estimating median lethal concentrations in toxicity bioassays. Environmental Science
and Technology. 11, 714-719.
International Standard Organization (ISO), 1993. Soil quality-Determination of the effects of pollutants on soil flora. Parte 1. Method for the measurement of inhibition of
root growth.ISO-11269-1. Suiza.
Kameswara, R.N., Hanson, Ehsan, D.M., Ghosh, K., Nowell, D., Larinde, M., 2007. Manual para el manejo de semilla en bancos de germoplasma. Bioversity International.
Organizacin de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentacin. Roma, Italia. http://www.bioversityinternational.org/fileadmin/bioversity/publications/pdfs/
1261.pdf. Consultado en agosto de 2011.
Lpez-Luna, J., Gonzlez-Chvez, M.C., Esparza-Garca, F.J., Rodrguez-Vzquez, R. 2009.
Toxicity assessment of soil amended with tannery sludge, trivalent chromium and
hexavalent chromium, using wheat, oat and sorghum plants. Journal of Hazardous
E valuacin
103
semillas de cebolla Allium cepa y soya Glycine max. 2008. En: Ramrez-Romero, P.,
Mendoza-Cant, A. (compiladoras). Ensayos toxicolgicos para la evaluacin de sustancias qumicas en agua y suelo. La experiencia en Mxico. Instituto Nacional de
Ecologa, Secretara de Medio Ambiente y Recursos Naturales. Mxico.
Wang, W., Freemark, K. 1995. Use of plants for environmental monitoring and assessment. Ecotoxicology and Environmental Safety. 30, 289-301.
E valuacin
105
Introduccin
El genoma es el conjunto de informacin gentica necesaria para el funcionamiento de un ser vivo; dicha informacin est codificada en las molculas de ADN.
Todos los componentes bsicos del ADN (bases nitrogenadas, azcares y grupos
fosfodisteres) son posibles blancos de alteraciones qumicas por agentes genotxicos, como algunos hidrocarburos aromticos policclicos (HAP) presentes en
el petrleo crudo y sus productos derivados (Albert, 2004).
La teora de la mutacin somtica del cncer establece que los daos del genoma que producen mutaciones son la base para el desarrollo de varios tipos de
cncer. Segn esta teora, un slo impacto en el ADN, ocasionado por algn agente
genotxico (en el sitio adecuado y que no sea reparado correctamente), puede
tener consecuencias severas para la clula. De manera general, estos impactos al
ADN se pueden dividir en mutaciones puntuales, aductos, aberraciones cromosmicas y rupturas de la molcula.
El ensayo cometa es una prueba ampliamente utilizada para detectar el
dao in vitro o in vivo causado al ADN por agentes genotxicos en clulas
individuales (Fairbairn et al., 1995; Rojas et al., 1999; Tice et al., 2000). Se
caracteriza por ser un mtodo sensible, rpido, sencillo, de bajo costo y aplicable
a varios tipos de clulas de eucariontes (Mckelvey-Martin et al., 1993; Collins
et al., 2008). Esta tcnica, descrita por Singh et al. (1988), permite analizar
107
la migracin del ADN debido a rupturas simples en la hebra del ADN y a sitios
lcali lbiles (Speit y Hartmann, 1999). Consiste bsicamente en analizar clulas individuales que son lisadas y sometidas a una electroforesis. Durante la
electroforesis los fragmentos de ADN migran fuera del ncleo celular hacia el
nodo y forman una cauda o cola que, al ser observada con el microscopio de
fluorescencia, tiene la apariencia de un cometa. La magnitud del dao es evaluada de acuerdo al nmero de clulas afectadas, a la longitud de la cola y a la
intensidad de la fluorescencia de los fragmentos. Con algunas modificaciones,
esta tcnica puede usarse para evaluar la induccin de enlaces cruzados (proceso de intercambio de secciones de ADN entre dos cromosomas) y la alteracin
de los mecanismos de reparacin y muerte celular (apoptosis) (Fairbairn et al.,
1995; Speit y Hartmann, 1999; Tice et al., 2000).
En este captulo se describir la tcnica del ensayo cometa para determinar el
dao al ADN en diferentes especies de fauna terrestre. Inicialmente se detallar el
mtodo usado en linfocitos humanos (Singh et al., 1988), y posteriormente se
mencionarn las adecuaciones realizadas para las especies de fauna silvestre que
fueron evaluadas (sapos y lombrices de tierra).
Campo de aplicacin
El ensayo cometa ha sido utilizado en estudios de monitoreo (Lebailly et al., 1997;
Dhawan et al., 2009) en sapos y lombrices de tierra con la finalidad de recabar
evidencia sobre el estrs ambiental al que han estado expuestos estos organismos
en sitios que presentan suelos contaminados con hidrocarburos.
Ensayo en linfocitos humanos
Material y equipo
Agitadores magnticos
Caja portalaminillas
Charola de aluminio de 30 x 20 cm
Chupones
Cubrebocas
Cubreobjetos de 24 x 50 cm
Frascos mbar de 250 y 500 mL y 1 L con
tapn
Frascos de vidrio para bao de 50 mL
Gasa
Guantes de nitrilo
Matraces aforados de 50, 250 y 500 mL y
1L
Micropipetas de 0.5-10, 5-50, 20-200 y
200-1000 L
Papel absorbente
Papel aluminio
Papel encerado
Papel filtro No. 1
Papel Parafilm
Pipetas Pasteur
Pipetas serolgicas de 5 y 10 mL
Pinzas de diseccin
Portaobjetos esmerilados de 25 x 75 mm
Probetas de 50 y 100 mL
Puntas para micropipetas de 0.5-250,
5-300 y 100-1000 L
Tijeras
Tubos Eppendorf de 2 mL
Tubos cnicos de 25 y 50 mL
Tubos Vacutainer con heparina
Estufa
Bao
Cmara de electroforesis
Fuente de poder
Agitador mecnico basculante para tubos
Balanza analtica
Bao mara
Cmara de electroforesis
Campana de extraccin
Cronmetro
Cuarto fro a 4 C
Horno de microondas
Lmpara de luz amarilla
Microscopio equipado con luz fluorescente
y el software Komet 4.0 (o con ocular
graduado)
Refrigerador
Placa de agitacin
Potencimetro
Vrtex
E nsayo
109
Reactivos
cido clorhdrico (HCl) grado analtico
cido etilendiaminotetraactico (EDTA) para biologa molecular
Agarosa de bajo punto de fusin para biologa molecular
Agarosa regular para biologa molecular
Agua desionizada
Bromuro de etidio grado analtico
Cloruro de sodio (NaCl) grado analtico
Dimetilsulfxido (DMSO) para biologa molecular, pureza 99.9 %
Etanol anhidro grado analtico
Hidrxido de sodio (NaOH) en perlas grado analtico
Triton X-100 grado analtico
Trizma Base grado analtico
Soluciones
Solucin de agarosa regular al 1 %. Se pesa 0.25 g de agarosa y se disuelve en 25
mL de agua desionizada. Para ayudar a disolverla se utiliza el horno de microondas a una temperatura de 30 C entre 7 y 10 s y se agita; de esta manera se
procede de forma repetitiva hasta que se disuelva completamente. La agarosa
se vierte en un frasco y se coloca en un bao a una temperatura de 50 C. De
preferencia, esta solucin debe prepararse cada vez que se realice un nuevo
ensayo.
Solucin de agarosa regular al 0.6 %. Se pesan 0.075 g de agarosa y se disuelven
en 12.5 mL de agua desionizada. Se realizan los mismos pasos que se describen para la solucin anterior. De preferencia, esta solucin debe prepararse
cada vez que se realice un nuevo ensayo.
Solucin de hidroxido de sodio 10 N. Se pesan 200 g de NaOH para disolverse en
500 mL de agua desionizada. La solucin se debe preparar en una campana de
extraccin con la ayuda de un bao mara y una placa de agitacin. Las perlas
de NaOH deben agregarse de forma paulatina en un vaso de precipitado con
agua desionizada hasta disolverse. La solucin se afora en un matraz de 500
110
111
Solucin de Trisma Base 0.4 M. Se pesan 12.12 g de Trisma Base para disolverse en
250 mL de agua desionizada. El Trisma deber agregarse de forma paulatina en un
vaso de precipitado con agua desionizada hasta disolverse. Se mezcla y se mide el
pH, el cual deber tener un valor de 7.5. La solucin puede prepararse con la ayuda
de una placa con agitador. Para ajustar el pH se utiliza la solucin de NaOH 10 N
o HCl concentrado, como se indic para preparar la solucin de lisis. La solucin se
afora en un matraz de 250 mL y se filtra con papel Whatman No. 1. Se almacena
en un frasco mbar debidamente etiquetado, en el cuarto fro (4 C).
Solucin de agarosa de bajo punto de fusin al 0.5 %. Se pesan 0.125 g de agarosa
de bajo punto de fusin y se disuelven en 25 mL de agua desionizada. Para
ayudar a disolverla se utiliza un horno microondas a una temperatura de 30 C
entre 7 y 10 s y se agita; de esta manera se procede de forma repetitiva hasta
que se disuelva completamente. La agarosa se vierte en un frasco y se coloca
en un bao a una temperatura de 37 C. De preferencia, esta solucin debe
prepararse cada vez que se realice un nuevo ensayo.
Solucin stock de bromuro de etidio. Se pesan 0.002 g de bromuro de etidio y se
disuelven en 10 mL de agua desionizada. Esta solucin debe ser protegida de
la luz directa, por lo que debe almacenarse en un frasco mbar o, en su defecto,
en un tubo cnico de polipropileno cubierto con papel aluminio. El manejo del
bromuro de etidio debe hacerse en todo momento con guantes de nitrilo, y
debe evitarse el contacto directo con la piel.
Solucin de trabajo de bromuro de etidio. A partir de la solucin stock de bromuro
de etidio, se toma 1 mL y se disuelve en 9 mL de agua desionizada. La concentracin final del bromuro de etidio deber ser de 0.05 mM. Esta solucin
debe ser protegida de la luz directa, por lo que debe almacenarse en un frasco
mbar o, en su defecto, en un tubo cnico de polipropileno cubierto con papel
aluminio. El manejo del bromuro de etidio debe hacerse en todo momento con
guantes de nitrilo, y debe evitarse el contacto directo con la piel.
Procedimiento
Preparacin de camas de electroforesis
Para la preparacin de las camas de electroforesis deben usarse guantes en todo
momento. Se colocan las laminillas con el esmerilado hacia arriba en un vaso de
precipitado con etanol anhidro, se tapan con papel Parafilm y se dejan por un tiem112
113
Electroforesis
En el cuarto fro se coloca la cmara de electroforesis en la mesa. Debe asegurarse
que la cmara est en posicin totalmente horizontal, y para ello se verifica que la
burbuja indicadora se encuentre en posicin centrada; de lo contrario, se ajustan
las patas hasta la posicin adecuada. Despus, la cmara se conecta a la fuente de
poder, de acuerdo con el color y la polaridad de los cables (rojo-positivo, negronegativo). El trabajo a partir de este momento debe realizarse en completa oscuridad y solo con ayuda de la lmpara de luz amarilla, con la finalidad de no daar el
ADN con la luz.
Se coloca la solucin de electroforesis en la cmara, hasta la plataforma por
ambos lados, sin que la solucin se junte. Despus se colocan las laminillas en la
cmara, tomndolas con las pinzas por la parte esmerilada y asegurndose de que
estn en la direccin correcta. Se vierte la solucin de electroforesis hasta cubrir las
laminillas, asegurndose de que no queden burbujas debajo de las laminillas. Las
laminillas se quedan en la solucin de electroforesis durante 20 min (tiempo de
desenrollamiento).
Mientras transcurre este tiempo, se configuran los parmetros de la fuente de
poder a 25 V, 300 A y 20 min. Transcurrido el tiempo, se coloca la tapa y se procede a encender la fuente de poder con los parmetros configurados previamente.
Se observa unos segundos la formacin de espuma y un valor constante de 300
A, lo que indica que la electroforesis se est llevando a cabo correctamente. Si el
valor de 300 A disminuye, se deber colocar ms solucin de electroforesis por un
costado de la cmara hasta obtener el valor deseado. Despus se coloca la placa
metlica que cubre la cmara. Una vez finalizado el tiempo de la electroforesis se
debe apagar la fuente, para quitar la tapa.
Las laminillas se sacan con las pinzas y se secan por debajo con papel absorbente. Las laminillas se colocan en la charola de lavados y se les agrega solucin
de Trisma Base 0.4 M, aproximadamente el volumen completo de una pipeta
Pasteur por muestra. Se dejan reposar 5 min y se repite el lavado. Se escurren y se
les agrega etanol anhidro, aproximadamente el volumen completo de una pipeta
Pasteur por muestra. Se dejan reposar 5 min ms y se repite el lavado con etanol.
Finalmente, las laminillas se escurren y son colocadas en el vaso Coplin con etanol
anhidro otros 5 min. Se sacan, se limpian por debajo con papel absorbente, se dejan
secar y se guardan en una caja portalaminillas.
114
Clculos
El panel de expertos del taller internacional de procedimientos y pruebas sobre
genotoxicidad (IWGTP, sus siglas en ingls) menciona que para reportar los resultados obtenidos mediante el ensayo cometa, es recomendable el uso de dos
medidas: el Olive Tail Moment (OTM, definido como el producto de la longitud de
la cola y la fraccin de ADN total de la cola. Solo se obtiene en caso de contar con
el software Komet 4) y las categoras de dao de acuerdo con la longitud de la cola
del cometa (las cuales se usan cuando no se cuenta con el software mencionado)
(Kumaravel et al., 2009) (figura 4.1).
Si el anlisis se lleva a cabo con el software Komet 4, se obtendr una serie de
parmetros (entre ellos el OTM), los cuales con generados de las diversas medidas
de dao que se toman de las clulas. En la figura 4.2 se muestra un ejemplo de
pantalla del software durante la medicin del dao en las clulas. Una vez finalizada
la cuantificacin del dao en las clulas se obtiene una hoja de clculo (figura 4.3)
E nsayo
115
Figura 4.1. Medicin del Olive Tail Moment (OTM) y categorizacin del dao de acuerdo
con la longitud (en micras) de la cola: 0 = sin dao; 1 = dao leve; 2 = dao moderado;
3 = dao alto; 4 = dao grave
en donde se tienen los datos de todos los parmetros obtenidos de cada una de las
clulas medidas por individuo, adems de algunas medidas estadsticas de tendencia central, dispersin y variabilidad de estos mismos parmetros por individuo.
Figura 4.2. Ejemplo de pantalla de software Komet durante la medicin de las clulas
116
E nsayo
117
Figura 4.3. Ejemplo de hoja de clculo obtenida de la cuantificacin del dao en las clulas
(n)
2
7
5
8
1
25.5
12.4
2.6
3.8
2
63.5
75.6
54.6
46.6
3
11
12.0
42.8
49.6
4
0
0
0
0
Clulas
analizadas
Scores
200
700
500
800
185.5
199.6
240.2
245.9
Volumen de muestra
Volumen de agarosa
Tiempo de desenrollamiento
Tiempo de electroforesis
Luz
Temperatura
Nmero de rplicas
118
15 L
225 L
20 min
20 min
Desenrollamiento y electroforesis en ausencia de luz
Desenrollamiento y electroforesis a 4 C
2
Sapos
Se recomienda el uso de los sapos ya que, por su ciclo de vida, durante su etapa
adulta se consideran organismos terrestres. Adems, la distribucin ecolgica
de estos organismos coincide con la presencia de muchos sitios impactados por
hidrocarburos en las costas del golfo de Mxico.
Para la captura de los organismos se propone utilizar trampas de barrera y embudo. Las trampas se pueden elaborar de material plstico como barrera y botes
de 20 L como recipientes de colecta. La trampa debe estar conformada por tres
vrtices con una extensin de 5 m por vrtice (figura 4.4). La tcnica de captura
consiste en colocar las trampas de barrera sobre las orillas de las riberas o de las
charcas. La disposicin de la trampa puede hacerse de forma lineal o de forma
cruzada, dependiendo del terreno. Deben ser colocadas por la tarde y revisadas en
el transcurso de la noche y por la maana. Tambin pueden realizarse trayectos
nocturnos en reas de 1 ha y recolectar los organismos con red y a mano. Los
organismos pueden irse colocando en cubetas y mantenerse ah hasta la toma de
muestras.
La muestra de sangre de los sapos (1 a 2 mL) puede obtenerse por puncin
cardiaca con jeringas heparinizadas. Posteriormente, la sangre se almacena en tubos Vacutainer con heparina y se mantienen en agitacin hasta que la muestra
est completamente homogenizada. Es importante recalcar que no debe utilizarse
EDTA como anticoagulante ya que puede lisar los eritrocitos de algunas especies
de anfibios y reptiles.
El ensayo se realiza siguiendo el mismo procedimiento descrito para los linfocitos humanos, a excepcin del volumen de sangre y los tiempos de desenrollamiento y electroforesis. Debido a la densidad de clulas nucleadas (eritrocitos) en
la sangre de los anfibios, es necesario diluirla. Para ello se toman alcuotas de 10 L
E nsayo
119
a)
b)
Lombrices
Se recomienda el uso de lombrices de tierra para este ensayo ya que, al ser componentes importantes del edafn (fauna del suelo), tienen un papel primordial
en los ciclos biogeoqumicos, en la aireacin y en la adicin de nutrientes al suelo. Adems, son organismos que viven en contacto directo con el suelo, que es
una de las matrices ambientales importantes cuando se realiza una evaluacin
120
Tabla 4.3. Resumen de las condiciones recomendadas para el ensayo cometa en eritrocitos
de sapo
Volumen de muestra
Volumen de agarosa
Tiempo de desenrollamiento
Tiempo de electroforesis
Luz
Temperatura
Nmero de rplicas
Nmero de clulas a evaluar
Respuesta a medir
10 L (1a dilucin)
15 L (2a dilucin)
300 L (1a dilucin)
225 L (2a dilucin)
5 min
10 min
Desenrollamiento y electroforesis en ausencia de luz
Desenrollamiento y electroforesis a 4 C
2
100 (50 por laminilla)
Olive Tail Moment (OTM) o longitud de la cola del
cometa
de riesgo. Los resultados de varios estudios ecotoxicolgicos muestran su utilidad como organismos bioindicadores de la salud del suelo (Ogunseitan, 2002;
Espinosa-Reyes et al., 2010).
La captura de las lombrices es manual; para ello se delimita un rea determinada en el sitio de estudio y posteriormente se trazan al azar varios transectos de
aproximadamente 50 m (la distancia puede variar dependiendo del sitio donde se
realice la colecta de los organismos). Con una pala de jardinera, se excava el suelo
para poder recolectar lombrices. Con la finalidad de estresar lo menos posible a los
organismos, se debe extraer un terrn completo (de aproximadamente 2 kg de
suelo). Posteriormente se coloca en una bandeja y se transporta al laboratorio.
En las lombrices, las clulas con las que se realiza el ensayo cometa se denominan celomocitos. Estos desempean en los invertebrados muchas de las funciones
de las clulas sanguneas de los vertebrados, tales como la defensa y la fagocitosis.
En las lombrices de tierra se obtiene una mezcla de celomocitos con medio de cultivo RPMI. Se utilizan 30 L de esa mezcla (procedimiento descrito ms adelante)
y se sigue el mismo mtodo de desenrollamiento y electroforesis que se describi
para linfocitos, pero se modifica el tiempo de desenrollamiento del ADN a 5 min y
el de electroforesis a 5 min.
E nsayo
121
Material y equipo
Para las pruebas con lombrices, adems del material y equipo mencionados para
los ensayos en linfocitos, se requiere de agujas de insulina.
Reactivos
Para las pruebas con lombrices, adems de los reactivos mencionados para los
ensayos en linfocitos (ver seccin 4.3.3), se requiere medio de cultivo comercial Roswell Park Memorial Institute (RPMI 1640).
Procedimiento
Obtencin de fluido celmico
colocacin de la
Volumen de muestra
Volumen de agarosa
Tiempo de desenrollamiento
Tiempo de electroforesis
Luz
Temperatura
Nmero de rplicas
Nmero de clulas a evaluar
Respuesta a medir
30 L
200 L (1 dilucin)
5 min
5 min
Desenrollamiento y electroforesis en ausencia de luz
Desenrollamiento y electroforesis a 4 C
2
100 (50 por laminilla)
Olive Tail Moment (OTM) o longitud de la cola de
cometa
Control de calidad
Para el adecuado desarrollo y la obtencin de resultados confiables con estos
ensayos, es necesario atender los siguientes aspectos:
Las soluciones de agarosa deben manejarse con cuidado para asegurar una adecuada migracin de las clulas durante la electroforesis. Hay que cuidar que no
hierva durante su preparacin; si esto sucede, se debe desechar. Se debe cuidar que
en las soluciones se disuelva por completo y que no deje residuos en suspensin;
esto se reconoce por su tonalidad completamente transparente. Si esto no sucede,
es necesario se prepararla de nuevo. Si la agarosa se solidifica antes de preparar las
laminillas o las clulas, la solucin debe prepararse de nuevo.
Para obtener una capa uniforme de agarosa, hay que tener cuidado de no pasar
muchas veces el dedo sobre la laminilla, pues esto podra causar migracin irregular
de las clulas.
Durante el manejo del bromuro de etidio debe evitarse el contacto debido a sus
propiedades genotxicas. Es necesario manejarse en todo momento con guantes
de nitrilo y evitarse el contacto directo con la piel.
E nsayo
123
Lebailly, P., Vigreux, C., Godard, T., Sichel, F., Bar, E., Letalar, J.Y., Henry, M., Gauduchon,
P. 1997. Assesment of DNA damage induced in vitro by etoposide and two fungicides
(carbendazim and chlorothalonil) in human lymphocytes with the comet assay. Mutation Research. 375, 205-217.
Mckelvey-Martin, V.J., Green, M.H.L., Schmezer, P., Pool-Zobel, B.L., De Mo, M.P., Collins
A. 1993. The single cell gel electrophoresis assay (comet assay): A European review.
Mutation Research. 288, 47-63.
Ogunseitan, O.A. 2002. Microbial Proteins as Biomarkers of Ecosystem Health. In: Scow,
K.M., Fogg, G.E., Hinton, D.E., Jonson, M.L. (editores). Integrated Assessment of
Ecosystem Health. Lewis Publishers. Boca Raton, Florida, EUA.
Rojas, E., Lpez, M.C., Valverde, M. 1999. Single cell gel electrophoresis assay: methodology and applications. Journal of Chromatography B. 722, 225-254.
Singh, N.P., McCoy, M.T., Tice, R.R., Schneider, E.L. 1988. A single technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Experimental Cell Research.
175, 184-191.
Speit, G., Hartmann, A. 1999. The comet assay (Single-cell gel test): a sensitive genotoxicity test for detection of DNA damage and repair. Methods in Molecular Biology.
113, 203-212.
Tice, R.R., Agurell, E., Andreson, D., Burlinson, B., Hartmann, A., Kobayashi, H., Miyamae,
Y., Rojas, E., Ryu, J.C., Sasaki, F. 2000. Single cell gel/Comet assay: Guidelines for in
vitro and in vivo genetic toxicology testing. Environmental and Molecular Mutagenesis. 35, 206-221.
E nsayo
125
del reporte. Para ello debe demostrar que mantiene y actualiza regularmente sus
equipos, que su personal es confiable, que cuenta con una adecuada formacin y
capacitacin, que conoce las tcnicas requeridas y que realiza revisiones peridicas
para detectar posibles desviaciones en los procedimientos.
Control de documentos
Debe establecerse un control de documentos que garantice el seguimiento adecuado de cualquier trmite a realizar. En estos documentos debe incluirse uno que
constate, antes de la realizacin de cada prueba, la competencia tcnica y humana
del laboratorio para realizarla; en este es necesario indicar el tipo de prueba que se
realizar, si el ensayo ha sido implementado en el laboratorio previamente o no, las
necesidades materiales, tcnicas y de personal capacitado para realizarlo, y la aceptacin o cancelacin de su realizacin de acuerdo con el anlisis efectuado.
Cadena de custodia
Como se recomienda en el caso de las evaluaciones de sitios contaminados (DazBaez et al., 2004), la validacin de las tcnicas de anlisis de muestras requiere
que durante el muestreo se documente toda la secuencia de personas que hayan
estado en posesin de la totalidad o parte de la muestras. Es necesario establecer
una cadena de custodia, la cual debe constar en los registros internos del laboratorio y debe contener al menos los siguientes datos: tamao de la muestra, lugar de
colecta, anlisis efectuado y nombre del analista.
de los clientes), debe llevarse a cabo una evaluacin del desempeo del personal con base en la trazabilidad y la incertidumbre de las pruebas que realizan. De
acuerdo con la poltica de la Entidad Mexicana de Acreditacin (EMA, 2011), el
clculo de la incertidumbre constituye una parte indisoluble de los resultados de
las mediciones; es un elemento indispensable de la trazabilidad de las mismas. Sin
embargo, dicho clculo no puede sustituir al pensamiento crtico, la honestidad
intelectual y la habilidad profesional. La evaluacin de la incertidumbre no es una
tarea de rutina, ni puramente matemtica; depende del conocimiento detallado de
la naturaleza de los mensurandos y de las mediciones. Por lo tanto, la calidad y la
utilidad de la incertidumbre indicada en los resultados de una medicin dependen,
en ltima instancia, del entendimiento, el anlisis crtico y la integridad de aquellos
que contribuyen a la asignacin de ese valor; es decir, de la capacidad y preparacin
del personal.
Aspectos relacionados con los organismos de prueba
Para controlar las variables que afectan a los organismos de prueba es muy importante tomar en cuenta los procedimientos establecidos para su cultivo y mantenimiento, y seguir estrictamente las indicaciones marcadas en ellos, con especial
nfasis en los siguientes puntos:
Condiciones ambientales
Debe darse un seguimiento adecuado de las condiciones en las que se cultivan o
mantienen los organismos y en las que se realizan los ensayos. As, el organismo seleccionado debe someterse a una etapa de observacin con la finalidad de garantizar
que no ha sido daado durante el transporte ni por el cambio de condiciones ambientales. Cualquier cambio en estas puede producir resultados equvocos. En el caso de
las pruebas de actividad enzimtica, por ejemplo, debe controlarse la temperatura, el
pH y el contenido de humedad del suelo de acuerdo con los requerimientos especficos para asegurar la actividad ptima de cada enzima (Moss, 1969).
129
Carta control
Para cada especie de organismos se debe contar con una carta control de la prueba,
en donde se lleve un registro histrico de su sensibilidad, de la estabilidad de su respuesta y de la repetibilidad de sus resultados. Las pruebas que muestren resultados
fuera de los lmites superior o inferior de esta carta control deben ser descartados.
Aspectos relacionados con el desarrollo de los ensayos
Condiciones generales
La condicin ideal es que los ensayos que se realicen sean pruebas estandarizadas,
es decir, que sus resultados demuestren estadsticamente que existe una relacin
directa entre la concentracin del compuesto txico al que se exponen y la respuesta biolgica de los organismos. Esto implica que el ensayo se realiza mediante
un mtodo normalizado o, en el caso en que el procedimiento empleado por el
laboratorio no cuente con esta caracterstica, se requiere su validacin mediante el
clculo de los parmetros estadsticos clsicos de toda prueba experimental, como
la media y la desviacin estndar, adems del coeficiente de variacin. Se deben
considerar adems las cartas control que nos permiten tener presentes los rangos
de validez de las mediciones, tomando en cuenta el intervalo de confianza del 95
% recomendado por los estadsticos. De acuerdo con Daz-Baez et al. (2004),
esta carta control es el medio de referencia para evidenciar el control de la sensibilidad de la especie empleada a un compuesto txico de referencia, de la estabilidad
de la respuesta biolgica y de la repetibilidad (exactitud) de los resultados. Se recomienda que estas mediciones se realicen con un mnimo de 5 lecturas y se vayan
incorporando datos hasta llegar a 20.
130
131
Todo el material, pero en especial la cristalera, debe sujetarse a un procedimiento de limpieza que garantice la ausencia de contaminacin. Para el caso del
material de vidrio se recomienda seguir el siguiente procedimiento:
Si el material se expone a compuestos txicos orgnicos, dos das antes de la
prueba se lava el material con detergente no inico adecuado para muestras biolgicas, se enjuaga con abundante agua, y se deja en solucin de mezcla crmica
(mezcla de 100 g de dicromato de potasio en un litro de cido sulfrico tcnico
diluido en una proporcin 1:4) cuando menos una hora (la mezcla crmica puede
ser sustituida por algn producto sin cromo, como el Sulfoclean o tambin se puede
emplear cido muritico comercial). Posteriormente se enjuaga con agua destilada
o desionizada, se escurre y se seca en la estufa a 110 C. Si la forma del material
dificulta su secado espontneo, como en el caso de las pipetas, se le adiciona acetona, la cual es eliminada mediante el secado en la estufa. Si el material se expone
a compuestos inorgnicos, se sumerge en cido muritico comercial (contiene del
30 al 32 % de cloruro de hidrgeno) cuando menos una hora, se enjuaga con agua
destilada o desionizada y se seca en la estufa a 110 C.
Una vez que el material ha sido lavado, debe protegerse del polvo, ya sea tapndolo con papel aluminio o guardndolo en estantes adecuados.
Reactivos
Salvo que otra cosa se especifique, todos los reactivos que se emplean deben ser
grado analtico ACS. Asimismo, los compuestos txicos de referencia que se usen
para evaluar la sensibilidad de los organismos de prueba o como controles positivos
en los ensayos deben ser certificados, presentar una pureza del 99 % y ser solubles
en agua. Estos ltimos deben usarse exclusivamente para los bioensayos. En cuanto a las concentraciones de los compuestos txicos de referencia, se debe emplear
un intervalo adecuado para evaluar la respuesta de los organismos.
El agua con la que se preparen las soluciones y diluciones, con la que se enjuague todo el material y con la que se mantengan o cultiven los organismos de
prueba debe ser de alta calidad, como el agua tipo I, en donde los compuestos o
elementos no son detectables prcticamente; as por ejemplo, la concentracin de
carbono orgnico total es menor de 100 gl-1, el contenido de bacterias menor de
10 UFC/mL, la conductividad elctrica de 0.056 Scm-1 y el contenido de slice
menor de 3 gl-1 (ASTM, 1991).
132
Soluciones
Debe garantizarse que las soluciones se encuentren correctamente preparadas e
indicar en su etiqueta el nombre de la solucin, su concentracin, fecha de preparacin y vencimiento, y nombre del laboratorista. Para el caso de soluciones para
volumetra, como por ejemplo cidos o bases, se debern valorar cuando sean utilizadas para corroborar su normalidad o molaridad.
Las soluciones deben almacenarse en recipientes de vidrio o plstico segn el
tipo de producto. Por ejemplo, se recomienda colocar las soluciones de hidrxido
de sodio (NaOH) en recipiente de plstico, para evitar efectos sobre el vidrio, o
almacenar las soluciones sensibles a la luz en frascos mbar. Tambin se deben
preservar en condiciones que impidan su degradacin, ya sea en refrigeracin, ausencia de luz, etc.
Para la preparacin exacta de una solucin deben utilizarse pipetas y matraces
volumtricos. Cuando sea posible, se pueden preparar soluciones madre o stock,
que posteriormente se diluyen en la proporcin adecuada para obtener las soluciones de trabajo (Harvey, 2002).
Para el caso de los compuestos txicos de referencia, sus soluciones patrn
deben ser valoradas con reactivos certificados antes de la realizacin de los ensayos
(Daz-Baez et al., 2004).
Rplicas y controles
En todos los ensayos debe garantizarse, como mnimo, la preparacin por triplicado
de todos los tratamientos. Esto permite obtener un adecuado nmero de datos
para el manejo estadstico de los resultados y para el clculo de los parmetros de
toxicidad, como la CL50 o la CE50. En cuanto al nmero de individuos por tratamiento, ste depende de las caractersticas del organismo en estudio; sin embargo,
debe seleccionarse considerando el nivel de significancia y el tipo de anlisis estadstico que se aplicarn.
En cada prueba se debe incluir un control positivo, a una concentracin cercana
a la CE50 o la CL50, y un control negativo, para conocer el porcentaje del efecto
mximo. En caso necesario, se debe incluir adems un control del vehculo empleado para disolver el contaminantes de inters. Tambin se debe incluir un blanco de
procedimiento, cuya respuesta de toxicidad no debe ser mayor al 10 %.
R equerimientos
133
Determinacin de la respuesta
En la mayora de la pruebas la respuesta que se mide es la mortalidad o ciertos efectos subletales. La muerte de los organismos es fcil de reconocer en casi todas las
especies; sin embargo, en ocasiones la observacin a simple vista no es suficiente,
por lo que se debe recurrir a estmulos mecnicos para determinar esta respuesta.
En lo que respecta a los efectos subletales, se debe tener en cuenta el comportamiento de los organismos, como por ejemplo la velocidad y la frecuencia de desplazamiento, la respuesta a estmulos mecnicos, o cualquier otra caracterstica propia
de la especie en estudio (Serrano, 2010).
Es importante mencionar que todos los aspectos anteriormente descritos se
encuentran relacionados y, por ello, debe darse un seguimiento puntual de todos,
de manera que se controle integralmente el desarrollo de las pruebas y se garantice
la obtencin de resultados confiables.
134
Referencias
American Society for Testing and Materials (ASTM). 1991. Estndares de calidad de agua.
Wasserlab. D1193-91. http://www.wasserlab.es/castellano/PDF/estandares_calidad_agua.pdf. Consultado en agosto de 2011.
Daz-Baez, .M.C., Sobrero, C., Pica Granados, Y. 2004. Aseguramiento y control de calidad
de bioensayos. En: Castillo, G. (editora). Ensayos Toxicolgicos y Mtodos de Evaluacin de Calidad de Aguas. Estandarizacin, Intercalibracin, Resultados y Aplicaciones. Centro Internacional de Investigaciones para el Desarrollo, Instituto Mexicano de
Tecnologa del Agua. Mxico.
Eijsackers, H. 1997. Soil ecotoxicology: Still new ways to explore or just paving the road.
En: Van Straalen, N.M., Lokke, H. (editores). Ecological Risk Assessment of Contaminants in Soil. Chapman and Hall. Londres. Inglaterra.
Entidad Mexicana de Acreditacin (EMA). 2011. Poltica de Incertidumbre en mediciones. http://www.ema.org.mx/descargas/ensayos_aptitud/politicas/politica_intertidumbre_mediciones.pdf. Consultado en febrero de 2011.
Harvey, D. 2002. Qumica Analtica Moderna. Mc Graw Hill. Espaa.
International Organization for Standardizations (ISO). 2003. Soil Quality. Guidance on the
ecotoxicological characterization of soils and soil materials. ISO 15799:2003. Suiza.
Moss, A. D. 1969. Accuracy, precision and quality control of enzyme assays. Journal of
Clinical Pathology. 24, 22-30.
Diario Oficial de la Federacin (DOF). 2006. Norma Mexicana NMX-EC-17025IMNC-2006, evaluacin de la conformidad. Requisitos generales para la competencia
de los laboratorios de ensayo y calibracin. Publicado el 24 de julio.
Serrano, G.R. 2010. Introduccin al anlisis de datos experimentales. Tratamiento de datos en bioensayos. Universitat Jaume I. Espaa.
United States Environmental Protection Agency (USEPA). 2009. Soil Toxicity and Bioassessment. Test Method for Ecological Risk Assessment. Office of Environmental
Health Hazard Assessment. EUA.
R equerimientos
135