Centro de Estudios Superiores en Estomatologa y Salud

Microbiologa

Berenice Venegas Meneses

Aylin Athziri Bustamante Fosado

Tcnicas Utilizadas en Biologa Celular

01/06/16

Tcnicas Utilizadas en Biologa Molecular

Western Blot
Western Blot es una tcnica analtica, ampliamente utilizada, para el estudio de
protenas. Este mtodo, descrito por primera vez por Towbin, permite la deteccin
de una sola protena dentro de una muestra biolgica. La especificidad de Western
Blot se logra mediante la utilizacin de un anticuerpo que reconoce y se une a un
eptopo nico de la protena de inters. Con la tcnica de Western Blot se puede
estimar el tamao de una protena, confirmar la presencia de modificaciones posttraduccionales

como

la

fosforilacin,

ser

utilizado

para

comparar

cuantitativamente los niveles de protena entre muestras. Esta gua de laboratorio

describe los pasos involucrados en la realizacin de un Western blot, incluyendo la
preparacin de muestras, la separacin de protenas, la transferencia y la
deteccin.
Visin General
a. Preparacin de la muestra: Extraccin de las protenas de las muestras
biolgicas mediante disrupcin mecnica o qumica.
b. Electroforesis en gel de Acrilamida: Las protenas en el extracto se separan
de acuerdo a su tamao mediante electroforesis. Se prepara un gel de
acrilamida, bisacrilamida. El dodecilsulfato de sodio (SDS) aadido al gel se
une a las protenas y confiere, de forma proporcional a la masa de cada

protena, una carga negativa a cada una de ellas.

c. Transferencia electrofortica a una membrana: Las protenas son

transferidas electroforticamente a un soporte rgido o membrana, dnde
quedan inmovilizadas.
d. Hibridacin del Anticuerpo: La membrana con las prote- nas inmovilizadas
debe tratarse para bloquear las zonas con ausencia de protenas y as
evitar la unin no especfica de los anticuerpos. A continuacin se incuba
con un anticuerpo primario dirigido contra el eptopo especfico de la
protena diana. Tras varios lavados de la membrana, se adiciona un
anticuerpo secundario marcado que se unir de forma especfica al
anticuerpo primario, proporcionando una forma de deteccin.
e. Deteccin de las Bandas: Despus de un lavado de la membrana para
eliminar el anticuerpo no unido, se procede a detectar la localizacin de la
banda en la membrana. Para la deteccin de quimioluminiscencia, se utiliza
un anticuerpo secundario conjugado con el enzima peroxidasa (HRP); la
adicin de un sustrato de HRP provoca una reaccin enzimtica que da
como resultado final la emisin de luz. Dicha luz puede ser detectada en
una pel- cula de rayos X, o de forma digital, mediante un sistema de
captacin de imgenes. La deteccin de fluorescencia se basa en la
captacin de luz emitid por sustancias fluorforas conjugadas con el
anticuerpo secundario.

Southern Blot
La tcnica de Southern Blot desarrollada en Edimburgo por E.M. Southerm,
permite identificar regiones especficas de ADN que han sido fragmentadas
por una enzima de restriccin. El ADN se separa mediante electroforesis en
gel de agarosa. Tras teirlo con bromuro de etidio, el gel se fotografa bajo
luz ultravioleta. Posteriormente se trata con hidrxido sdico o a altas
temperaturas para desnaturaliza el ADN y romper la unin entre sus dos
cadenas. Entonces el gel se neutraliza con un buffer adecuado. En una
cubeta se extiende una pieza de papel de filtro grueso sobre un soporte
elevado, con los extremos del papel de filtro sumergidos en una solucin
altamente salina. Se sita el gel sobre la pieza de papel de filtro y sobre el

gel se coloca una membrana de nylon especial. Encima de todo ello se

pone una pila de toallas de papel. Por ltimo se presionan todas las capas
con un peso. La solucin altamente salina asciende a travs de la pieza de
papel y atraviesa el gel por accin capilar, llevando consigo el ADN
desnaturalizado. El ADN es transportado hasta la membrana de
nitrocelulosa, a la cual se adhiere. De este modo el filtro se convierte en
una rplica del gel original. Cuando se ha completado la transferencia, el
ADN puede ser irreversiblemente unido al filtro mediante calor o exposicin
a luz ultra violeta. El producto del Southern puede ser hibridado con una
sonda de ADN marcada radiactivamente especfica para el gen o regin del
ADN objeto de estudio. Despus de varias horas en contacto con el filtro se
elimina la sonda. La localizacin de la unin de la sonda con el filtro se
identifica mediante una autorradiografa. Para determinar el tamao del
fragmento de restriccin que contiene la secuencia de inters, se puede
hacer una comparacin con marcadores de peso molecular en un gel de
agarosa.
El mtodo consta bsicamente de las siguientes etapas:
El ADN vegetal es extrado de las clulas y dirigido con una o ms

enzimas de restriccin.
Los productos de la digestin del ADN son separados de acuerdo a

su tamao, mediante electroforesis en geles de agarosa.

El ADN, que ahora se encuentra en el gel, es desnaturalizado y
transferido a una membrana de nitrocelulosa. Las posiciones
relativas de los fragmentos de ADN en el gel se mantienen cuando el

ADN es transferido a la membrana.

El ADN es fijado a la membrana mediante la exposicin a la luz

ultravioleta, o por medio de altas temperaturas (80C)

El ADN ligado a la membrana es hibridado con una sonda de ADN o
ARN, que posee homlogos a la sonda puede ser detectada
mediante autorradiografa o colorimetra, dependiendo del tipo de
sonda utilizada.

Esta tcnica suministra la prueba molecular de la integracin del gen exgeno en

el genoma de la planta. La PCR tambin puede ser empleada para tal fin, pero su
confiabilidad es menor, ya que por causa de su alta sensibilidad, puede detectar
falsos positivos, mediante la amplificacin de pequeas cantidades de ADN
contaminante.

Northern Blot
El Northern blot es una tcnica de separacin de ARN. Gracias a ella podemos a
partir de una muestra biolgica, de cualquier organismo, podemos aislar un ARN
en particular si conocemos al menos parte de su secuencia. Adems permite
separar los ARN dependiendo de su tamao.
El Northern blot surge como variacin del Southern blot, una tcnica similar creada
para separar molculas de ADN. El Southern recibe su nombre de su creador, E.
Southern. El Northern se denomin de esta manera como oposicin (norte y sur)
al Southern. La tcnica para separar el ARN fue diseada por James Alwine, David
Kemp y George Stark, a finales de la dcada de 1970. Adems existen otras
tcnicas basadas en la misma tecnologa para separar protenas, el western, o
ARN

con

modificaciones

postranscripcionales,

el

Eastern

blot,

etc.

Para poder realizar un Northern blot es necesario el conocimiento previo de

algunas tcnicas de laboratorio. Para empezar la muestra biolgica ha de ser
sometida a un tratamiento de extraccin de ARN, eliminando las protenas y el
ADN . EL ARN es muy sensible a la degradacin y por eso se ha de trabajar en
condiciones de esterilidad mayores de las habituales en un laboratorio. Las
ARNasas, enzimas capaces de degradar el ARN son altamente frecuentes.
Una vez extrado el ARN de la muestra, ste queda en suspensin en agua. A
continuacin

lo

cargaremos

en

un gel

de

agarosa al

que

se

ha

aadido formaldehido para que el ARN pierda su estructura secundaria. De esta

manera corre en el gel dependiendo de su tamao exclusivamente. Puedes leer

ms sobre los geles de agarosa en nuestro artculo aqu (prximamente). Si el

ARN

que

queremos

separar

es

de pequeo

tamao puede

utilizarse poliacrilamida en lugar de agarosa. De esta manera puede conseguirse

un dimetro de poro menor.
Una vez separados los ARNs segn su tamao es el momento de hacer el blot.
Para ello utilizaremos una membrana de nailon u otro material capaz de retener
fuertemente las molculas de ARN. Normalmente los enlaces que se establecen
entre el ARN y la membrana son covalentes. El paso del ARN desde el gel a la
membrana se realiza con corriente continua para aumentar su velocidad.
La membrana se coloca sobre el gel. Y se embebe todo en un buffer salino que
mejorar la conductividad del proceso. As mientras los ARN van del gel hasta la
membrana los ARN mantendrn su separacin por peso.
Utilidad: Tras la transferencia la membrana puede revelarse con sondas
especficas

de

un

ARN

concreto para

comprobar

que

ese ARN se

estaba expresando en el tejido del que proviene la muestra. Su uso para

establecer patrones de expresin de diferentes ARN en un tejido y poder comparar
la expresin entre tejidos es muy extendido. Gracias al Northern podemos separar
diferentes productos de splicing alternativo de un mismo gen o ver bajo
qu circunstancias ambientales se expresar un gen de inters.
El Northern blot es una tcnica que lleva muchos aos usndose. El nico
problema

que

presenta

es

Existen alternativas modernas

la fragilidad
al

Northern.

del
Por

ARN

durante

ejemplo

el

proceso.

los microarrays

la qPCR (PCR cuantitativa), aunque estas tcnicas solo mostrarn la cantidad de

ARN, por lo que no separaran los diferentes tamaos de ARN.

PCR
PCR son las siglas en ingls de Polymerase Chain Reaction o Reaccin en
Cadena de la Polimerasa. La idea bsica de la tcnica es sintetizar muchas veces
un pedazo o fragmento de ADN utilizando una polimerasa que puede trabajar a
temperaturas muy elevadas, ya que proviene de la bacteria Thermus aquaticus

que vive a altas temperaturas (79C a 85C), de ah su nombre comercial ms

conocido: taq polimerasa. Cuando hacemos una reaccin de PCR simulamos lo

que sucede en una clula cuando se sintetiza el ADN y en el tubo se mezclan
todos los ingredientes necesarios para hacerlo: la polimerasa, el ADN del
organismo que queremos estudiar donde se encuentra el fragmento que
queremos sintetizar , los oligonucletidos (llamados tambin primers, iniciadores,
cebadores, oligos, etc.) necesarios para que se inicie la transcripcin,
dinucletidos

(dNTPs),

las

condiciones

para

que

la

enzima

trabaje

adecuadamente (cierto pH, determinadas cantidades de magnesio en forma de

MgCl2 , KCl, y pueden necesitarse otras sales o reactivos, dependiendo de cada
polimerasa). Esta tcnica tan ingeniosa tiene muchsimas aplicaciones distintas y
se ha convertido en una herramienta muy importante en la biologa molecular; sus
aplicaciones van desde la gentica de poblaciones, evolucin molecular y
genmica hasta la medicina forense.
Etapas de la PCR.
Desnaturalizacin: Para que pueda iniciarse la reaccin es preciso que las
molculas de ADN molde se encuentren en forma de cadena simple. Esto se
consigue calentando a temperatura de 90 a 95C para que produzca la rotura de
los enlaces puente de hidrogeno intercatenarios y la separacin de ambas
cadenas, para asegurar la completa separacin de la doble cadena del ADN esta
temperatura debe mantenerse unos minutos. Si el ADN solo se desnaturaliza
parcialmente este tendr a renaturalizarse muy rpidamente dificultando con esto
el proceso de hibridacin.
Hibridacin: Una vez que el ADN esta desnaturalizado se disminuye la
temperatura de la reaccin hasta un rango comprendido entre los 40 y los 60C
para que se pueda producir la hibridacin especifica de los cebadores

a las

secuencias flanqueantes del fragmento que se desea amplificar, la temperatura a

la que se realiza esta etapa debe establecerse para cada reaccin en funcin de la

longitud delos cebadores y su secuencia (Temperaturas inferiores a la ptima nos

producir hibridaciones inespecficas de los cebadores y temperaturas superiores

nos dificultaran la eficiencia de la misma.)
Extensin: Durante esta etapa la ADN polimerasa termoresistente incorpora
nucletidos en el extremo 3 del cebador utilizado como molde la cadena de ADN
previamente desnaturalizada. La temperatura a la que se realiza esta etapa de la
reaccin suele ser de 72C ya que es la temperatura a la que la Tag polimerasa
alcanza su mxima actividad. Normalmente una extensin de 20 segundos es
suficiente para fragmentos menores de 500 pares de bases, y de 40 segundos
para fragmentos por encima de 1.2Kb. Al finalizar cada uno de los ciclos el nmero
de copias obtenidas se duplica y despus de 20 ciclos ya tenemos
aproximadamente 1 milln de copias de cada una de las molculas molde iniciales
ADN.

Bibliografa
Anderson, M. (1990) Perfecting the polymerase chain reaction. Laboratory
Equipment Digets. 1: 30-31
Watson, J, D.; Baker, T. A.; Bell, S. P.; Gann, A.; Levine, M. et Losick, R
(2004). Molecular Biology of the Gene (Fifth edition edicin)
Southern, E.M. (1975): "Detection of specific sequences among DNA fragments
separated by gel electrophoresis", J Mol Biol., 98:503-517.
Western blot antibody. exactantigen.com. Consultado el 20 de agosto de 2010.
Labome lists 449244 antibody products against 41374 genes, including 15695

human, 11355 mouse, and 9387 rat genes.