Revista Mexicana de Ciencias Farmacuticas

ISSN: 1870-0195
rmcf@afmac.org.mx
Asociacin Farmacutica Mexicana, A.C.
Mxico

Bustamante C., Patricia; Mayorga R., Lino; Ramrez S., Hugo; Martnez C., Patricia; Barranco F.,
Esteban; Azaola E., Alejandro
Evaluacin microbiolgica de compuestos con actividad prebitica
Revista Mexicana de Ciencias Farmacuticas, vol. 37, nm. 2, abril-junio, 2006, pp. 5-10
Asociacin Farmacutica Mexicana, A.C.
Distrito Federal, Mxico

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Trabajo Cientco

Evaluacin microbiolgica de compuestos

con actividad prebitica
Microbiological evaluation of compounds with prebiotic activity
Patricia Bustamante C., Lino Mayorga R., Hugo Ramrez S., Patricia Martnez C.,
Esteban Barranco F. y Alejandro Azaola E.
Universidad Autnoma Metropolitana. Departamento Sistemas Biolgicos

RESUMEN: Se determin el crecimiento y la tasa especca de crecimiento para varias cepas de Bidobacterias y de bacterias
cido lcticas cultivadas en glucosa y en dos compuestos prebiticos: ranosa e inulina. El crecimiento de las bacterias cido
lcticas fue similar en inulina y ranosa pero menor que en glucosa (P < 0.05). Las bidobacterias mostraron mejor crecimiento
en ranosa con respecto a glucosa e inulina. Estos resultados muestran que la ranosa es mejor prebitico que la inulina para
las distintas especies de bidobacterias, consideradas probiticas.
ABSTRACT: Growth and specic growth rate were determined for several bidobacteria and lactic acid bacteria cultured on
glucose and prebiotic compounds ranose and inulin. Lactic acid bacteria growth was similar on inulin and ranose but lower
than glucose. Bidobacteria showed a better growth in presence of ranose than glucose or inuline. These results showed
that ranose is a better prebiotic compound than inulin for Bidobacterium spp.
Palabras clave: Bidobacteria, bacterias cido lcticas, prebiticos,
probiticos

Key words: Bidobacteria, lactic acid bacteria, prebiotics, probiotics

Correspondencia:
Dr. Alejandro Azaola
Universidad Autnoma Metropolitana Unidad Xochimilco.
Depto. Sistemas Biolgicos. Calz. del Hueso 1100, Coyoacn
04960, Mxico D.F.
Tel 5483 7377, Fax 5483 7237
e-mail: azaola@correo.xoc.uam.mx

Introduccin

Fecha de recepcin: 27 de noviembre de 2005

Fecha de aceptacin: 15 de marzo de 2006

El tracto gastrointestinal de mamferos est habitado por una

comunidad compleja de microorganismos que el husped necesita para mantener un estado de equilibrio. Esta microbiota est
conformada por bacterias autctonas que estn presentes durante
toda la evolucin del individuo, que se establece para conformarse
en microbiota normal en tejidos o sistemas particulares y por
bacterias alctonas que son transitorias y conviven con la anterior
pero que en ciertas condiciones pueden ser patgenas1.
El nmero de bacterias asociadas al cuerpo humano rebasa
en un orden de magnitud a las clulas del cuerpo1 y es el tracto
gastrointestinal, quien contiene el mayor nmero de bacterias con
una organizacin muy compleja y con ms de 400 especies 1, 2, y con
1010 a 1011 bacterias por gramo de heces. Las clulas anaerobias y
las facultativas estn presentes en mayor cantidad, con un orden de
magnitud de 100 a 1000 veces mayor a las dems3 y las diferencias
en poblacin bacteriana entre humanos son altas y dependen en
gran manera de los hbitos alimenticios.

Volumen 37 No. 2 abril - junio 2006

En general, los mamferos nacen sin microorganismos y la colonizacin se inicia cuando tejidos y rganos como la piel, el tracto
respiratorio, gastrointestinal y genitourinario son expuestos en el
canal vaginal de la madre o al medio ambiente durante el nacimiento.
Las bacterias que colonizan ms rpidamente son las que pueden
reproducirse a mayor velocidad con los sustratos que encuentran.
Conforme esos primeros sustratos decrecen, se limita la variedad
de especies y aumenta la complejidad de la microbiota. En nios
recin nacidos (RN), Escherichia coli, Clostridium spp, Streptococcus spp,
Lactobacillus spp, Bacteroides spp y Bidobacterium spp predominan4,5.
Las bidobacterias son el gnero que en nios RN amamantados
conforman hasta el 90% de la microbiota intestinal6 y durante la
etapa adulta, por el cambio de alimentacin, llegan a ser hasta el 25%
de la total7 y son stas junto con Lactobacillus, las que se consideran
como bencas8. Usualmente las bidobacterias que aparecen inmediatamente despus del nacimiento en nios amamantados son
Bidobacterium longum, B. infantis y B. breve9 y entre las bacterias
cido lcticas, Lactobacillus acidophilus y L. reuteri10.
La alta presencia de bidobacterias en nios amamantados se
debe a que la leche materna contiene una gran cantidad de azcares
y entre ellos, los oligosacridos, son los azcares que parecen ser
utilizados principalmente por las bidobacterias y las bacterias cido
lcticas11. El uso de oligosacridos, fructooligosacridos e inulinas
en frmulas lcteas estimula la presencia de las bacterias que ayudan
a aumentar el bienestar de las personas8.
Actualmente en Mxico existe gran cantidad de productos
farmacuticos, alimenticios y complementos que contienen estos
azcares. Japn es uno de los principales productores y consumidor
de estas sustancias tambin conocidas como bras dietticas. Entre
ellas se encuentran los fructooligosacridos como la inulina, los galactooligosacridos, lactulosa, lactosacarosa y los isomaltooligosacridos,
que tienen como caracterstica que no son metabolizados por el organismo del husped pero estimulan selectivamente la proliferacin
de bacterias probiticas.Tambin existen productos simbiticos que
combinan bacterias probiticas con sustancias prebiticas. En ambos
casos, se utilizan para disminuir disturbios intestinales como diarreas,
provocados por rotavirus o por el uso exagerado de antibiticos y su
uso tiene como propsito renovar la microora intestinal benca.
Sin embargo, la efectividad de las sustancias prebiticas para estimular el crecimiento y proliferacin de la microora benca debe
ser probada en distintas condiciones tanto in vivo como in vitro8. El
propsito de este trabajo fue evaluar el efecto prebitico in vitro de
la inulina y ranosa sobre el crecimiento y la capacidad de adaptacin
de bidobacterias y bacterias cido lcticas

Material y mtodos
Microorganismos y condiciones de cultivo
Los microorganismos utilizados fueron Bidobacterium bidum,
B. lactis Bb-12, B. infantis ATCC 17930, B. breve ATCC 15700,

B. animalis ATCC 25527, B. animalis 27536, B. longum ATCC

15707, B. adolescentis ATCC 15703, y las bacterias cido lcticas
Lactobacillus rhamnosus ATCC 9595-M, L. johnsonii C4, L. acidoplillus ATCC 4356, L. sporogenes y Streptococcus thermophillus
FYE-41. Todas las cepas se conservaron a 70C en una solucin
de glicerol al 20% y leche descremada al 10%. Las cepas fueron
activadas en caldo MRS (Difco) adicionado con L-cistena
0.05% (p/v) (Sigma), Na2CO3 0.02% y CaCl2.7H2O 0.01%
(Tcnica qumica, Mex) durante 12 h a 37C en una cmara
anaerobia (Forma Scientic, USA) con una atmsfera de 5%
de CO2, 10% de H2, y 85% de Nitrgeno.
El medio de adaptacin y de cultivo se prepar en frascos viales de 50 mL con 38 mL de medio de cultivo TPY
con la siguiente formulacin (gL-1): glucosa 10; peptona de
casena (Bioxon) 10; peptona de soya (Bioxon) 5; extracto
de levadura (Bioxon) 2.5; L-cisteina.HCl 0.5; K2HPO4 2;
MgCl2 0.5; ZnSO4 0.25; CaCl2 0.15; FeCl3 0.005 y 1 mL de
tween 80. El pH se ajust a 7 y el oxgeno fue desplazado del
medio de cultivo al burbujear CO2 puro. Los frascos fueron
tapados y sellados con tapas de aluminio y esterilizados. Los
inculos se prepararon al transferir a medio nuevo 2 mL de
los tubos de activacin y se incubaron a 39C por 12 h en
una incubadora orbital (Gellemkamp, USA) con agitacin
de 200 rpm.
Fermentaciones. Los experimentos se realizaron por triplicado en medio TPY, suplementado con el 1% (p/v) de ranosa,
inulina o glucosa. Los frascos de cultivo se inocularon con 2 mL
de los cultivos de adaptacin y se incubaron bajo las mismas
condiciones. Se tomaron 2 mL de muestra a partir del tiempo
cero y cada hora, la biomasa fue separada por centrifugacin a
3000 g durante 10 minutos.
Determinacin del crecimiento. El paquete celular se
resuspendi en agua destilada y se midi la densidad ptica a
660 nm. Los valores de peso seco (mg/mL) se calcularon con
base a curvas estndar previamente elaboradas para cada cepa.
La tasa especca de crecimiento se calcul a partir de gracar
Ln (X/X0) en funcin del tiempo y se utiliz como la medida
de la capacidad de adaptacin que presentan las bacterias a los
medios de cultivo.
Anlisis estadstico. La biomasa nal y la tasa especca
de crecimiento fueron utilizadas como criterios que permitieran encontrar la mejor adaptacin en los diferentes azcares
considerados prebiticos. Se realiz un anlisis de varianza
seguido de la prueba de Dunnett. Esta prueba permite descartar con los criterios anteriores, aquellas cepas que en las
diferentes condiciones de estudio tenga una respuesta menor
a glucosa la que se us como testigo (P<0.05). El anlisis de
resultados se realiz con el programa SPSS para Windows
Versin 12.

Resultados y discusin
Para todas las bacterias y para cada condicin de estudio, las fermentaciones se monitorearon durante 8 horas y se reportaron nicamente
las biomasas nales. Para analizar el efecto de los ingredientes del
medio de cultivo en la produccin de biomasa se realizaron fermentaciones en ausencia de un ingrediente del medio TPY con la cepa
de B. infantis como modelo. La gura 1 muestra que la ausencia de
un componente del medio TPY completo (testigo) disminuy la
produccin de biomasa nal y el impacto fue mayor en ausencia de
glucosa. Posteriormente se analiz el crecimiento de 8 especies de bidobacterias y de 5 especies de bacterias lcticas con tres fuentes distintas de carbono: glucosa, ranosa e inulina. La gura 2A muestra
que la biomasa nal de bidobacterias fue signicativamente mayor
en ranosa que en inulina (P < 0.05), por lo que esta ltima, bajo las
condiciones de estudio, no necesariamente fue el mejor prebitico.
Cuando se compar la biomasa nal en ranosa y glucosa (testigo),
no se presentaron diferencias, sin embargo, B. animalis 27536 y B.
bidum crecieron mejor en ranosa que en inulina y tambin mejor
que las otras cepas.
Para las bacterias cido lcticas, la biomasa nal no present
diferencias entre inulina y ranosa a excepcin de L. sporogenes

(P < 0.05). Sin embargo, todos los crecimientos en ambas fuentes

de carbono fueron menores que en glucosa. Los resultados del
presente estudio indican tambin mayor crecimiento de las bidobacterias en los tres azcares estudiados (gura 2A) que de las
bacterias cido lcticas (gura 2B).
La gura 3A muestra las tasas de crecimiento como un
parmetro de adaptacin de las cepas a los distintos medios de
cultivo. Estos resultados mostraron una mejor adaptacin en
ranosa que en inulina pero no en glucosa (P < 0.05) y solo B.
animalis 27536 present mejor adaptacin a ranosa cuando se
compar al testigo. Las bacterias cido lcticas (gura 3B), presentaron una mayor adaptacin en ranosa que en inulina y solo
fue semejante la adaptacin para ambos azcares considerados
prebiticos para L. acidophillus. Por lo que se puede considerar
que estas bacterias preeren sustancias prebiticas con un grado
de polimerizacin bajo, distinto a la inulina que es la sustancia
prebitica mas utilizada en el mercado. Estos resultados son
congruentes a los sealados por Rabiu y col.12 y Van der Meulen
y col.13 quienes reportaron que las bidobacterias metabolizan
carbohidratos como las inulinas o sus derivados, pero que preeren
azcares como oligosacridos con grado de polimerizacin de tres
o cuatro monmeros, aun sobre azcares como la glucosa.

Figura 1. Efecto de la ausencia de un ingrediente del medio TPY en la biomasa nal de B. infantis (P< 0.05)

Volumen 37 No. 2 abril - junio 2006

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Figura 2. Efecto de las fuentes de carbono en la produccin celular con (A) Bidobacterias y (B) bacterias cido lcticas (P< 0.05)

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Tasa especca de crecimiento (h -1)

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Figura 3. Efecto de los azcares en la tasa especca de crecimiento en (A) Bidobacterias y (B) bacterias cido lcticas (P< 0.05)
Las bidobacterias al ser habitantes normales del colon, pueden
competir mejor por azcares que no son metabolizados por otras bacterias, Tannock 14 report en un estudio con adultos que consumieron
oligosacridos como prebiticos quienes no presentaron alteraciones
de la microbiota en 11 de 15 pacientes. Sin embargo, la banda de
PCR-DGGE especca B. adolescentis present mayor intensidad y
concluy que esta especie fue favorecida por los oligosacridos. Van der
Meulen y col. 15 reportaron que las bidobacterias y bacteroides tienen
transportadores especcos para oligosacridos de bajo peso molecular.
Kaplan y Hutkins16 demostraron que L. paracasei fue incapaz de metabolizar oligosacridos con un grado de polimerizacin mayor de 5.
Estos estudios fueron similares a los obtenidos en este trabajo donde
las bidobacterias presentaron mejor tasa de adaptacin y biomasa
nal en ranosa que tiene un grado de polimerizacin de 3.

Conclusiones
Diferencias en perles de fermentacin con sustancias prebiticas
han sido descritas para bacterias cido lcticas y bidobacterias.
Actualmente se han incrementado los estudios sobre el efecto de
sustancias prebiticas en bacterias probiticas. Con estos resultados
proponemos el uso preferencial de carbohidratos con un grado de
polimerizacin bajo en la elaboracin de productos dirigidos a la
poblacin en general. Los resultados aqu presentados ayudarn a
conocer mas las interacciones entre ellos y a proporcionar un uso
alternativo de las sustancias que actualmente se usan como aditivos
en productos farmacuticos, as como la elaboracin de nuevas
formulaciones de complementos alimenticios que modiquen
positivamente la microbiota intestinal de humanos.

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