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03. TCNICAS DE ESTUDIO

ELECTROFORESIS DE PROTENAS

Se basa en el hecho de que un solo aminocido diferente en una protena

(resultado de una mutacin en la correspondiente secuencia de DNA) puede
causar una leve modificacin en la carga elctrica de la protena.
La ligera diferencia de carga har que las forma normal y la mutada migren
distinto a travs del gel

CONS
Las sustituciones silenciosas que no alteran los aminocidos no se pueden
detectar
Algunas sustituciones de aminocidos no modifican la carga elctrica de la
molcula proteica
La sustitucin de una nica base en el DNA no codificante no suele detectarse
mediante la electroforesis de protenas

Solo detecta alrededor de 1/3 de las mutaciones que se producen en el DNA

codificante

POLIMORFISMOS DE LA LONGITUD DE FRAGMENTOS DE

RESTRICCIN (RFLP)

Utiliza encimas bacterianas conocidas como endonucleasas de restriccin o

enzimas de restriccin.
Estas encimas restringen la entrada del DNA extrao en el interior de las
bacterias, dirigiendo o cortando el DNA en secuencias especficamente
reconocidas. Tales secuencias se denominan sitios de restriccin o sitios de
reconocimiento
Ej: EcoRI reconoce la secuancia GAATTC, cada vez que la encuentra corta entre la
G y la A, produciendo fragmentos de restriccin del DNA

Aplicacin
Si, por ejemplo, un individuo tiene la secuencia GATTT (en vez de GATTC), la
enzima no cortar esta secuencia, pero s cortar las normales que estn
localizados a ambos lados de la secuencia mutada
Este fragmento especfico ser mayor en el individuo que carezca del sitio de
restriccin que en el que lo tenga.
Pasos para visualizar
1. Extraccin de DNA
2. Digestin del DNA mediante una enzima de restriccin (ej: EcoRI), proceso
llamado digestin de restriccin
3. Separacin de fragmentos mediante electroforesis en gel (por tamao, a
diferencia de la de protenas que es por carga). Los fragmentos pequeos migran
ms rpidamente.
4. Tcnica de Southern: se transfieren los fragmentos desde el gel a una membrana
slida (como la nitrocelulosa) con el fin de fijarlos
5. Para encontrar fragmentos especficos se disea una sonda empleando tcnicas
de DNA recombinante (hibridacin). Sonda consiste en un pequeo fragmento de
DNA humano monocatenario insertado en un vector (ej: un fago, un plsmido,
etc). La sonda est marcada, con frecuencia con un istopo radioactivo. La
transferencia se expone a miles de copias de la sonda marcada que se aparearn
a las bases complementarias con los fragmentos de DNA monocatenarios
apropiados que se encuentren en la transferencia. La sonda identifica una porcin
especfica de DNA, por lo general uno o dos fragmentos.
6. Para visualizar la sonda hibridada, se expone a una pelcula de rayos X, que se
oscurece en la posicin de la sonda (emite partculas radioactivas). Esto da una
autorradiografa

-2CONS
La clonacin es laboriosa, requiere una semana o ms de laboratorio
La transmisin standard de Southern requiere cantidades grandes de DNA
purificado (hasta 1 ml de sangre para obtener ese DNA)

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SOUTHERN BLOT

Se utiliza para detectar una secuencia especfica de DNA en segmentos ms

grandes que los que se usan para PCR (al menos 20-30 pb)
Utiliza enzimas de restriccin

Pasos
1. Restriccin con endonucleasas
2. Correr en electroforesis en gel
3. Sobre el gel se coloca una membrana slida de nitrocelulosa y se calienta
para separar las cadenas de DNA en 2 simples
4. Se agrega la sonda. Si la secuencia a determinar est presenta, sta se va a
hibridar con la sonda.
5. Se lava la membrana para eliminar la sonda no apareada
6. Si existe radioactividad o fluorescencia es porque la secuencia est presente en
los fragmentos de DNA
Aplicacin en enfermedades
Monogentica: PCR + sondas

AMPLIFICACIN DEL DNA MEDIANTE LA REACCIN EN CADENA DE

POLIMERASA (PCR)

Es un medio artificial para replicar una secuencia corta y especfica de DNA (varias
kb o menos) con gran rapidez, de forma que se produzcan millones de copias de la
secuencia
Utiliza primers

Requerimientos
1. Dos cebadores (primers): corresponden a las secuencias de DNA
inmediatamente adyacentes a la secuencia en cuestin. Uno complementario
para cada cadena.
2. DNA polimerasa
3. dNTPs (deoxinucletido trifosfatos) libres en gran cantidad, los bloques con
los que la DNA pol sintetiza las cadenas
4. DNA genmico de un individuo: pueden una cantidad muy pequea porque la
PCR es muy sensible
Pasos
1. Calentar el DNA (95 celcius, aprox.) para desnaturalizar y convertir en
monocatenario al DNA
2. Exposicin a cebadores que se hibridan o anillan en las bases complementarias
correspondientes (36-65 celcius)
3. Elongacin mediante calentamiento (70-75 celcius). A esta temperatura y en
presencia de una gran cantidad de bases libres de DNA, la DNA pol sintetiza una
nueva cadena de DNA, extendindose a partir de la secuencia sebadora.
4. Calentamiento nuevamente a temperaturas elevadas, producindose su
desnaturalizacin. Se repite el ciclo de calentamiento y enfriamiento
posteriormente, doblndose en cada ciclo el nmero de copias.
PROS:
Se pueden usar cantidades muy pequeas de DNA
El proceso es mucho ms rpido al no requerirse clonacin gentica
No es necesario usar sondas radiactivas para detectar porque el PCR produce
grandes cantidades de DNA. En su lugar se pueden utilizar sustancias ms seguras
CONS
La sntesis de los cebadores requiere el conocimiento de la secuencia del DNA que
flanquea el DNA de inters

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La PCR es muy sensible y esto hace que sea muy susceptible a la contaminacin
de laboratorio
Es difcil aplicar PCR a secuencias mayores de unas pocas kb

Aplicacin en enfermedades
Monogentica: PCR + sondas

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SECUENCIACIN DEL DNA

Se utiliza para determinar la secuencia / orden de pb de un segmento de DNA

MTODO

DE LOS DIDEOXI

(TCNICA

DE

FREDERICK SANGER)

Requerimientos
Tener el fragmento de DNA amplificado previamente por PCR
Tcnica:
Los dideoxi son muy parecidos a los dideoxinucletidos normales, excepto que les
falta un grupo OH-. Esto evida la formacin posterior de enlaces fosfodister con
las bases de DNA libres
Aunque los dideoxi se pueden incorporar en la hlice de DNA en formacin, una
vez includos no pueden incorporarse nucletidos adicionales
Se emplean 4 dideoxis diferentes, cada uno correspondiente a A, C, G, T.
El DNA monocatenario a determinar se mezcla con:
o Primers marcados radiactivamente
o DNA pol
o Nucletidos normales
o Dideoxi de un tipo
En una determinada posicin puede incorporarse a la cadena un nucletido
normal o el correspondiente dideoxi, terminando la cadena si es el segundo caso.
De este modo el procedimiento proporciona fragmentos de DNA de longitud
variable, cada uno finalizando con el mismo dideoxi.
Se separan los fragmentos mediante electroforesis en gel.
Dado que cada banda corresponde a una cadena de DNA con una nica base en
su extremo, la secuencia del DNA puede ser leda observando el orden de las
bandas en gel tras realizar una autorradiografa.
Aplicacin en enfermedades
Monogentica: ltimo recurso

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CARIOTIPO
Pasos
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.

Obtencin de una muestra sangunea

Se agrega heparina (anticoagulante)
Se centrifuga para obtener los leucocitos (especficamente los linfocitos)
Se siembra y se agrega fitohemaglutinina (inductor de mitosis) y se cultiva
por 72 horas a 37 celcius
Se agrega una solucin con colchicina o colcemid (inhibidores de
polimerizacin de microtbulos), deteniendo a las clulas en metafase
(mxima condensacin)
Se agrega solucin hipotnica que hace que las clulas se hinchen y estallen
mediante una tcnica de goteo sobre el portaobjetos
Se fija y tie
Se fotografa

BANDEO G

Tripsina + Giemsa (colorante) + Leischman (colorante). La previa aplicacin de

tripsina degrada las protenas produciendo las bandas claras y oscuras que luego
son teidas.
Las bandas oscuras contienen ADN rico en A-T (pobres en genes constitutivos).
Se llaman G+
Las bandas claras contienen ADN rico en C-G (ricas en genes constitutivos)

OTROS
BANDE
O
Bandeo
G

BANDEOS

COLORANTE

TCNICA

FUNCIN

Giemsa

Previo tratamiento con Tripsina

Bandeo
R

Giemsa

Bandeo
Q

Mostaza de quinacrina o
acridina

Previo tratamiento con calor

Se examina con microscopio de luz
fluorescente. Las bandas brillan en
distintas intesidades

(ver ant.)
El bandeo R es el
reverso del G. til en la
tincin de los extremos
distales

Giemsa o fluorocromos
(actinomicina D o
cromomicina)

Tratamiento previo con calor o

lcalis

Bandeo
C
Bandeo
NOR
Bandeo
de alta
resoluci
n

Nitrato de plata
Tincin en profase o prometafase
(antes de metafase), cuando se
hallan ms elongados, reflejando
ms bandas

Aplicacin en enfermedades
Cromosomopatas: primer medida

Bandas ms brillantes =
G+
Tie heterocromatina
constitutiva (se localiza
cerca de los
centrmeros)
Marca satlites y tallos
de los cr. acrocntricos
550-850 bandas vs. 400
bandas (bandeo en
metafase)

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FISH (HIBRIDACIN IN SITU FLUORESCENTE)

Se utiliza para microdeleciones principalmente (hasta 1Mb, siendo ms sensible

que el bandeo de alta resolucin). Tambin sirve para detectar exceso de material
cromosmico y para reordenamientos como las traslocaciones
Tcnica:
Un fragmento de DNA especfico de un cromosoma (sonda) se expone a
cromosomas desnaturalizados
Se produce el apareamiento de bases complementarias (hibridacin) con la
secuencia de DNA que concuerda con su localizacin en un cromosoma especfico
La posicin en la que la sonda hibrida se puede ver con un microscopio de
fluorescencia, ya que la sonda est marcada
Aplicacin para deleciones
En un individuo normal, una sonda hibridar en dos lugares (reflejando dos
cromosomas homlogos)
Si la sonda hibrida con un solo cromosoma, probablemente tenga una delecin
en la que no ha hibridado
Aplicacin para exceso de material cromosmico
En individuos afectados, la sonda hibridar en tres lugares, en vez de hacerlo
en dos.
Aplicacin para reordenamientos
Se hacen por combinacin de sondas
PROS
Dado que mediante FISH pueden detectarse anueploidas empleando cromosomas
en interfase, no es necesario estimular a las clulas para que se dividan con el
finde obtener cromosomas en metafase (proceso de una semana de duracin).
Esto permite anlisis y diagnsticos rpidos