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LICENCIATURA EN CIENCIA Y

TECNOLOGA
DE LOS ALIMENTOS
QUMICA

DE LOS ALIMENTOS

NALISIS DEL CONTENIDO


DE PROTENAS
EN LOS ALIMENTOS
2015
Dra. Roxana Verdini
rverdini@fbioyf.unr.edu.ar

Mtodos de anlisis del contenido


protenas en alimentos
La determinacin

de la CANTIDAD DE

PROTENA de un alimento no es sencilla y el


valor obtenido en cada caso depende del
MTODO utilizado.

Muchos ensayos dependen de la PRESENCIA


DE UNA DETERMINADA CADENA LATERAL
AMINOACDICA (Lowry, Biuret).

los resultados analticos se vern

condicionados por la proporcin del


aminocido en cuestin en las protenas
sometidas al ensayo y necesitarn ser
referidos a alguna protena estndar.

Otros mtodos se basan en la determinacin


del
contenido
(Kjeldahl).

de

NITRGENO

TOTAL

Mtodos de anlisis del contenido


protenas en alimentos
Existen

numerosas fuentes de NITRGENO


que p
pueden interferir en
NO PROTEICO q
algunos mtodos de anlisis:

aminocidos
i id

libres,
lib
pptidos
tid
pequeos,
cidos
nucleicos,
fosfolpidos aminoazcares,
fosfolpidos,
aminoazcares porfirina,
porfirina
algunas vitaminas, alcaloides, cido
rico, urea, iones amonio, etc.

Otras

fuentes de interferencia pueden ser


los otros macronutrientes presentes en los
alimentos como hidratos de carbono y lpidos.

Mtodos de anlisis del contenido


protenas en alimentos
Los mtodos mas comnmente empleados son:
Kjeldahl
Kjeldahl/Bethelot
Bi
Biuret
t
Lowry
Absorbancia a 280 nm
Fijacin de colorantes
Turbidimtrico

Mtodos de anlisis del contenido


protenas en alimentos
Estos mtodos se fundamentan en:
determinaciones de nitrgeno
enlaces peptdicos
aminocidos
i id aromticos
ti
absortividad UV de las protenas
grupos amino libres
propiedades de dispersin de la luz
capacidad de adhesin de colorantes

Mtodo de Kjeldahl
j
Es

un mtodo oficial descrito en mltiples


p
normativas: AOAC, ISO, Farmacopeas y
distintas Directivas Comunitarias.

Se basa en los siguientes supuestos:


la
l proporcin
i de
d nitrgeno
it
no protenico
t i

en un producto alimenticio es demasiado


pequea para ser significativa,
significativa

una

determinacin del contenido de


nitrgeno total (refleja con suficiente
precisin el contenido de protena del
alimento,
alimento

la

proporcin que representa el nitrgeno


en la mayor parte de las protenas
alimenticias es de 16%.

Mtodo de Kjeldahl
j
FUNDAMENTO

Involucra la conversin del nitrgeno


presente
t
a
sulfato
lf t
d
de
amonio
i
por
DIGESTIN, DESTRUCCIN OXIDATIVA O
MINERALIZACIN con cido sulfrico.
sulfrico

Posteriormente

el sulfato de amonio se
descompone
por
ALCALINIZACIN
con
hidrxido de sodio y DESTILACIN del
amonaco liberado captndolo en una solucin
cida.

Finalmente

del amonaco.
amonaco

se realiza una VALORACIN

Mtodo de Kjeldahl
j

El cido sulfrico OXIDA LA MATERIA


ORGNICA y se combina con el amonio
formado.

Los elementos
L
l
carbono
b
e hidrgeno
hid
se
convierten en dixido de carbono y agua.

Durante

la digestin se libera el nitrgeno


proteico para formar iones de amonio.

Esta

determinacin
incluye
todo
el
nitrgeno reducido presente (-NH2 y =NH),
de modo que los compuestos amoniacales,
urea y aminocidos libres son tambin
valorados.
valorados

El uso de perlas de vidrio sirve de ncleo


para la
l formacin
f
i de
d burbujas.
b b j

Mtodo de Kjeldahl
j
ECUACIONES
Digestin:
n-C-NH2 + mH2SO4 + catalizadores

CO2 + (NH4)2SO4 + SO2

Neutralizacin y destilacin
(NH4)2SO4 + 2 NaOH
NH3 + H3BO3

2 NH3 + Na2SO4 + 2 H2O


NH4+ + H2 BO3-

Titulacin
H2BO3- + H+

H3BO3

Mtodo de Kjeldahl
j
UN POCO DE HISTORIA

En 1883 el investigador dans Johann


Kj ld hl desarroll
Kjeldahl
d
ll ell proceso bsico
b i
d l
del
conocido mtodo actual de anlisis de
protenas por el mtodo Kjeldahl,
Kjeldahl
ms
propiamente,
para
analizar
nitrgeno
g
orgnico.

El

mtodo original fue


algunas
l
modificaciones.
df

sufriendo

Wilforth (1885)
Gunning (1889)
Arnold
Winkler

luego

Mtodo de Kjeldahl
UN POCO DE HISTORIA

En el mtodo original la digestin se


efectuaba con una mezcla de cido sulfrico y
anhdrido fosfrico y la oxidacin se
completaba
p
mediante
la
adicin
de
permanganato de potasio.

Las

modificaciones
df
d l mtodo
del
d que han
h
resultado ms tiles emplean:

xido de mercurio como catalizador


de oxidacin (Wilfoth).
K2SO4 para aumentar
t
ell punto
t de
d
ebullicin del cido sulfrico (Gunning).
CuSO4 tambin como catalizador de
oxidacin (Arnold).

Mtodo de Kjeldahl
j
UN POCO DE HISTORIA

Los catalizadores permiten acortar el tiempo


de digestin y actan como transportadores de
O2 .

Cuando

se usa Hg como catalizador, ste debe


ser precipitado mediante el agregado de tiosulfato
de sodio para liberar el NH3.

Otra modificacin ampliamente aceptada es la


introducida en la etapa de destilacin propuesta
por Winkler:

originalmente se utilizaba cido sulfrico


valorado para captar el amonaco,
amonaco

titulando posteriormente
NaOH valorado.
valorado

su

exceso

con

Mtodo de Kjeldahl
j
UN POCO DE HISTORIA

La

modificacin consiste en:

recibir el NH3 sobre una solucin de


cido brico,

valorarlo directamente con solucin


valorada de H2SO4 (Winkler) o HCl.

Ventajas:

la solucin de cido brico no necesita


ser exactamente medida,
medida eliminando los errores en
la medicin del cido valorado en el colector y por
otra parte slo se requiere una solucin valorada
H2SO4 o HCl.

Mtodo de Kjeldahl
j
ESQUEMTICAMENTE

Mtodo de Kjeldahl
j
ESQUEMTICAMENTE

Mtodo de Kjeldahl
j
UNIDADES DE DIGESTIN Y DESTILACIN

Mtodo de Kjeldahl
j
ALGUNOS EQUIPOS

Los

equipos
p
mas modernos vienen con un
sistema
de
EXTRACCIN

Y
NEUTRALIZACIN DE GASES:

una unidad Scrubber q


que bloquea
q
el
paso y neutraliza las condensaciones
cidas,

una bomba de recirculacin de agua que


proporciona un gran caudal de vaco para
la aspiracin de los gases.

Mtodo de Kjeldahl
j
UNIDADES DE DIGESTIN, SCRUBBER Y BOMBA

Mtodo de Kjeldahl
j
DESTILADORES

Mtodo de Kjeldahl
j
DESTILADORES Y TITULADORES

Mtodo de Kjeldahl
VENTAJAS DEL MTODO

Apropiado
productos.
d

para

Alta confiabilidad.
Usado como mtodo

varios

tipos

de

de referencia.

DESVENTAJAS DEL MTODO

Interfieren
proteicos.
proteicos

compuestos nitrogenados no

Uso de catalizadores txicos o caros.


Eleccin del factor de conversin.

Mtodo de Kjeldahl
j
FACTOR DE CONVERSIN

El

contenido porcentual promedio de N en


las protenas de diversos alimentos es de
16%.

El

factor para convertir N en protenas


sera entonces 100/16 = 6,25.

Este

factor general de conversin no es sin


embargo exacto, ya que las protenas de
origen animal contienen generalmente menos
nitrgeno y las de origen vegetal ms.

As,
As

el factor de conversin para la


protena del trigo es 5,7 y para la de
productos lcteos es 6,38.

Mtodo de Kjeldahl
j
FACTOR DE CONVERSIN

Actualmente

se conoce el contenido de N, y
por lo tanto el factor apropiado,
apropiado de una gran
cantidad de productos agrcolas.

Debido
bd

a lla confusin
f que podra
d derivarse
d
del hecho de utilizar el factor general de
conversin 6,25
6 25 o el especfico para la
protena en estudio

Es necesario aclarar siempre en los


informes el factor de conversin utilizado
para ell clculo
l l de
d protenas.
t

Mtodo de Kjeldahl
j
FACTOR DE CONVERSIN

Mtodo de Kjeldahl
j
ECUACIONES
Digestin:
n-C-NH2 + mH2SO4 + catalizadores

CO2 + (NH4)2SO4 + SO2

Neutralizacin y destilacin
(NH4)2SO4 + 2 NaOH
NH3 + H3BO3

2 NH3 + Na2SO4 + 2 H2O


NH4+ + H2 BO3-

Titulacin
H2BO3- + H+

H3BO3

Mtodo de Kjeldahl
j
CLCULOS
%N = V x N x 14 x 100
1000
p
%N = V x N x 0,014 x 100
p
V: mL de cido
N: normalidad del cido
P: gramos de muestra
,
equivalente
q
volumtrico del N
0,014:

Mtodo de Kjeldahl
j
Mtodo de Kjeldahl/Berthelot

Este mtodo
E
d combina
b
l d
la
digestin
hmeda
h d
del mtodo de Kjeldahl con la reaccin
colorimtrica de Bethelot.
Bethelot

Al producto de la digestin se le reduce la


acidez,
id
ll
lleva
a volumen
l
fi l y luego
final
l
una
alcuota
se
somete
a
la
reaccin
colorimtrica.
colorimtrica

El NH4+ presente en la digestin sulfrica


reacciona
i
con ell fenol
f
l e hipoclorito
hi
l it de
d sodio
di
en medio alcalino, formndose un complejo de
color azul.
azul

La intensidad del color producido es


directamente proporcional a la cantidad de N
amoniacal presente en la muestra.

Mtodo de Kjeldahl
j
Mtodo de Kjeldahl
j
/Berthelot

La absorbancia del complejo


p j de se lee
a 540 nm.

Se calibra con solucin de sulfato de

amonio.

Por lo tanto lo que se determina por


este
t mtodo
t d es NITRGENO TOTAL.
TOTAL

Otros mtodos
m
Los alimentos son una matriz compleja
p j
por lo que se sugiere que estos mtodos
empricos
p
e indirectos sean calibrados con
el mtodo de Kjeldahl.

Se espera una buena correlacin entre

estos dos tipos de determinaciones de


protena

cuando la
l
relacin
l
N no
proteico/N proteico es baja y constante.

Son

satisfactorios
para
leche
y
cereales
l
e insatisfactorios
i
ti f t i
para la
l
mayora de los vegetales y mezclas de
alimentos.
alimentos

Otros mtodos
m
Mtodo de absorbancia a 280 nm

El mtodo se basa en la medicin de


absorbancia a 280
80 nm.

La mayora de las protenas muestran una


absorcin a 280 nm.,
nm la cual se atribuye al
grupo fenlico de la tirosina y al grupo
p
indlico del triptofano.

Otros mtodos
m
Mtodo de absorbancia a 280 nm

Es un mtodo
E
d
destructivo.

simple,
l

rpido
d

no

Es
un
mtodo
directo
para
la
determinacin
de
protenas
que
puede
aplicarse
li
en algunos
l
sistemas
i t
alimenticios.
li
ti i

Es necesaria la
protena estndar.

Generalmente

calibracin

con

una

se toma una protena


p
como la Albmina Srica Bovina (BSA), que
es soluble en agua, para construir curvas
patrn

que sirvan de
d
referencia
f
para
cuantificar otras protenas, que sern ms
precisas mientras la protena en cuestin
se parezca ms a la BSA.

Otros mtodos
m
Mtodo de absorbancia a 280 nm

La

solucin
l debe
d b ser clara
l
e incolora,
l
l
la
turbidez puede afectar los resultados.

El contenido de aminocidos aromticos


difiere considerablemente entre las distintas
protenas.
t

Los

cidos nucleicos interfieren (anillos de


purina y pirimida), no as el amonio.

Otros mtodos
m

Mtodo de Biuret

Comprende

un ensayo colorimtrico de un
paso donde se cuantifica la formacin de un
p j estable entre p
protenas y cobre ((II))
complejo
de configuracin desconocida.

El

complejo presenta un color violeta


caracterstico, que se puede observar a
por la
310nm o 540-560nm, el cual se da p
coordinacin de un tomo de cobre con cuatro
tomos de nitrgeno.

El

complejo se basa en la desprotonacin de


los grupos amida para formar el enlace con el
cobre (II) o por el establecimiento de un
enlace coordinado entre el metal y los pares
d electrones
de
l t
lib
libres
d los
de
l tomos
t
d oxigeno
de
i
y de nitrgeno del pptido.

Otros mtodos
m
Mtodo de Biuret

Otros mtodos
m
Mtodo de Biuret

Despus de la adicin del reactivo de


cobre se requiere de tiempo para desarrollar
una coloracin de Biuret estable; es necesario
considerar la posible influencia de aminocidos
libres que forman buffer en configuracin tris
y amoniaco.

El complejo tiene dos mximos a 330 y a


545 nm.

La lectura se hace usualmente a 545 nm,


dado q
que a la longitud
g
de onda de 330 es mas
susceptible a las interferencias.

Otros mtodos
m

Mtodo de Biuret

Es rpido,
rpido simple y no detecta nitrgeno de
fuentes no proteicas o no peptdicas.

Es necesaria la calibracin con una protena


estndar.

Altas

concentraciones de carbohidratos,
carbohidratos
lpidos pueden causar opalescencia en la solucin
f
final.
.

Las sales de amonio tambin interfieren en la


reaccin.

Se ha encontrado poca aplicacin en anlisis

de alimentos debido a la presencia de


interferentes como azcares reductores que
p
en medio alcalino
reducen el ion cprico
produciendo
resultados
insatisfactorios.
Ejemplo: leche.

Otros mtodos
m
Mtodo de Lowry

El

mtodo
t d de
d Lowry
L
combina
bi
l reaccin
la
i de
d
Biuret con la reduccin del reactivo de FolinCiocalteu (cidos fosfomolbdico y fosfotngstico)
por la oxidacin de tirosina, triptofano, cistena,
cistina de las cadenas polipeptdicas (Nielsen,
1988).
1988)

El

proceso de oxido-reduccin se acompaa de


lla formacin
f
i de
d un color
l azull caracterstico.
t ti

Los

quelatos de cobre en la estructura del


pptido
tid facilitan
f ilit
l transferencia
la
t
f
i de
d electrones
l t
d
de
los grupos funcionales amino al cromforo cido.

Este
E
t mtodo
t d es til para determinar
d t
i
pequeas

cantidades de protena en una disolucin.

El

desarrollo
d
ll de
d color
l
es dependiente
d
di t del
d l pH,
H
que se debe mantener entre 10 y 10.5.

Otros mtodos
m
Mtodo de Lowry

Otros mtodos
m

Mtodo de Lowry

Tiene
Biuret.

mayor sensibilidad que el mtodo del

La

respuesta del color vara de acuerdo al


tipo de protena.

La
L

iintensidad
t
id d del
d l color
l
no es estrictamente
t i t
t
proporcional a la concentracin de protena.

Los

iones potasio, magnesio, EDTA e


hidratos de carbono interfieren en la
reaccin.
i

Es

menos afectado por la turbidez de la


muestra.

Es

afectado p
por la presencia
p
de azcares
reductores al igual que el mtodo de Biuret.

Otros mtodos
m
Mtodos de adhesin de colorante

Controlando el pH y la fuerza inica del medio


los g
grupos
up
funcionales cidos y bsicos de las
fu
protenas pueden interactuar con grupos orgnicos
de carga opuesta.

Al

realizarse la unin se presenta coloracin o


bien un cambio de sta.

Comnmente

se usan colorantes
cuales reaccionan a pH cido con el
d la
de
l lisina
li i
y ell grupo guanidina
idi
d
de
imidazol de la histidina y un nmero
amino
am
n tterminales.
rm na .

Pueden

adherirse colorantes
CATINICOS
N
((BRADFORD).
DF D).

sulfonados los
grupo -amino
l arginina,
la
i i
ell
limitado de -

ANINICOS

Otros mtodos
m
Mtodos de adhesin de colorante aninico

El

COLORANTE ANINICO se une a los


grupos catinicos de los residuos bsicos de
las protenas (histidina, arginina, lisina) y
forman un complejo insoluble.

El

colorante en exceso permanece soluble y


se
relaciona
inversamente
con
la
concentracin de protenas.

El

mtodo con el colorante NARANJA 12


est descripto en la AOAC para leche fluida,
helados, leche en p
polvo descremada (=480
nm).

Algunos

compuestos no proteicos como


almidn o metales pueden unirse al colorante.

Otros mtodos
m
Mtodo de Bradford

Se

basa en lla unin


b
del
d l colorante
l
Coomassie
Blue G-250 a las protenas.

Las

protenas (aminocidos bsicos y


aromticos) se unen a la forma azul para
f
formar
un complejo
l j protena-colorante
t
l
t con un
coeficiente de extincin mayor que el
colorante libre.
libre

Este

mtodo es sensible, simple, rpido,


b
barato
t y pocas sustancias
t
i
i t fi
interfieren
en su
determinacin.

Entre
E

llas sustancias que interfieren


f
estn

los detergentes y las soluciones bsicas.

No

interfieren los carbohidratos.

Otros mtodos
m
Mtodo de Bradford

Los

aminocidos que son reconocidos por el


colorante son arginina, fenilalanina, triptofano
y prolina.

El

azul de Coomasie libre se detecta a 470


que la forma unida a p
protenas a
nm mientras q
595 nm.

Esto

se debe a que el Coomassie se une


preferencialmente
a
los
aminocidos
mencionados y cambia de un estado
catinico a uno aninico.

Otros mtodos
m
Mtodo de Bradford

Otros mtodos
m
Espectroscopia infrarroja

Se

aprovecha la absorcin del grupo amida


del enlace peptdico.

Ventajas:

Es

un mtodo
multicomponentes

No

rpido
rpido,

anlisis

destructivo
destructivo.

Desventajas
Interferido por agua.
Proceso de calibracin

complejo
complejo.

de

Otros mtodos
m
Espectroscopia infrarroja reflectante

La muestra se ilumina
l
con seis longitudes
l
d
de onda cercanas a la radiacin infrarroja y
se detecta la luz reflejada.
reflejada

Consideracin
Es necesaria

la calibracin contra un
conjunto de muestras estadsticamente
significativas, analizadas por mtodos de
referencia tradicionales.

Ventajas
Rpido,
Rpido anlisis de multicomponentes.
multicomponentes
Aplicable a materiales slidos.
Cuantifica protena en presencia
agua.

de

Determinacin
m
de la secuencia de
aminocidos
La
L
d t mi
determinacin
i
d
de
l
la
composicin
m
i i

proporciona
protena.
protena

una

informacin

sobre

una

veces se necesita identificar la secuencia


de los aminocidos,
aminocidos para lo que se cuenta con
dos mtodos:

secuenciacin
i i de
d la
l cadena
d
polipeptdica
li
tdi
en
equipos
automatizados
llamados
secuenciadores de protenas.
protenas

anlisis con espectrometra de masas


d los
de
l
pptidos
tid
generados
d
y sus masas
moleculares respectivas.

Determinacin
m
de la secuencia de
aminocidos
Por
P
ell tamao
t m
d
de
l
las
m l l
molculas,
se

hidrolizan con proteasas especficas, para


posteriormente secuenciar e identificar ms
fcilmente porciones de 10 a 20 aminocidos
de los p
pptidos
p
generados.
g

La

combinacin de proteasas especficas y


los pptidos generados alimentados a bases
de datos que tengan la informacin de
g
enzimticas,
permiten
p
ir
digestiones
completando las secuencias.

Se

ensaya el orden posible de los pptidos


al compararlos con bases de datos que tengan
la informacin de digestiones enzimticas
provenientes de protenas cuya secuencia ha
sido ya elucidada.

Determinacin
m
de la secuencia de
aminocidos
Pehr
P h Edman
Edm
d
descubri
b i una secuencia
i de
d
reacciones que permiten identificar los Nterminales y que al realizarse repetidamente
permiten identificar la secuencia completa de
los p
polipptidos
p p
en cuestin.

El

reactivo utilizado por Edman es el


fenilsiotiocianato que reacciona con el amino
terminal para producir el feniltiocarbamilo del
p p
pptido.

El

conocimiento de la secuencia de
protenas es cada vez ms necesario para
identificar la presencia de variantes naturales
a la luz de los nuevos alimentos de origen
transgnico.

Determinacin
m
de protenas
p
por
p
electroforesis
Pueden
P d

realizarse
li
electroforesis
l t f
i
en
condiciones nativas en las que las protenas
migran
conservando
su
diversidad
y
propiedades fsicas, especialmente su punto
isoelctrico y p
peso molecular.

Es

posible utilizarla en una sola dimensin o


en dos dimensiones (2D).
(2D) Se les denomina 1D
o 2D-PAGE (por sus siglas en ingls,
Electroforesis en Gel de Poliacrilamida).

Una

vez realizadas las separaciones,


generalmente se contina con una digestin
proteoltica y la separacin de los fragmentos
por electroelucin o para su anlisis por
espectroscopia de masas (MS).

Determinacin
m
de protenas
p
por
p
electroforesis
La
L

PAGE puede
d
ll
llevarse
a cabo
b
en
condiciones denaturalizantes si se utilizan
tiol-reductores fuertes como mercaptoetanol
y ditiotreitol (DTT) y un detergente
desnaturalizante fuerte: el dodecil sulfato de
sodio (SDS).

El

tratamiento con ambas sustancias las


despliega y las cargas negativas conferidas
por los g
p
grupos
p
sulfato del SDS p
permite la
migracin de las molculas hacia el nodo, de
acuerdo
con
su
peso
molecular
exclusivamente.
l i
t

Determinacin
m
de protenas
p
por
p
electroforesis
Las
L

tcnicas
t
i
2D permiten
mit
una segunda
d
separacin que discrimina protenas que en 1D
se traslapan,
traslapan
por ejemplo,
ejemplo
cuando son
especies moleculares mltiples, aun cuando se
trate de p
protenas p
purificadas.

Para

el primer paso en una 2D-SDS-PAGE


se aplica una separacin por carga elctrica
(isoelectroenfoque) y una segunda separacin
por p
p
peso molecular.

Esta

poderosa tcnica se ha convertido en


un sinnimo de Protemica y el mejor mtodo
para la resolucin de mezclas complejas de
protenas.

Determinacin
m
de protenas
p
por
p
electroforesis
Las
L

tcnicas
t
i
2D permiten
mit
una segunda
d
separacin que discrimina protenas que en 1D
se traslapan,
traslapan
por ejemplo,
ejemplo
cuando son
especies moleculares mltiples, aun cuando se
trate de p
protenas p
purificadas.

Para

el primer paso en una 2D-SDS-PAGE


se aplica una separacin por carga elctrica
(isoelectroenfoque) y una segunda separacin
por p
p
peso molecular.

Esta

poderosa tcnica se ha convertido en


un sinnimo de Protemica y el mejor mtodo
para la resolucin de mezclas complejas de
protenas.