FISH

HIBRIDACIN IN SITU
FLUORESCENTE

BLGA. ROCO M. GONZLEZ MORENO

SONDAS para FISH

TECNOLOGA DE MARCADO DIRECTO

COLOCAR LA MUESTRA

HIBRIDACIN
La muestra es hibridizada con
sondas fluorescentes.

Sondas de diferente color

pueden ser usadas sobre
diferentes cromosomas o
genes.

TIPOS DE SONDAS

TINCIN COMPLETA---

SECUENCIAS
REPETITIVAS---------

SECUENCIA
NICA---------------

SONDA COPIA NICA

Nombre: Vysis LSI 13
Ubicacin de la sonda: 13q14
Fluorforo: SpectrumGreen

SONDA COPIA
NICA
Nombre: Vysis LSI 21
Ubicacin de la sonda: 21q22.13-q22.2
Fluorforo: SpectrumOrange

SONDA DE COPIA NICA

TRISOMA 21: Patrn 2V3N (dos seales verdes y tres

seales
de color naranja).

SONDAS DE SECUENCIAS REPETITIVAS

Chromosome enumeration probes (CEP)

Nombre: CEP X
Ubicacin de la Sonda: Xp11.1-q11.1 Alpha Satellite DNA
Fluorforo: SpectrumOrange

Nombre:CEP Y
Ubicacin de la Sonda: Yq12 Satellite III
Fluorforo: SpectrumGreen

DNA satlite

SONDAS DE SECUENCIAS REPETITIVAS

SEXO FEMENINO: Patrn 2O

(dos seales anaranjadas)

SEXO MASCULINO: 1G1O

(Una seal verde, una seal
anaranjada)

SONDA CENTROMRICA
Nombre: Vysis CEP 18
Ubicacin de la Sonda:18p11.1-q11.1 Alpha Satellite DNA
Fluorforo: SpectrumAqua

SONDAS DE SECUENCIAS REPETITIVAS

SET de
SONDAS
18/X/Y

Tres seales aqua indican tres copias del

cromosoma 18, una seal verde indica una
copia del cromosoma X y una seal naranja
indica una copia del cromosoma Y

SONDA DE PINTADO PARA EL CROMOSOMA

4

Multi-FISH o SKY

FUNDAMENTO DEL FISH

FISH SE REALIZA EN VARIEDAD DE MUESTRAS

El botn de la muestra puede tener variada procedencia:
Un cultivo de sangre perifrica o de mdula sea
Eyaculado de esperma,
Cultivo o clulas directas de Liquido amnitico
Cortes de muestras de tejido de archivo de patologa: ovario, mama
Cualquier tejido clula nica para realizar diagnstico gentico de
preimplantacin (DGP).

PREPARACIN DE LA MUESTRA

PREPARACIN DE LA SONDA

10

CODESNATURALIZACIN E HIBRIDACIN

Colocar las lminas a 73-75 grados centgrados

dejar por 5 minutos.
Colocar las lminas en cmara de hibridacin hmeda
previamente mantenida a 37 grados durante 18-48
horas

LAVADOS
SOLUCIONES
Solucin A 2xSSC pH 7.0 a
temperatura ambiente.
Solucin B, 0.4SSC-0.3% NP40 o
tween 80 o tween 20, pH 7.0
mantenida en bao Mara a 72-75 C.
Solucin C, 2xSSC 0.1%, NP40 o
tween 80 o tween 20, pH 7.0
Temperatura ambiente.

11

LAVADOS

Contratincin

Hacer una mezcla 1:1 de colorante

de DAPI II y Antidesvanecente.

Dejar reposar en obscuridad y en

refrigeracin (2-8 C), durante 10-15
minutos

Observar bajo microscopio de

fluorescencia.

12

ANLISIS

ANLISIS

13

FISH EN NUCLEOS INTERFSICOS

14

SONDAS DE FUSION

LSI D7S486/CEP 7 Dual Color Probe Patrn: 202G

LSI MLL Dual Color, Break Apart Patrn: 1O1G1F

SONDAS DE ESCISIN

15

SONDAS DE FUSION
LSI BCR/ABL Dual Color, Dual
FusionTranslocation Probe Patrn: 1O1G2F

NOMENCLATURA DE FISH SEGN

EL MANUAL DEL SISTEMA
INTERNACIONAL DE
NOMENCLATURA CROMOSMICA
ISCN 2013

16

SMBOLOS Y ABREVIATURAS
Ausencia de un cromosoma especfico, o secuencia
genmica.
+ Presente en un cromosoma especfico o secuencia
genmica.
++ Dos seales de hibridacin regiones sobre un
cromosoma especfico.
X Signo de multiplicacin precede el nmero de seales
vistas.
. Punto, separa observaciones de resultados de
hibridacin in situ

SMBOLOS Y ABREVIATURAS
;
Punto y coma, separa las sondas en diferentes cromosomas
derivativos
Amp

Seal amplificada

Dim

Seal disminuida

Enh

Intensidad de seal realzada

Fib ish Hibridizacin in situ en una fibra de cromatina

extendida.
ish
Hibridizacin in situ , cuando se realiza sobre cromosomas
(metafases)
nuc ish Hibridacin in situ en ncleos en interfase

17

SMBOLOS Y ABREVIATURAS

pcp Pintado parcial de cromosomas (hibridacin con

mezclas de sondas )
rev ish Hibridacin in situ reversa incluyendo CGH con
FISH
sep

Seales separadas

subtel Subtelomricas
Wcp Pintado completo del cromosoma

CUANDO SE REALIZA EL ANLISIS

EN NCLEOS INTERFSICOS

nuc ish 15q11.2(D15S10X1)[300]

18

EJEMPLOS EN METAFASE del 22q11

46,XY,ish 22q11.2(TUPLE 1X2)

Cuando se le realiza cariotipo

EJEMPLO EN METAFASE EN EL SNDROME DE

PRADER WILLI/ANGELMAN

46,XX, ish del(15)(q11.2q11.2)(D15S10-)

19

Ej. CON PINTADO COMPLETO DEL CROMOSOMA

47,XX,+mar[20]. ish (wcp 12+)

VENTAJAS DE FISH
-Identifica desrdenes genmicos mediante la deteccin directa
de los genes involucrados, utilizando sondas de ADN marcadas
con fluorocromos.
- Ncleos interfsicos: permite determinar el nmero de copias de uno o varios
cromosomas, as como para detectar algunas reorganizaciones especficas que son
caractersticas de ciertos tipos de cncer
- Se pueden estudiar hasta 1000 clulas.
- No es necesario cultivar
- Clulas en metafase: para detectar microdeleciones especficas, o para
identificar material extra de origen desconocido.
Para determinar si un cromosoma tiene una delecin simple o si est implicado en
una reorganizacin sutil o compleja.

20

VENTAJAS DEL DIAGNSTICO MOLECULAR

- Alta sensibilidad
- Alta especificidad
- Permite diagnstico, pronstico y seguimiento rpido.
- Permite el diagnstico en casos con cariotipo normal.
- Permite caracterizar los diferentes puntos de ruptura,
asociados a distintos tipos de patologas .

21