Practicas Medicina2011

UNIVERSIDAD NACIONAL JOSE FAUSTINO
SANCHEZ CARRION
FACULTAD DE HUMANA
E.A.P DE MEDICINA HUMANA
CUADERNO DE LABORATORIO DE
BIOQUIMICA
ALUMNO:
DOCENTES:
Dra. Zoila F. Honorio Durand

Dra. Emma del R. Guerrero Hurtado
Mg. Mara Luisa S. Solano Timoteo
HUACHO-2011
Dra. Zoila Honorio Duran
PRESENTACION
TODO CONCEPTO TEORICO DEBE PROBARSE, PERO

PARA QUE EL TRABAJO SEA EFECTIVO DEBEMOS DE
PROGRAMAR LO QUE QUEREMOS HACER.
POR ESO PRESENTAMOS EL CUADERNO DE
LABORATORIO, CUYO DESARROLLO NOS PERMITA
COMPROBAR DICHOS CONCEPTOS.
TODO SERA MAS LLEVADERO SI ANTES DE INGRESAR
AL LABORATORIO LEES TU CUADERNO, PARA
CONOCER EL TEMA A DESARROLLAR, TRAES LOS
MATERIALES A UTILIZAR Y DURANTE LA PRACTICA
APLICAS LO ESTUDIADO EN CLASE.
EL TRABAJO EN LABORATORIO, ES MUY ESPECIAL,
TENEMOS QUE PREPARARNOS PARA TENER XITO.
TODO DEPENDE, EN ESPECIAL DE TI.
Las docentes
-2-
NORMAS DEL LABORATORIO DE BIOQUIMICA
En el Laboratorio de Bioqumica se exige: respeto, limpieza,

cuidado en el uso de materiales, equipos y muchos deseos de
trabajar, por eso antes de ingresar al laboratorio debes tener en
cuenta lo siguiente:
1.- Previamente leer tu cuaderno para saber lo que vas a hacer en
el Laboratorio
2.- Tener puesto tu mandil, de preferencia de algodn de color
blanco.
3.- Tener el cabello recogido (gancho, cinta, etc).
4.- Tener en cuenta la limpieza del lugar donde vas a trabajar.
5.- Llevar a la mesa slo tu cuaderno de laboratorio.
6.-Antes de usar cualquier material preguntar al docente.
7.-Dejar limpio el laboratorio para que los dems compaeros
puedan seguir trabajando.
-3-
PROGRAMACION
1.
Determinacin de pH de muestras biolgicas.
2.
Determinacin de cidos titulables en orina como efecto de

una dieta.
3.
Espectrofotometra
4.
Factores que alteran la actividad cataltica de los enzimas.
5.
Determinacin de la Actividad de Succinato Deshidrogenasa
6.
Digestin enzimtica del almidn.
7.
Determinacin de glucosa en sangre
8.
Accin de la lipasa pancretica.
9.
Determinacin de Triglicridos
10. Determinacin de Colesterol en sangre.

11. Hidrlisis enzimtica de las protenas. Propiedades de
aminocidos y protenas.
12. Cromatografa de capa fina.
13. Obtencin de cadena de cidos nucleicos.
-4-
INTRODUCCION
Las prcticas que se desarrollaran en el presente semestre se harn

en plasma, orina, saliva y en alimentos.
La sangre ser extrada de la puncin venosa y puncin cutnea.
Como conocimiento previo debemos de saber la conservacin de
las muestras, segn el anlisis que se quiera realizar ya que los
metabolitos pueden sufrir alteraciones estructurales por factores
externos que van a dificultar su reconocimiento.
An sabiendo mantener las muestras en forma adecuada, el
anlisis bioqumico slo se completa con el conocimiento del
manejo instrumental y de materiales de laboratorio en forma
adecuada.
Las sesiones de laboratorio van a estar alternadas con el desarrollo
de prcticas instrumentales, con el Objetivo de que antes de
realizar el anlisis en los especimenes biolgicos debemos de
saber el fundamento y el uso
adecuado de los equipos del
laboratorio.
-5-
Prctica N 01
DETERMINACIN DE pH DE LIQUIDOS BIOLOGICOS.
I.-GENERALIDADES.Tal como se ha estudiado en las clases tericas, la concentracin

de H+ es vital para los procesos biolgicos.
Es importante tambin determinar la concentracin de H+ en los
alimentos, como control de calidad.
El mtodo ms exacto es por potenciometra. Con la finalidad de
cumplir con el objetivo sealado en la introduccin estudiaremos
las caractersticas de un potencimetro.
Las tcnicas potencio mtricas se basan en la medicin de una
fuerza electromotriz (f.e.m) producida por una clula
electroqumica. En forma bsica, la clula consiste de dos
electrodos de alambre cada una sumergida en una solucin
distinta, constituyendo cada una la semiclula.
Las soluciones tienen compuestos o iones fcilmente reducibles
u oxidables y estn unidos a travs de un puente de agar/cloruro
de potasio.
Estas soluciones pueden coger electrones del alambre, cargndose
stos positivamente, establecindose una diferencia de potencial
entre la solucin y el alambre.
El metal es parte de un circuito, y as, si un compuesto menos
reductor u oxidante est en contacto con el otro metal, habr un
flujo de electrones (una corriente) el que queda registrado por el
circuito potenciomtrico (que une a los 2 alambres).
-6-
A fin de establecer valores, una de las semiclulas es considerada

como Electrodo de referencia, tales como de:
Hidrgeno, se usa un gas de hidrgeno puro a presin

constante y como metal platino recubierto de negro de
platino, y solucin de HCl, (1,228 mox 100ml de HCl)
establecindose un potencial estable en el platino por el
equilibrio entre el gas de hidrgeno y los hidrogeniones.
La desventaja de este electrodo es que no debe haber
presencia de oxgeno, es decir en la muestra no debe
contener oxidantes ni sales metlicas porque se destruye
fcilmente, en el caso que contenga protenas, puede
haber reacciones qumicas entre el hidrgeno gaseoso y
los componentes de la solucin problema (muestra).
Electrodos de calomelanos, tiene como solucin cloruro

mercurioso (calomelanos) y cloruro potsico, en contacto
con cloruro mercurioso slido y mercurio.
Hg / Hg2Cl2 / KCl saturado // disolucin muestra
El no es sensible a los iones de H+.
Electrodo de vidrio que en reemplazo a los calomenanos
presenta plata/ cloruro de plata en una disolucin de HCl.
Ag / AgCl / HCl
El electrodo de vidrio es mucho menos susceptible a las

interferencias y puede emplearse para determinar una amplia
gama de pHs, (la solucin problema puede contener sales salinas
y agentes reductores y oxidantes), sin embargo a pH muy
alcalinos, mayores de 9 10, es menos exacto y se torna sensible
al Ion sodio. El electrodo de vidrio se asa en que ciertos tipos de
-7-
vidrio de borosilicato son permeables a iones de H+ pero no a

otros cationes o aniones.
NOTA: Los electrodos nuevos o secos deben ser remojados en
una solucin tampn 7,0 durante varias horas.
Los electrodos siempre deben de guardarse en agua destilada,
pues si se secan se provoca un cambio del potencial asimtrico,
por lo que se va a requerir calibrar el aparato.
Los cambios de temperatura provocan desplazamiento del pH,
especialmente en soluciones alcalinas, por lo que se recomienda
tomar nota de la temperatura de la muestra.
NOTA: Los potencimetros generalmente son estandarizados con
una solucin de pH conocido. Entre los ms usados tenemos:
1. Ftalato monobsico de potasio 0,050M de pH 4,01
2.-Fosfato de potasio monobsico 0,025M y Fosfato de sodio
dibsico 0.025M con un pH de 6,86
3.-Tetraborato sdico 0,010 M de pH 9,18
Siempre hay que verificar los niveles de la solucin de KCl dentro
del electrodo, si est por debajo de lo normal, adicionar la
solucin saturada de KCl por el orificio superior ayudndose con
una jeringa descartable sin aguja.
La membrana de vidrio no debe ser tocada o secada en forma
brusca, ya que es muy sensible a los pasos de iones de H.
Si las lecturas son lentas en estabilizar o no son reproducibles, se
recomienda reactivarlo, sumergiendo el electrodo en HCl 0,1 M
durante 2 horas.
No se debe medir el pH de muestras muy concentradas de
protenas ni de muestras precipitadas porque pueden taponar el
-8-
orificio que pone en comunicacin el KCl /es el puente salino) del

electrodo con la solucin problema.
Con la finalidad de medir el contenido de acidez en el estmago,
se utilizan electrodos de estmago (que pueden ser deglutidos), en
caso de detectar las lceras.
Otros electrodos especiales se usan para determinar el pH de la
piel, del msculo y otros fluidos corporales.
II.- OBJETIVO.
Al trmino de la prctica el alumno debe de explicar el
fundamento del potencimetro o pHmetro y calcular las
concentraciones de H+ y OH- de las muestras biolgicas.
III.-MATERIALES
Vasos de precipitacin
Frascos lavadores con agua destilada
Potencimetro con sensibilidad de 0,001 pH
IV.-PROCEDIMIENTO.Tomar en cuentas lo indicado en NOTAS, Calibrar el

potencimetro con patrones de pH 7,0 y 4,5.
Lavar con agua destilada el electrodo (tener cuidado ya que el
bulbo es muy sensible).
-9-
Colocar la muestra en el vaso de precipitacin, introducir el

electrodo teniendo en cuenta que la muestra cubra el bulbo de
vidrio.
Tomar nota de la temperatura y de la lectura de pH
Lavar inmediatamente el electrodo con agua destilada
V.- RESULTADOS.Completa el siguiente Cuadro

muestra temperatura pH
pOH
H+
OH-
Interprete los resultados
- 10 -
Prctica N 02
DETERMINACION DE ACIDOS TITULABLES EN ORINA
I.- GENERALIDADES.Las fuentes del cido titulable son a travs de 2 vas:

Exgenos.- Los alimentos que contienen altas concentraciones de
cloruro, fsforo o azufre como la palta, carne, pescado, aves,
huevos, cereales, nueces son formadoras de cidos en los lquidos
corporales. El S de los AA (METIONINA Y CISTEINA) se
oxidan hasta cido sulfrico, el fosfato de los fosfolpidos y otros
que contienen fsforo se oxidan a cido fosfrico (los dos cidos
son fijos, no voltiles).
Endgenos.- A travs de los procesos metablicos se general
cidos inorgnicos como sulfatos y fosfatos y como cidos
orgnicos tenemos mayormente al cido lctico y a los cetocidos
En condiciones fisiolgicas la acidez titulable urinaria se debe en
gran parte a los fosfatos.
La acidez es baja en las infecciones de las vas urinarias, por
transformacin de la urea en amoniaco, en las dietas ricas en
vegetales o por la ingesta de lcalis.
La acidez es alta en caso de una acidosis, en caso de ayuno,
procesos febriles y ciertos trastornos cardiorrenales, despus de
ejercicios violentos o por la ingestin de una dieta rica en carne o
de ciertas frutas como el caso de las ciruelas
Carga cida urinaria diaria:
Acidez titulable (H2PO4-) = 25-30 mEq
- 11 -
Acidez no titulable (NH+ 4) = 30-35 mEq

H+ libres = pH 5,0 = 0,01 mEq
En el caso de expresarlo en ml de NaOH 0,1N gastados el valor
normal es de 250 a 400 ml
II.- OBJETIVO
1.-Comparar mediante valoracin del cido titulable en orina el
efecto de una dieta rica en protenas y de una dieta rica en
vegetales.
III.- MATERIALES Y REACTIVOS

Solucin de NaOH 0,1 N
Erlemeyer de 250ml
Bureta de 50ml
Solucin alcohlica de fenolftaleina al 1%
Oxalato de potasio pulverizado
IV.-PROCEDIMIENTO
Mtodo de Folin.
Recoger en un frasco limpio con tapa y de boca ancha, es
preferible recoger la primera orina de la maana, desechando el
primer chorro.
El anlisis debe ser dentro de las 2 horas de haber sido recogida la
muestra o refrigerarlo de 2 a 8 C
Medir unos 25 ml de orina y colocarlo en el erlenmeyer de 250ml
de capacidad.
- 12 -
Aadir unos 15 gramos de oxalato de potasio para precipitar el

calcio y evitar la formacin de fosfato de calcio.
Aadir III gotas de fenolftalena. Mezclar.
Titular con una solucin de NaOH 0,1N lcali hasta cambio de
color ligeramente rosado persistente
Anotar el volumen gastado.
La cantidad de lcali aadido equivale a la acidez titulable
urinaria, que se expresa como una cantidad determinada de mili
equivalentes de hidrgeno excretado en el mismo tiempo.
Interprete los datos obtenidos de acuerdo al objetivo

planteado
- 13 -
Prctica N 03
ESPECTROFOTOMETRIA
I.- GENERALIDADES.Son mtodos de anlisis cuali y cuantitativos, basados en la
interaccin de la luz con los tomos y las molculas de las
sustancias problemas que se quieren analizar, pudindose
identificar compuestos desconocidos por su espectro de absorcin
caracterstico en el UV, VIS o IR. As como tambin se pueden
determinar las concentraciones de compuestos conocidos
midiendo la absorcin de luz a una o ms longitudes de onda,
generalmente a la longitud de onda de mxima absorcin.
A fin de que la presente prctica facilite el entender, aplicar y
explicar el mtodo en la determinacin de los metabolitos
bioqumicos indicadores del estado de salud del hombre se explica
algunas de las propiedades de la luz
La luz se manifiesta mediante radiaciones electromagnticas la
cual puede considerase como corpuscular o en la forma de onda.
Algunas propiedades fsicas de la luz se entienden mejor mediante
sus caractersticas de onda. Otras propiedades pueden explicarse a
travs de su naturaleza corpuscular o de partculas.
Las caractersticas de una onda son:
UN CICLO
- 14 -
: longitud de onda: distancia a la que se mueve la onda durante

un ciclo. Unidades:
A (armstrongs) = 10-10 m
cm (centmetro) = 10 7 nm
nm (nanmetro) = 10-9 m = 10 -6 mm = 10-7 cm
m (milimicras ) = 10 -6 mm
: perodo: tiempo que se requiere para que un ciclo
completo pase por un punto.
Unidad: seg/ciclo o s/ciclo
: frecuencia de oscilacin: nmero de ciclos que se
presenta en cada segundo.
Unidad ciclos/seg Hz.
La relacin entre la longitud de onda () y la frecuencia () para
una onda de luz es:
= C
C es la velocidad de luz (3,0 x 108 m/s
3,0 x 1010 cm/s)
La relacin entre la frecuencia y el perodo es inverso: v = 1/T
La luz por su naturaleza corpuscular o de partculas puede
considerarse como una corriente de paquetes de energa que se
desplazan a gran velocidad (3,0 x 10 10 cm/s).
Estos paquetes de energa se denominan fotones.
La frecuencia ( ) de la teora ondulante puede relacionarse con
la energa de los fotones (E) de la teora de las partculas mediante
la Ecuacin de Planck.
E = h
- 15 -
h es la constante de Planck cuyo valor es de

6,63 x 10 -34 joule . s
El nmero de onda es una caracterstica de onda que es
proporcional a la energa y se define como el nmero de ondas por
centmetro:
= 1/
Unidad: cm -1
La radiacin electromagntica se divide en regiones denominadas:
Ondas de radio, Microondas, Infrarrojo, Visible, Ultravioleta y
Rayos X, las que se encuentran asociadas con las longitudes de
onda, nmero de ondas, frecuencias y energa, se presentan en el
siguiente grfico.
El espectro ptico o electromagntico es detectado por equipos
especiales como:
FOTOCOLORIMETRO: Cuya zona de observacin es en la Zona
visible:
(400 700 nm).
ESPECTROFOTOMETRO: Estas pueden ser de dos clases:
1. Espectrofotmetro UV que comprende de 10 400 nm.
* UV
cercano
200 400 nm
* UV
lejano
10 200 nm
2. Espectrofotmetro IR que comprende de 760
10 000 nm
* IR
cercano
0,75 2,50 m
- 16 -
* IR
medio
* IR lejano
2,50 5,00 m
5,00 10 m
Las molculas biolgicas absorben las radiaciones de la regin

UV cercana (200 400 nm). Las protenas lo hacen en el UV
lejano debido a los enlaces peptdico, mientras que la
Fenilalanina, Tirosina y Triptfano absorben a 280 nm lo cual
constituye el fundamento de una tcnica muy sensible para
determinar protenas sin que se destruya la muestra.
Los esteroides, las bases pricas y pirimidnicas, nuclesidos y
nucletidos lo hacen tambin en la regin UV.
Los enlaces o grupos funcionales como: amino, carboxilo, metilo,
amida absorben las radiaciones de la regin IR.
La molcula o parte de ella que se excita por la luz como
consecuencia de la absorcin de sta se denomina
CROMOFORO.
Cuando la luz continua se hace pasar a travs de un prisma, la luz
sufre una dispersin de sus longitudes de onda componentes.
Cuando estas longitudes de onda dispersas se les hacen pasar a
travs de una celda que contiene la muestra problema (tomos o
molculas), la luz emergente deja de ser continua ya que parte de
las ondas de luz han interaccionado con los tomos o molculas y
han sido absorbidos por stos.
Las longitudes de ondas faltantes se detectan cuando la luz
emergente de la celda que contiene la muestra problema incide
sobre una placa fotogrfica o sobre algn dispositivo o detector.
A este procedimiento se le denomina ESPECTROSCOPIA DE
ABSORCION.
- 17 -
Dibuje las partes bsicas de un espectrofotmetro tpico.
La longitud de onda en la que las molculas o tomos de la

muestra absorben con mayor intensidad la luz, se denomina
LONGITUD DE MAXIMA ABSORCION.
Los procesos de absorcin de las radiaciones electromagnticas
son explicados por la Ley de Lambert-Beer que relaciona la
intensidad de la luz incidente (Io) y la transmitida (It) en funcin
de la concentracin de las molculas y tomos que absorben la
luz.
Su expresin es:
A = log Io/It = e. l. C
A = - log It/Io = e. l. C
Donde:
A:
Absorbancia o Extincin
e :
Coeficiente de extincin molar. Valor constante que
depende de la naturaleza de la sustancia y de la longitud
de onda.
L:
ancho del recipiente de la muestra = 1 cm
C:
Concentracin de la muestra problema
A.- Uso del Espectrofotmetro.

Vamos a aplicar los conceptos hasta hoy estudiados usando el
espectrofotmetro UV, para el cual usaremos un reactivo
- 18 -
coloreado como ejemplo antes de usar las muestras que usaremos

para el anlisis de glucosa.
II.- MATERIALES Y REACTIVOS

Equipos: Balanza analtica
Espectrofotometro UV
Muestra: solucin de Permanganato de
Potasio (KMnO4 ) 4 mg/litro.
III.- PROCEDIMIENTO
4.1 Bsqueda de la longitud de onda ( ) ptima para la
muestra . Encender el espectrofotmetro 30 min antes de
empezar a trabajar.
Seleccionar la regin visible (VIS) del
espectro, e Iniciar las lecturas desde 400 nm.
Colocar en la cubeta agua destilada y llevar a
CERO de Absorbancia y 100% de
Transmitancia.
Colocar en otra cubeta la solucin problema.
Realizar la lectura en Absorbancia y anotar el
valor obtenido.
Aumentar la a 420 nm . Recuerde que cada
vez que se cambie de longitud de onda es
necesario graduar el instrumento en CERO con
agua destilada en la cubeta. Luego: LEER la
absorbancia.
- 19 -
Repetir la misma operacin DE 20 nm cada

vez hasta llegar a 700 nm
En el papel milimetrado dibuje la Curva
Espectral A vs
DATOS:
Lectura (A)
Lectura (A)
Explicacin de los resultados:
Prctica N04
- 20 -
FACTORES QUE ALTERAN LA ACTIVIDAD

CATALITICA DE LOS ENZIMAS
I.- GENERALIDADES.Las enzimas son protenas biocatalizadores, sensibles de

modificar su actividad por la alteracin de las condiciones de su
medio de accin ya que actan solo bajo condiciones definidas de
pH, temperatura, concentracin de sustratos, cofactores, etc.
Sobre los cofactores hay que recordar que los enzimas para su
actividad requieren de sustancias no proteicas que pueden ser de
naturaleza orgnica (coenzimas) o inorgnicas (minerales) los
que cumplen funciones especificas como la de coordinar entre el
centro activo del enzima con el sustrato antes de la transformacin
de ste a producto.
Hay medicamentos que actan como competidores de las
vitaminas las que son coenzimas y por lo tanto bloquean la accin
de los enzimas o lo que es ms inhiben la sntesis de los enzimas
especficos, por ejemplo el metrotexato (MTX), empleado para el
tratamiento de la leucemia y artritis reumatoide que libera al
folato de la enzima hidrofolato reductasa.
Los enzimas se clasifican por su accin en seis clases; tambin
toman el nombre genrico segn el sustrato por ejemplo los
enzimas proteo lticos como la pepsina, quimotripsina, tripsina,
etc.
II. OBJETIVO
- 21 -
Demostrar el efecto de los factores: Concentracin de Sustrato,

Concentracin de Enzima, pH y Temperatura sobre la actividad
enzimtica de la Amilasa salival sobre el almidn.
III.- MATERIALES Y REACTIVOS.

Solucin de almidn al 1%
Enzima: Solucin de alfa amilasa salival
1%
Sol. Buffer fosfato 0,1M a pH 4,6; 6,8 y 9,0
Sol. Yodo iodurada (Lugol)
Sol Cloruro de sodio 0,2%
dializada
IV.- PROCEDIMIENTO:
Coleccin de la saliva: El alumno donante no debe
haber ingerido alimento unas 2 horas antes como
mnimo. Previamente se tiene que enjuagar la boca con
agua, luego manteniendo la boca cerrada por unos 5-7
minutos esperar que su boca se llene de saliva. Luego
en un vaso dejar fluir por gravedad la saliva para evitar
que se forme espuma.
Preparacin de la solucin de saliva al 1%:
Previamente la saliva recolectada se debe de filtrar y
luego medir 1ml y diluirlo con agua destilada en una
fiola de 100ml
Seguir las indicaciones de las siguientes tablas.-
- 22 -
a.- Batera N01

Reac.\tubo
Sol.
Almidn
1%
Buffer
pH4,6
Buffar pH
6,8
Buffer pH
9,0
Sol. NaCl
Agua dest.
1
1
2
1
3
1
4
1
5
1
6
1,5
7
1
8
1
9
1
1,4
2,6
1,4
2,0
1,4
2,0
1,4
2,0
1,4
2,4
1,4
1,5
3,4
1,4
2,0
1,4
2,0
HOMOGENIZAR CADA TUBO

Colocar en bao mara a 37C los tubos del 1 al 7 por 5 minutos.
El tubo 8 llevar a 0C por 5 minutos y el tubo 9 a bao mara de
100C por 5 minutos
Cumplido los 5 minutos, agregar la solucin enzimtica, como se
indica en el siguiente Cuadro:
Sol.
0,0
enzimtico
0,6
0,6
0,6
0,2
0,6
0,6
0,6
0,6
MEZCLAR BIEN CADA TUBO SIN RETIRARLO DEL

MEDIO EN QUE SE ENCUENTRAN
Continuar la incubacin, considerando un control de 20 minutos,
desde el momento que el preparado enzimtico fue agregado a
cada tubo.
- 23 -
Cumplido el tiempo exacto de 20 minutos, medir 0,5 ml de cada

tubo y aadir a la batea N02 tal como se indica en la siguiente
Tabla
b.- Batera N02.
Reac\tubo
Sol HCl
0.05N
(ml)
Sol. Lugol
(ml)
Incubado
(ml)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5
5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0

0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
MEZCLAR.
Explicar los resultados
APLICACIONES DE MODELO DE LINEWEAVER

BURCK: CINETICA ENZIMATICA
- 24 -
GENERALIDADES.- La cintica de Michaelis-Mentes

describe la velocidad de reaccin de muchas reacciones
enzimticas. Su nombre es en honor a Leonor Michaelis y Maud
Menten. Este modelo slo es vlido cuando la concentracin del
sustrato es mayor que la concentracin de la enzima.
Los parmetros cinticos de una enzima son el Km y la Vmax.
Recordemos los que significa el Km (Constante de MichaelisMenten):
Concentracin de sustrato para la que se alcanza la
velocidad igual a la mitad de la mxima (Vmax)
Afinidad de un enzima por un sustrato determinado
Permite comparar la afinidad de un enzima por distintos

sustratos y la afinidad de varios enzimas por el mismo
sustrato
Se puede determinar con facilidad en el laboratorio

La velocidad de reaccin es muy sensible a cambios en
[S] en la zona de Km.
Las Km y Vmax pueden determinarse con mayor facilidad y en
forma experimental aplicando el recproco de la Ecuacin de
Michaelis-Menten conocido como ecuacin de Lineweaver-Burk:
Lo que facilita la grfica para calcular las constantes cinticas:

Km y Vmax.
- 25 -
formas de INHIBICION ENZIMATICA.

Cuando se usa para determinar el tipo de inhibicin de la enzima,
la Lineweaver-Burk puede distinguir competitivos, no
competitivos y acompetitivos inhibidores con las respectivas
caractersticas ya estudiadas en teora.
OBJETIVO:
Demostrar la aplicacin del grfico de Lineweaver-Burk en el
clculo de Km y Vmax con datos tericos y los obtenidos
mediante un trabajo experimental.
PROCEDIMIENTO:
1.- TEORICO: Al estudiar la cintica de inhibicin de cierto
enzima se han obtenido los resultados de la tabla siguiente:
________________________________________________
Sustrato
- 26 -
(mM)
v (mol/min)
[I]= 0
0,02
0.05
0.10
0.20
0.50
1,18
1,43
1,54
1,60
1,64
[I]= 0,1 mM
2,90
5,00
6,67
8,13
9,09
[I]= 1 mM
2,52
4,02
5,02
5,72
6,25
Determinar grficamente: a) el tipo de inhibicin; b) el valor de

Km del enzima;
c) la velocidad mxima y d) el valor de Ki
Sol.: a) Inhibicin acompetitiva; b) Km= 0,05 mM; c) Vmax= 10
moles/ min;
d) Ki= 0,2 mM.
2.- EXPERIMENTAL:
2.1.-Materiales y reactivos
Sustrato: soluciones de glucosa a diferentes concentraciones
Enzima: glucosa oxidasa
8 tubos de ensayo pequeos
9 pipetas de 1ml
Agua destilada
HCl concentrado
2.2.-Procedimiento
Preparar soluciones de glucosa de las siguientes concentraciones:
1;
2,5;
5,0;
10;
25 y 100 mM
- 27 -
2.3.- Seguir las indicaciones expuestas en el siguiente Cuadro:

REAC/TUB
O
Sol. glucosa
0,1ml de
Agua (ml)
Rvo.
Color(ml)
1
mM
0,9
2,5
mM
0,9
5,0
mM
0,9
10
mM
0,9
25
mM
0,9
100
mM
0,9
0,1
0.9
Agitar, incubar 20 min a temperatura ambiente. Al finalizar la

incubacin, agregar 3 gotas de HCl concentrado. Agitar
levemente.
Leer a 492 505 nm.
ABSORBA
NCIA
CONC.
mg/ml
GRAFICO: Usando los resultados elaborar un grfico de
Lineweaver-Burk y calcular Km y Vmax.
Prctica N05
DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD DE
SUCCINATO DESHIDROGENASA
I.- GENERALIDADES.-
- 28 -
Durante el proceso metablico se llevan a cabo reacciones en las

que hay transferencia de electrones desde un dador (el reductor)
hasta un aceptor electrnico (el oxidante). En ciertas reacciones de
oxido reduccin la transferencia de electrones se realiza por
medio de la transferencia de tomos de hidrgeno por lo que una
deshidrogenacin equivale a una oxidacin, estas reacciones son
catalizadas por deshidrogenasas las que se encuentran
ampliamente distribuidas. La cadena respiratoria es el proceso
donde se dan mayormente estos tipos de reacciones, dando origen
a los enlaces fosfricos del ATP. Ejm.:
NADH + CoQ CoQ Reductasa NAD + CoQH2
Otro ejemplo de estas reacciones se dan en el ciclo de Krebs:
Succinato
FADH2
FAD Succinato deshidrogenasa
Fumarato
La oxidacin del succinato a fumarato es catalizado por el

complejo de la succinato deshidrogenasa (succinato
deshidrogenasa). Este complejo consiste en varios polipptidos e
incluye un grupo prosttico FAD unido covalentemente a un
residuo de histidina de la enzima, protenas con fierro y azufre y
una molcula de citocromo. Estos cofactores de transporte de
electrones participan en la remocin de electrones del succinato y
en la donacin de electrones a la ubiquinona.
En el experimento esos electrones son transferidos a travs del
FADH2, centro Fe-S hasta un aceptor artificial como el azul de
metileno (oxidado) el cual al reducirse presenta un cambio en su
espectro de absorcin (incoloro).
II.- OBJETIVOS
- 29 -
Demostrar la actividad de las deshidrogenasas

III.-MATERIALES Y REACTIVOS
Tubos de prueba
de Hgado
Fiolas
Pipetas
Termmetros
Mechero
homogeneizado
Acido succnico
Azul de metileno
ClNa 0,9%
vaselina lquida
IV.- PROCEDIMIENTO
4.1Determinacin de la Presencia de deshidrogenasas, Seguir las
indicaciones del siguiente cuadro:
Soluciones/tubos
1
2*
2
2
Ml homogeneizado de hgado
Gotas de azul de metileno
Ml vaselina lquida
*Previamente hervido
2
2
2
2
3
2
2
-
Llevar a Bao Maria de 37C. Controlar el tiempo que demora

cada tubo en decolorar el azul de metileno.
4.2 investigacin de la deshidrogenasa succnica
Soluciones
1
/tubos
ml.
de
1
homogenizado
sol. buffer pH
1
7.4
- 30 -
Ac. Succinico
0. 2N
Agua destilada 2
Azul
de
2
metileno gotas
0.8
Mezclar, aadir 0,5 ml. de vaselina. Llevar a bao Mara a 37 C.

Explique los resultados.
Prctica N06
DIGESTION ENZIMATICA DEL ALMIDN
I.-GENERALIDADES.El almidn es el polisacrido principal fuente de energa para el

hombre. Estructuralmente est constituido por dos cadenas: la
amilosa (polmero de D- glucosas unidas por enlaces 1-4 , de
- 31 -
forma lineal helicoidal) y la amilopectina (polisacrido de Dglucosas unidas por enlaces 1-4 y 1-6 de forma ramificada).
El enzima amilasa, presente en la saliva y en la secrecin
pancretica es la responsable de la hidrlisis de los enlaces 1-4
glucosdicos del almidn, a pH 6,8-7,2. Los productos finales de
su accin cataltica es un alto porcentaje de maltosa, glucosa,
isomaltosas y dextrinas.
II.- OBJETIVO:
. Determinar los productos de la accin enzimtica en la digestin
del almidn.
1.- Bao Mara
2.-Tubos de precipitacin
3.- Sol. de almidn al 1%
4.- Buffer fosfato 0,1 M pH 6,8
5.-Sol. HCl 0,5 N
6.-Sol. NaCl 0,9%
7.- Reactivo de Lugol
8.- Reactivo de Benedict
IV.- PROCEDIMIENTO
1.- Solucin de saliva al 1%.- Proceder igual a la Prctica N 04.
2.- Digestin del almidn: Seguir las indicaciones
Tubos
Sol. almidn 1%
1
2
3
1,0 1,0 1,0
- 32 -
Buffer fosfato pH 6,8

Sol HCl 0,5 N
Agua destilada
Sol NaCl 0,9%
0,5
1,2
0,5
1,2
-
1,2
0,5
-
Llevar a B.M. a 37 C por 5 minutos. Luego aadir 0,5 ml de sol.

de saliva al 1% en los 3 tubos.
Incubar a B.M a 37 C por 10 minutos y cada 3 minutos agitar
cada tubo para evitar que se sedimente el almidn.
Retirar del Bao Mara y agitando cada tubo preparar las
siguientes bateras:
3.- Reconocimiento de los productos por reaccin con el Lugol:
Tubos
Digestin 1
Digestin 2
Digestin 3
Sol. HCl 0,5 N
Reactivo de Lugol
1
1,0
0,5
2,0
2
1,0
0,5
2,0
3
1,0
0,5
2,0
Mezclar cada tubo y observar los resultados:

Interpretar:
4.- Reconocimiento de los productos por reaccin con el Benedict:

Tubos
Digestin 1
Digestin 2
Digestin 3
Reactivo Benedict
1
0,5
0,5
2
0,5
0,5
3
0,5
0,5
- 33 -
Mezclar cada tubo y llevar a Bao Mara hirviente por 5 minutos.

Dejar reposar y comparar los precipitados.
Interpretar los resultados
Prctica N07
DETERMINACION DE GLUCOSA EN PLASMA
I.-GENERALIDADES.Los carbohidratos de la dieta estn constituidos por azcares

simples (Glucosa, fructosa y galactosa), disacridos (sacarosa,
lactosa y manosa) y complejos (almidn).
- 34 -
Las enzimas, como la amilasa y, dems enzimas glucolticas

presentes en el intestino convierten a los disacridos y al almidn
en hexosas, siendo la glucosa la principal.
La funcin principal de la glucosa es como fuente de energa para
el trabajo de las clulas. Rol que cumple cuando ingresa a las
clulas donde se activa por accin de la Hexocinasa, la cual
presenta 4 isoenzimas (I, II, III y Glucocinasa).
El transporte de la glucosa a travs de la membrana celular,
mayormente se encuentra relacionado con la Insulina quien junto
con el hgado regula los niveles de glucosa srica.
Los niveles altos de glucosa en suero caracteriza a la enfermedad
conocida como Diabetes I y II. prctica.
Qumicamente la glucosa puede estar bajo la forma de una
estructura aldehdica (estructura abierta) y que por el pH
fisiolgico se encuentra bajo la forma enodilica (Cclica). El
equilibrio entre la forma aldehdo/enodiol permite que la glucosa
pueda ser reducida y oxidada con facilidad.
La determinacin de la glucosa se basa en la capacidad reductora
de este azcar sobre el in cprico (Cu ++) a quien transforma en
in cuproso (Cu+). Este in monovalente en un medio alcalino y
en calor se transforma en xido cuproso (Cu 2O). Este compuesto
puede ser detectado por diferentes mtodos como: Folin-Wu,
Somogyi-Nelson y las modificaciones de estos conocidos como
Benedict. Sin embargo, slo son indicadores cualitativos o
semicuantitativo.
Actualmente la determinacin de glucosa en suero se realiza por
mtodos enzimtico como el conocido:
MTODO ENZIMATICO (TRINDER)GLUCOSA-OXIDASA
(GOD), cuyo fundamento es que : la glucosa es oxidada por la
Glucosa oxidasa a cido glucnico ms perxido de hidrgeno, el
- 35 -
agua oxigenada en presencia de una peroxidasa produce la

copulacin oxidativa del fenol con la 4-aminofenazona (4AF),
dando lugar a la formacin de un cromgeno rojo-cerezo con
absorbancia mxima a 505 nm.
GLUCOSA+ O2 + HOH
H2O2+4AF +fenol
GOD
Ac.Glucnico + H2O2
CROMOGENO + 4 HOH
II.-OBJETIVO:
Determinar y cuantificar a travs de mtodo enzimtico los
valores de glucosa en el plasma por espectrofotometra.
Muestra: plasma
-Tubos de ensayo 13 x 100 mm
-Bao Maria
-Espectrofotmetro a 505 nm
-Kit de Trabajo de procedencia conocida.
IV.- PROCEDIMIENTO
DETERMINACIN DE LA GLUCOSA EN SOLUCION

PREPARADA: Proceder segn las indicaciones del Cuadro
siguiente:
Tubos
Estndard (ul)
Blanco
(b)
-
Estndard
(s)
20
Desconocid
o (D)
-
- 36 -
Muestra (ul)
Rvo.trabajo (ml)
2.0
2.0
20
2.0
Incubar a 37c por 10 minutos.

Retirar de B.M y enfriar a chorro de agua fra por
Llevar a lectura espectrofotomtrica a 505 nm.,
aparato a cero con el blanco.
1-3 min.
llevando el
CALCULOS:
GLUCOSA (g/L) = D x F
DETERMINACION DEL FACTOR (F):
F = 1.0 g/lt
Lec.Est
Resultados:
Prctica N08
ACCIN DE LA LIPASA PANCREATICA
I.- GENERALIDADES.
- 37 -
La lipasa, al igual que la amilasa; tripsina y pepsina, pertenecen a

las hidrolasas, diferencindose de otros estearasas por actuar
especficamente en la interfase steragua y ser inactiva frente a
sustratos hidrosolubles.
Es secretado por las clulas acinosas del pncreas y acta a pH
alcalino. Su accin hidroltica la ejerce a nivel de yeyuno,
favorecido por la propiedad emulsificante de las sales biliares
(glicocolato y transcocolato) posicin;rompen los enlaces steres
de la glicerina (triglicridos en liberando monoglicridos los
que sern atacados posteriormente por lipasas especficas para
posicin o por las isomerasas quienes cambian la posicin por
pero debido a que la accin de las isomerasas es lenta; los
productos de la digestin de trigliceridos son: abundantes
monoglicridos, pequea cantidad de di y triglicridos, glicerol y
cidos grasos libres.
La lipasa pancretica, de gran inters clnico, se presenta en la
sangre en escasas concentraciones (0 a 1.5 unidades de Cherry
Grandall), niveles altos son indicadores de pancreatitis aguda,
carcinoma de pncreas, peritonitis aguda y obstruccin intestinal.
II.- OBJETIVO
Demostrar experimentalmente la hidrlisis enzimtica de los
triglicridos.
III.- ACTIVIDAD EXPERIMENTAL

MATERIALES
Pipetas simples de 5 y 10 ml
- 38 -
Bao Mara 37C

Bureta de 50 ml
Matraces 125 ml
REACTIVOS
Buffer fosfato pH 8.0
Hidrxido de sodio 0.1 N
Hidrxido de sodio 0.01 N
Solucin alcohlica fenolftalena
Solucin de pancreatina y sales biliares.
IV.- PROCEDIMIENTO.- Muestra con que se trabajar la

Experiencia: Aceite Neutralizado.
1.-Neutralizacin del aceite de pepita. Colocar 50 ml. De
aceite de pepita en un matraz, aadir 2 gotas de solucin
alcohlica de fenolftalena.
Mezclar y agregar poco a poco Hidrxido de Sodio 0.01 N hasta
una coloracin ligeramente rosada.
2.Solucin de pancreatina y sales biliares.- Para su
preparacin se har uso de frmacos comerciales como el
Helopanzyn que contiene 200 mg. de pancreatina y 50 mg. de
sales biliares.
Disolver 5 pastillas en 100 ml. de buffer fosfato pH 8.0.
3.- Hidrlisis del aceite de pepita (Triglicrido).- Seguir las
indicaciones del siguiente cuadro.
SOLUCIONES
TUBOS
g aceite neutralizado
- 39 -
ml buffer fosfato pH 8.0

ml. agua destilada
4
10
4
-
4
-
Agitar bien. Si el color ligeramente rosado no persiste aadir

Hidrxido de Sodio 0.1 N poco a poco agitando continuamente
hasta obtener el color.
Aadir ml. de solucin pancreatina a los tubos, 2 y 3 al tubo 4 el
mismo volumen pero previamente hervida.
Llevar a B.M. de 37C por una hora.
Titular el contenido de cada tubo con Hidrxido de sodio 0.01 N
hasta color rosado usando solucin alcohlica de fenolftalena
como indicador.
CALCULOS:
A.G.L% = Gasto NaOH N/100 x Fact.conversin Ac.Olico x N x 100
gramos de muestra
Interpretar.Prctica N09
DETERMINACIN DE TRIGLICERIDOS
I.- GENERALIDADES.Es la forma como se encuentran almacenados los lpidos en los

tejidos adiposos. Forman parte de las lipoprotenas. Pueden ser
exgenos o endgenos.
- 40 -
Se encuentran en mayor porcentaje en los quilomicrones y en la

VLDL.
La determinacin de TG totales se fundamenta en las siguientes
reacciones:
Trigliceridos + H20
Glicerol + Acidos grasos

LPL
Glicerol + ATP
Glicerol 3 fosfato + ADP

GK
Glicerol 3 fosfato + O2
Dihidroxicetona fosfato + H2O2

GPO
2H2O2 + 4-amino antipirina + 4-clorofenol
POD
Rojo de
Quinona
+ 4H2O
El rojo quinona es ledo a 510 nm a una temperatura de 37 C.
II.- OBJETIVO
Determinar la concentracin de triglicridos en sangre.

Muestra:
Suero o plasma
REACTIVOS:
- 41 -
Buffer pH 6,9 40 mmol/L
4-Clorofenol 5.0 mmol/L

Lipoprotein Lipasa
1,4 U/ml
Glicerol Kinasa1,0 U/ml
Glicerol 3 fosfato oxidasa
1,5 U/ml
Peroxidasa
0,5 U/ml
4 Amino antipirina 0,4 mmol/L
ATP 1,0 mmol/L
Magnesio 5,0 mmol/L
Detergentes
ESTANDAR:
Triglicridos 2,2 mmol/L 200 mg/dl
IV.- PROCEDIMIENTO.- Segn las indicaciones
Blanco
Estndar
Muestra
Reactivo de
trabajo
Estndar
1 ml
1ml
1ml
10 ul
Muestra
10 ul
- 42 -
Mezclar e incubar a 37C por 5 minutos. Leer a 510 nm.

CALCULOS:
mg/dl = Conc estandar X Lectura de Muestra
Lectura de estndar
VALORES DE REFERENCIA:
Varones: 0,68 1,88 mmol/L 60,2 166,4 mg/dl
Mujeres: 0,63 1,60 mmol/L 56,6 141,6 mg/dl
Resultados e interpretacin
Prctica N 10
DETERMINACION DE COLESTEROL EN SANGRE
I.- GENERALIDADES.El colesterol presente en el organismo humano, procede de la

dieta el que es absorbido a nivel del tracto intestinal junto con los
cidos grasos.
- 43 -
Tambin se obtiene por sntesis (en el hgado) a partir del acetato

por va del escualeno.
El colesterol est integrado por las lipoprotenas VLDL ( 13%) +
LDL (70%) + HDL (17%).
Quiz es el lquido de mayor inters particular, se encuentra en los
ms variados tejidos (nervioso, graso, bilis donde puede formar
gran parte de los clculos biliares, sangre, entre otros), es
excretado normalmente por las heces, donde tambin se
encuentran algunos de sus derivados (coprosterol).
El colesterol es uno de los principales componentes de la fraccin
insaponificable de la sangre, donde 2/3 se encuentran sobre la
forma estrica y 1/3 libre. Esa proporcin es normalmente
constante y las dos porciones se hallan dbilmente ligadas a las
protenas plasmticas (+/- 75% en las beta-lipoprotenas).
II.- OBJETIVO
Determinar y cuantificar a travs de mtodo enzimtico los

valores de Colesterol sanguneo.
Mtodo: ENZIMATICO
(CHOD) - TRINDER
COLESTEROL-OXIDASA
Fundamento:
El Colesterol es oxidado enzimticamente por el colesteroloxidasa (CHOD) previa hidrlisis enzimtica de los steres
mediante una Lipasa de origen fungal.
- 44 -
El agua oxigenada generada en la oxidacin, produce la

copulacin oxidativa del fenol con la 4-aminofenazona
(4AF), mediante una reaccin catalizada por la peroxidasa.
El producto es una quinona roja con absorbancia mxima 505
nm.
LIPASA
ESTERES DE COLESTEROL
COLESTEROL + 02
H2O2 + 4AF + FENOL 4

imino)-
CHOD
POD
COLESTEROL + AG
Colesten-3-ona + H2O2
(P-benzoquinona-monofenazona + 4H20
REACTIVOS:
Solucin Stndard de Colesterol: 2 g/litro
Solucin de Enzimas: .
-Lipasa Fungal (300 U/ml)
-Colesterol-oxidasa (34 U/ml)
-peroxidasa (20 U/ml)
Solucin 4-aminofenazona: 25 mmol/litro
Solucin de Fenol: 55 mmol/litro.
IV.- PROCEDIMIENTO.Toma demuestra: Paciente en Ayuno por 12 16 Horas
- Se debe proceder a la extraccin de 5 cc. De sangre, tomada
en un tubo de 13 x 100 mm.
- Cada muestra ser centrifugada a 2500 rpm x 5 min. y se
separar el suero, en otro tubo.
- 45 -
NOTA: Si se trabaja con plasma, la muestra de sangre debe

haber sido tratada solamente con Heparina como
anticoagulante.
Seguir las indicaciones de la tabla
Tubos
Blanco (B)
Estandar (S)
Muestra
Estandard (ul)
----
20
---
Muestra (ul)
----
----
20
Rvo.Trabajo (ml)
2.0
2.0
2,0
- Incubar a 37C por 15 minutos o 30 min. a temperatura

ambiente.
- Retirar de B.M. y enfriar a chorro de agua fra por 1-3 min.
- Llevar a lectura espectrofotomtrica a 505 nm., llevando el
aparato a CERO con el
BLANCO.
CALCULOS:
COLESTEROL (g/L) = M x F
DETERMINACION DEL FACTOR (F):
F = 2.0 g/lt
S
VALORES DE REFERENCIA:
- 46 -
SUERO o PLASMA:
HOMBRES: 1,72 2,48 g/L.

MUJERES : 1,75 2,40 g/L.
Prctica N 11
HIDRLISIS DE LAS PROTEINAS: PROPIEDADES DE
AMINOCIDOS Y PROTENAS
I.- GENERALIDADES.-
- 47 -
Las protenas son polmeros de aminocidos unidos por enlaces

amdicos denominado peptdico. La hdrlisis enzimtica se
realiza en un medio cido con la accin de la pepsina, renina o en
medios alcalinos (pH 8,0) por accin de la tripsina, quimotripsina,
carboxipeptidasa, aminopeptidasa, etc.
Los productos de la accin enzimtica son aminocidos libres,
peptidos de diversos nmeros de aminocidos.
Qumicamente el grado de hidrlisis se puede determinar por el
incremento de los grupos carboxlicos, amnicos o ambos.
El incremento en grupos amino se puede medir por titulacin con
lcali en presencia de formaldehdo o etanol.
En la titulacin por el formol se forman compuestos mono o
dimetillicos. As se reduce grandemente la basicidad aparente de
los grupos amino, de tal manera que los Nhidroximetilaminocidos pueden titularse con lcali y
fenolftaleina en la misma forma que los cidos grasos.
Cada equivalente de lcali consumido corresponde a un
equivalente de enlace peptdico escindido.
II.-OBJETIVO:
Determinar el grado de hidrlisis de la protena por titulacin de
losN-hidroximetilaminocidos.
- 48 -
Muestra: casena
Bao Mara, Bureta, Erlemeyer

Sol. Carbonato de sodio al 0,3%
Tolueno
Sol. de pancreatina al 2%
Sol. NaOH 0,02N
Sol de Formol neutralizado con NaOH al 0,1 N
Indicador de fenolftalena 1%
IV.-PROCEDIMIENTO:
1.- Solucin de casena: disolver 2g de casena en 75ml de una
solucin de carbonato de sodio al 0,3%, aadir unas gotas de
tolueno y fenoftalena. Si la solucin no es alcalina aadir lcali
hasta que la solucin se torne de color rosado. Continuar
disolviendo la casena y aadir HCl 0,1N. hasta que el color
rosado desaparezca.
2.- Hidrlisis de la protena.- En un erlemeyer medir 40ml de sol.
de casena en carbonato de sodio al 0,3%, aadir 10ml de sol. de
pancreatina al 2% y agitar por medio minuto.
Tomar 10ml de la mezcla de la digestin y proceder a titularla
segn la tcnica que se indica ms abajo.
Poner el resto a incubar a 40C tomando muestras cada 30minutos
hasta completar 90 minutos. Titular las muestras y anotar los
resultados.
3.-Titulacin.- Tomar 10ml de la mezcla de digestin, colocarla
durante un minuto en bao mara a 100C para inactivar la
- 49 -
enzima, enfriar, aadir 10 ml de formol y III gotas de fenoftalena,

mezclar y titular con NaOH 0,02 N.
Resultados e Interpretacin
Prctica N12
CROMATOGRAFIA DE CAPA FINA
I . GENERALIDADES.-
- 50 -
La separacin de compuestos (de una muestra problema) por

cromatografa es una de las tcnicas ms recomendadas en los
trabajos de bioqumica, la ventaja es de que los compuestos no
sufren cambios en su estructura. Para obtener los resultados
deseados se recomienda la atencin y cuidado cuando se preparan
los materiales, reactivos y la muestra.
El fundamento de la tcnica cromatogrfica se basa en la
separacin de los compuestos (solutos) por la distribucin fsica
de ellos entre dos sustancias conocidas como fases: estacionaria y
mvil o dinmica.
La fase estacionaria estacionaria puede ser un slido o un
lquido (o sorbente). El sorbente tiene como soporte a un slido
denominado matriz. Por otro lado, la fase mvil o estacionaria
puede ser lquida o gaseosa, sta fase es conocida como solventes
o eluyentes.
Los compuestos o solutos de una muestra problema que se
encuentran disueltas en la fase mvil y van a separarse
dependiendo de la fuerza de atraccin de stos por la fase
estacionaria. Los componentes fuertemente atrados se mueven
ms lentamente, desplazndose los dems compuestos de la
muestra.
La cromatografa puede ser
de las siguientes clases:
Cromatografa de Adsorcin, Cromatografa de Intercambio
Inico, Cromatografa de Particin, Cromatografa en Capa Fina
y Cromatografa en Columna, Cromatografa de Alta Resolucin,
Cromatografa de Gases, Cromatografa de Plasma.
Como un resumen de las caractersticas de algunas clases de
cromatografa comentaremos que:
- 51 -
En la C. de Adsorcin los compuestos son adsorbidos en la fase

estacionaria crendose un equilibrio entre los compuestos ( que
deseamos separar ) unidos al soporte y los otros que estn libres
en la solucin. La unin va a depender de las cargas, fuerza de
Van der Waals, interacciones bipolares, enlaces de hidrgeno entre
los solutos y el soporte y por la estructura de los solutos. Esta
clase de cromatografa se recomienda para las sustancias que son
muy solubles en solventes orgnicas y poco solubles en agua.
En la C. de Intercambio Inico, la separacin de los compuestos
se hacen sobre un soporte o matriz insoluble que contiene iones
intercambiables con los iones del medio que le rodea. Las
sustancias que se desean separar deben de poseer cargas inicas
opuestas a la del soporte para que se pueda adsorber por enlace
electrosttica.
El soporte o matriz son resinas especiales para el tipo de solutos
que se quieren separar (cationicos o anionicos), por ejemplo las
resinas de intercambio inico son ideales para separar a los
aminocidos los que son fcilmente ionizables por los grupos
qumicos que poseen (-COOH, -OH, -NH2 ).
La C. de I.I. se recomienda para las sustancias que son ionizables
e hidrosolubles.
La C. de particin es til para los compuestos que son muy
solubles en solventes orgnicos y poco solubles en agua. Por ello,
el compuesto al mezclarse en los dos solventes (agua y solvente
orgnico) se van a encontrar equitativamente en ellos. La razn
de la concentracin el compuesto en los dos solventes es constante
y se conoce como coeficiente de particin (alfa).
= Concentracin de X en Solvente 1
Concentracin de X en Solvente 2
- 52 -
En la C.P., generalmente el solvente agua permanece en la fase

estacionaria (puede ser una columna o una pelcula de material
inerte). El solvente orgnico es la fase mvil que va ha estar
saturado con agua. La sustancia o solutos se van a separar si el
coeficiente de particin es diferente a 1. A esta clase de
cromatografa pertenece la Cromatografa en papel, la que ser
empleada en la presente prctica.
La Cromatografa en capa fina es muy semejante a la del papel,
usa como soporte sustancias como gel, slica gel. Tiene ventajas
sobre la C. de papel, una de ellas es de que puede separar
sustancias que se encuentren en bajas concentraciones, el mtodo
es ms rpido, se puede usar materiales corrosivos, altas
temperaturas, etc.
II.- OBJETIVOS
1.Separar los aminocidos de una mezcla a travs de la
cromatografa en papel.
2.Identificar los aminocidos separados a travs de su Rf.

*0 Mezcla de aminocidos
*1 Solvente: Butanol: Acido actico: agua (4 : 1 :5)
*2 Aminocidos Patrn
- 53 -
*3 Cmara Cromatogrfica
*4 Revelador: Sol.de Ninhidrina 10% (pesar 0,3 g de
ninhidrina y disolver en 95 ml de butanol y 5ml de ac.
actico)
*5 Estufa
*6 Pipetas Pasteur y/o capilares
*7 Papel Watman
*8 Pinzas
*9 Tijeras
*10 Regla y lpiz
IV.- PROCEDIMIENTO:
*11
Cortar el papel Watman (usar la pinza para coger el papel)
en forma de tiras.
*12
A una distancia de 1-2 cm del extremo inferior de la tira
trazar una lnea con el lpiz.
*13
Sobre e la lnea (en el extremo izquierdo) sembrar con
cuidado la mezcla de aminocidos usando para ello la pipeta
pasteur y/o el capilar, siguiendo las instrucciones del Profesor.
*14
En el extremo derecho (sobre la lnea sembrar el patrn de
aminocidos.
*15
Esperar que seque. Colocar con mucho cuidado la tira de
papel en la cmara de vidrio que contiene los solventes (los cuales
habrn sido colocados con anticipacin en la cmara el que
permanecer cerrada a fin de que se sature).
*16
Dejar que los solventes asciendan hasta el extremo
superior del papel.
*17
Sacar con cuidado el papel de la cmara y trazar una lnea
con el lpiz que indique el desplazamiento final del solvente (debe
ser hasta unos 2 cm antes del extremo final)
- 54 -
*18
Rociar el papel con el revelador (tener cuidado de no
inhalar los vapores).
*19
Medir la distancia (desde la lnea inicial) de
desplazamiento del solvente y de las manchas.
*20
Dividir los valores: distancia (cm) del recorrido de las
manchas sobre la distancia del desplazamiento del solvente.
El Valor encontrado corresponde al Rf de cada aminocido.
Distancia en cm del punto de partida

hasta el centro de la mancha
Rf =
Distancia del Pto de partida hasta el
Interprete los Resultados:
Prctica N13
OBTENCIN DE CADENA DE CIDOS NUCLEICOS.
- 55 -
I.- INTRODUCCION.El ADN y el ARN son transportadores de la informacin

gentica de la clula, as mismo tienen funciones estructurales y
metablicas.
Casi todas las clulas contienen ADN, pero la cantidad
presente en algunos tejidos es pequea. Adems, algunos tejidos
contienen actividades altas de desoxiribonucleasa (DNasa ) lo cual
fragmenta el ADN.
Para la liberacin y aislamiento del ADN en forma soluble se
logra mediante la destruccin de las membranas celulares y de las
membranas de las partculas sub-celulares, ncleo, etc; igualmente
por la disposicin de los complejos ADN-protena por
desnaturalizacin proteica.
El ADN es insoluble en alcohol, pero se disuelve en soluciones
salinas . Para purificar el ADN se efectan por ello, una serie de
precipitaciones alcohlicas y extracciones salinas.
Para evitar que durante el aislamiento se produzcan cambios
estructurales en la molcula debemos considerar los agentes
capaces de producir tales alteraciones:
La la tensin mecnica y condiciones fsicas que puedan acortar y
separar las dos cadenas.
La DNasa presente en el homogenizado inhibir con Citrato de
Sodio para ligar Ca ++ y Mg ++ los cuales son cofactores de la
DNasa.
Temperaturas superiores a 80C.
II.- OBJETIVOS.-
- 56 -
Observar las fibras que corresponden a la naturaleza fibrosa

del ADN.
III.- MATERIALES Y METODOS.Materiales:

- Mortero u homogenizador
- Matraz o probeta con tapa de 50 ml.
- Vaso de 100 ml.
- Varilla de vidrio
- Tubos para centrfuga
- Papel secante o filtro
Reactivos:
- Tejido gonodal de concha de abanico
- Solucin salina 0.1 M NaCl
- Dodecil Sulfato de Sodio
- NaCl 5M
- Mezcla de cloroformo alcohol isoamlico (24:1)
- Etanol absoluto
IV.- FUNDAMENTO.Se basa en que el ADN es soluble en soluciones de alta

concentracin inica (solucin salina 5M), pero insolubles en
soluciones de baja concentracin inica (0.05 0.25 mol-l) y
precipitan en alcohol absoluto fro.
V.- PROCEDIMIENTO.1.- Pesar 1 g. de tejido gonodal de argupectum purpuratus
concha de abanico , al que se ha quitado previamente todo
- 57 -
el tejido conjuntivo. Colocarlo en un mortero u

homogenizador .
2.- Aadir 5 ml. de solucin salina 0.1M . Homogenizar y
centrifugar a 800 rpm por 10 min..
3.- Resuspender el residuo en 12.5 ml. de solucin salina 5M y
colocar esta suspensin en un Matraz o probeta con tapa de
vidrio. Aadir 1 ml. de SDS (Dodecil Sulfato de Sodio) al
25%. Agitar suavemente durante 10 minutos.
4.- Aadir 5 ml. de NaCl 5 M. Agitar suavemente. Tener en
cuenta que la solucin es muy viscosa.
5.- Aadir 12.5 ml. de cloroformo alcohol isoamlico (24 : 1),
teniendo cuidado de sujetar la tapa de vidrio; agitar
lentamente durante 30 minutos para mezclar las dos fases.
6.- Centrifugar a 10 000 rpm por 10 minutos.
7.- Separar la fase acuosa (superior), colocarlo en un vaso de 100
ml. Hay que cuidar de que no se mezcle con la fase lechosa
que se ha formado en el tubo de centrfuiga.
8.- Aadir en fase aproximadamente 2 volmenes de etanol
absoluto fro. Con la varilla de vidrio se enrollan las hebras
de ADN que se han formado.
- 58 -
BIBLIOGRAFIA
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Laboratyorio.
Edit. Medica Panamericana 5ta. Edic.
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Equilibrio Hidroelectroltico de Moyer. Edit. Limusa
Mxico.
- 61 -

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UNIVERSIDAD NACIONAL JOSE FAUSTINO

Dra. Zoila F. Honorio Durand

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TODO CONCEPTO TEORICO DEBE PROBARSE, PERO

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Digestin enzimtica del almidn.

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adecuado de los equipos del

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A fin de establecer valores, una de las semiclulas es considerada

Hidrgeno, se usa un gas de hidrgeno puro a presin

Electrodos de calomelanos, tiene como solucin cloruro

El electrodo de vidrio es mucho menos susceptible a las

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vidrio de borosilicato son permeables a iones de H+ pero no a

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orificio que pone en comunicacin el KCl /es el puente salino) del

IV.-PROCEDIMIENTO.Tomar en cuentas lo indicado en NOTAS, Calibrar el

Dra. Zoila Honorio Duran

Colocar la muestra en el vaso de precipitacin, introducir el

V.- RESULTADOS.Completa el siguiente Cuadro

Interprete los resultados

Dra. Zoila Honorio Duran

I.- GENERALIDADES.Las fuentes del cido titulable son a travs de 2 vas:

Dra. Zoila Honorio Duran

Acidez no titulable (NH+ 4) = 30-35 mEq

III.- MATERIALES Y REACTIVOS

Dra. Zoila Honorio Duran

Aadir unos 15 gramos de oxalato de potasio para precipitar el

Interprete los datos obtenidos de acuerdo al objetivo

Dra. Zoila Honorio Duran

Dra. Zoila Honorio Duran

: longitud de onda: distancia a la que se mueve la onda durante

Dra. Zoila Honorio Duran

h es la constante de Planck cuyo valor es de

Dra. Zoila Honorio Duran

Las molculas biolgicas absorben las radiaciones de la regin

Dra. Zoila Honorio Duran

Dibuje las partes bsicas de un espectrofotmetro tpico.

La longitud de onda en la que las molculas o tomos de la

A.- Uso del Espectrofotmetro.

Dra. Zoila Honorio Duran

coloreado como ejemplo antes de usar las muestras que usaremos

II.- MATERIALES Y REACTIVOS

Dra. Zoila Honorio Duran

Repetir la misma operacin DE 20 nm cada

Explicacin de los resultados:

Dra. Zoila Honorio Duran

FACTORES QUE ALTERAN LA ACTIVIDAD

I.- GENERALIDADES.Las enzimas son protenas biocatalizadores, sensibles de