PEDRO DOMINGO MURILLO

TEMA:
DETERMINACIN DE VITAMINAS A EN ALIMENTOS INFANTILES
INSTANTNEAS POR CROMATOGRAFA LIQUIDA DE ALTO RENDIMIENTO
(HPLC)
ESTUDIANTE:
JULIO EDGAR CATARI CHURA
DOCENTE:
Lic. Ximena pozo
La paz Bolivia
02-04-2014

DETERMINACIN DE VITAMINAS A EN ALIMENTOS INFANTILES

INSTANTNEAS POR CROMATOGRAFA LIQUIDA DE ALTO RENDIMIENTO
(HPLC)

Introduccin
Con la finalidad de controlar la calidad de alimentos infantiles instantneas se
efecta la validacin de la metodologa para la determinacin d la vitamina A por
cromatografa (hplc) con los resultados obtenidos se demuestro que el mtodo en
estudio es preciso. Exacto, lineal y altamente sensible para ser utilizados en el
control de calidad de dicho alimento.
Como sabemos la vitamina A es el nombre genrico utilizado parta describir al
retinol sus esteres y lo correspondiente ismeros.
La vitamina A

no es ms que un alcohol polienico isoprenoide que se conoce

tambin con otro nombre como axeroftol biosterol vitamina antixeroftalmica y

vitamina anti infecciosa.
Del retinol derivan por oxidacin el retinal y el cido retinoico.
El 11-cis-retinal juegan un papel decisivo en el proceso visual.
En los vegetales y en algunos organismos marinos encontramos a la
vitamina A como provitamina A e en la forma de B caroteno. pigmentos
amarillentos constituido por dos molculas d retinal unidas en el extremo
aldehdo de sus cadena s carbonadas.
Dentro de provitaminas y carotenos la proteccin de la piel y sus intervenciones
en el proceso de visin de la retina. Tambin participa en la elaboracin de
enzimas en el hgado y de hormonas sexuales y supra renales. El dficit de
vitaminas A

produce ceguera nocturna, sequedad en los ojos y en la piel y

afecciones diversas de la mocosa.

Mientras que por otro lado el exceso de este puede provocar alteraciones Oseas
y hemorragias en diversos tejidos.
La vitamina A

se encuentra principalmente en productos lcteos, mantequilla,

queso, huevo, carne. Hgado y aceite de hgado de bacalao.

Se destruye fcilmente por la accin de la luz con temperaturas elevadas.
Determinacin de la vitamina A
Los mtodos espectrofotmetro y fotmetros empleado en la determinacin de la
vitamina A

esta expuesto

a interferencias

de algunas sustancias

con la

presencia de carotenos, derivados y productos de descomposicin de la vitamina

A que de alguna forma podra absorber la luz en la regin ultravioleta o dar
colores similares con los reactivos utilizados en la determinacin fotomtrica . Por
ello estos mtodos no son suficiententemente especficos para determinar etas
vitaminas

agregando la confiabilidad de sus resultados dependern del xito

en los pasos de purificacin y en los procedimientos de trabajo.

En este sentido y buscando una ptima metodologa de anlisis en el presente
estudio

se realizaron la validacin

de la metodologa por HPLC

para

determinacin de vitaminas contenidas en alimentos infantiles instantneos.

Base histrica de cromatografa
La cromatografa es una tcnica de anlisis qumico utilizada para separar
sustancias puras de mezclas complejas. Esta tcnica depende del principio de
adsorcin selectiva (no confundir con absorcin). La cromatografa fue descubierta
por el botnico ruso, de origen italiano, Mikhail Tswett en 1906, pero su uso no se
generaliz hasta la dcada de 1930. Tswett separ los pigmentos de las plantas
(clorofila) vertiendo extracto de hojas verdes en ter de petrleo sobre una
columna de carbonato de calcio en polvo en el interior de una probeta. A medida
que la solucin va filtrndose por la columna, cada componente de la mezcla
precipita a diferente velocidad, quedando la columna marcada por bandas

horizontales de colores, denominadas cronogramas. Cada banda corresponde a

un pigmento diferente.
La cromatografa es probablemente la ms verstil de las tcnicas de separacin:
es aplicable a cualquier mezcla soluble o voltil. De hecho las tcnicas de
separacin suelen dividirse en dos grandes grupos: cromatografas y no
cromatografas. La eleccin de una tcnica cromatogrfica concreta depender de
la naturaleza y cantidad de la muestra, del objetivo de la separacin y de las
limitaciones del tiempo y equipo asequible.
Podemos

distinguir

tipos

de

cromatografa

dependiendo

si

la

fase

estacionaria/fase mvil es slido/lquido, lquido/lquido o lquido/gas:

Si es slido/lquido, cabe distinguir entre:

Cromatografa de adsorcin:
El slido adsorbe al componente que inicialmente estaba en fase mvil (liquida o
gaseosa) (Fuerzas de Van der Waals).
Cromatografa de cambio inico:
El slido es un cambiador de iones (fuerzas electrostticas).
Cromatografa de exclusin (o de geles):
El slido es un gel formado por polmeros no inicos porosos que retienen a las
molculas de soluto segn su tamao.
Cromatografa de afinidad:
Es un tipo especial de cromatografa de adsorcin, utilizada especialmente en
bioqumica, en la que un slido tiene enlazado un llamado ligando de afinidad que
puede ser por ejemplo, un indicador enzimtico o un anticuerpo.

Si es lquido/lquido, cabe distinguir:

Cromatografa de particin:
El soluto se reparte entra la fase mvil (lquido o gas) y la fase estacionaria.

Si es lquido/gas, cabe distinguir entre:

Cromatografa gas-liquido (CGL),

Que es una cromatografa de particin.
Cromatografa gas-slido (CGS),
Que es una cromatografa de adsorcin.
Si es un fluido supercrtico, (fluido calentado a una temperatura superior a la
temperatura crtica, pero simultneamente comprimido a una presin mayor que
su presin critica), se trata de la cromatografa de fluidos supercrticos (CFS), que
puede ser de particin o de adsorcin.
Las tcnicas cromatografas, segn el dispositivo utilizado para conseguir la
separacin entre la fase mvil y la estacionaria, pueden ser: en columna y plana.
Cromatografa en columna:
Se utiliza un tubo cilndrico, en cuyo interior se coloca la fase estacionaria y a su
travs se hace pasar la fase mvil. El flujo de la fase mvil (lquido o gas) a travs
de la estacionaria se consigue:
1) por presin,
2) por capilaridad,
3) por gravedad.

Cromatografa plana:
La fase estacionaria est colocada en una superficie plana que en realidad es
tridimensional, aunque una de sus dimensiones es muy reducida, por lo que puede
considerarse bidimensional. Se divide en dos tipos generales:
1. -Cromatografa en papel: en la que el papel absorbente acta como soporte de
la fase estacionaria (cromatografa de particin). Una muestra lquida fluye por una
tira vertical de papel absorbente, sobre la cual se van depositando los
componentes en lugares especficos.
2. -Cromatografa en capa fina: en la que un slido acta como fase estacionaria
(cromatografa de particin), se extiende en una capa delgada sobre una placa,
generalmente de vidrio.
El uso de la cromatografa est ampliamente extendido en el anlisis de alimentos,
medicinas, sangre, productos petrolferos y de fisin radiactiva.

Fase Mvil:
Efecto de desplazamiento ejercido sobre los componentes de la mezcla por una
fase mvil, que puede ser un lquido o un gas, sobre una fase estacionaria.
Fase estacionaria:
Efecto de retencin producido sobre los componentes de la mezcla por una fase
estacionaria, que puede ser slida o lquida, anclada a un soporte slido.
Tipos de cromatografa
Segn la naturaleza de la fase estacionaria y de la fase mvil.
a. Slido Liquido (Estacionaria= Slida y la Mvil = Liquida)
b. Liquido Liquido (Estacionaria= Liquido anclado a un soporte solido)

c. Liquido Gas (Estacionaria= Liquido no voltil impregnado en un slido y la

Mvil = Gas)
d. Slido Gas (Estacionaria = Solida y la Mvil = Gas)
Realizacin de la cromatografa en capa fina:
En este apartado se realizaran 4 placas de cromatografa 4'5 x 5 cm, las cuales
solo se podrn coger por los bordes y nunca tocar la parte de celulosa (la blanca),
porque ello acarreara errores en la medicin.
Una vez obtenidas las placas, marcamos a lpiz una lnea a 1 cm de la base.
Sobre esa lnea marcamos 7 puntos, donde se depositaran con las capilares
pequeas cantidades de las muestras.
En los vasos de precipitado, que actan como tanque de elucin, se pondrn las
disoluciones. Utilizaremos 4 disoluciones de acetato de etilo (Ae) y hexano (Hex),
cuyas composiciones sern del 20, 40, 60 y 80 % de Ae/Hex. Solamente
utilizaremos 5 ml de cada disolucin, la cual no debe sobrepasar la lnea dibujada
a lpiz.
Finalmente se revelarn las placas usando dos agentes reveladores:

Revelador fsico,
Usaremos una lmpara de rayos UVA, donde pondremos con unas pinzas
las placas cromatografas. Las marcas que aparezcan se sealarn con
lpiz.

Revelador qumico,
Una vez pasada la placa por los rayos UVA, se introducir con una pinza
en un revelador anisaldehdo y posteriormente ser colocada en una placa
calefactora a 100 C. Finalmente anotamos los colores obtenidos.

Campos de Aplicacin de HPLC

Frmacos: Antibiticos, sedantes esteroides, analgsicos

Bioqumica: Aminocidos, protenas, carbohidratos, lpidos

Productos de alimentacin: Edulcorantes artificiales, antioxidantes,

aflatoxinas, aditivos

Productos de la industria qumica: Aromticos condensados, tensoactivos,

propulsores, colorantes

Contaminantes: fenoles, Pesticidas, herbicidas, PCB

Qumica forense: Drogas, venenos, alcohol en sangre, narcticos

Medicina clnica: cidos biliares, metabolitos de drogas, extractos de orina,

estrgenos.

OBJETIVO
Determinar

de

la vitamina A

esta expuesto

a interferencias

sustancias con la presencia de carotenos, derivados y productos

Conocer las partes de la cromatografa de gases

MATERIALES Y MTODOS

de algunas

Equipo

Equipo de cromatografa de liquida de

alto rendimiento(hplc) de marca

shimadzu
Inyector automtico
Bomba de sistema de desgasificacin
Integrador o sistema de registro
Software para el procesado de datos cromatograficos
Detector de arreglos d diodos(longitud de banda variable)
Columna cromatografa de acero inoxidable para fase reversa (25cm *
4,6cm de dimetro interno. 5mm de dimetro de partcula con columna de
cartucho)

Descripcin de equipo

CONDICIONES DE OPERACIN

Sistema isocratico
Flujo 1.2ml/min
Volmenes de inyeccin de 20ml
Deteccin UV 242nm
Temperatura de horno
Ambiente
Tiempo de corrida 7min
Fase mvil: metanol al 100% grado HPLC.

REACTIVOS

Metanol grado HPLC

Estndar all-transretinol
Hexano p.a.
Etanol absoluto p.a.

Solucin de hidrxido de potasio al 50%

BHT o cido ascrbico
Agua tridestilada
Solucin stock estndar de vitamina A : se disolvieron 100mg
del

estndar

en

100ml

de

etanol

aproximadamente 0.002gramos de BHT

absoluto

con

y se guard

la

solucin en congelacin ( -20)

PROCEDIMIENTO

Se pesaron 20 gramos de la muestra de alimento infantil un recipiente

de base plana y se adiciono 70ml de etanol absoluto ambas mezclas se
colocaron

en los tubos de reflujo y se agito

hasta su ebullicin con

corriente de nitrgeno.
Luego se adiciono 20ml de solucin de KOH al 50% saponificando la
mezcla por 30min con agitacin moderada. Antes de finalizar esta etapa se
enjuago el contenido con 50 ml d agua en 3 porciones
La solucin se enfri a temperatura ambiente y luego se filtr al vaco,
colocando rpidamente el contenido en un embudo de decantacin de
250ml

a la cual se adiciono 50 ml de hexano p.a. para proceder a la

extraccin.
Se agito la mezcla por 20min y al separarse se evidencia la formacin de
la fase orgnica (en la parte superior) el cual se trasvaso en un baln de
250ml de base redonda que contena aproximadamente 0.5gramos de
BHT o cido ascrbico .se efectu dos veces ms al extraccin

y se

juntaron los extractos en el baln de 250ml

Se evaporo a sequedad el solvente haciendo uso de un rota vapor con
bao de agua a 40C
Se diluyo inmediatamente con metanol gradoHPLC el residuo y se llev a
un volumen de un matraz volumtrico de 10ml
Finalmente se pas la solucin fina por un filtro de 0.2mm llenando en
viales mbar de 2ml colocarlos en el inyector de la cromatografa.

CLCULOS
Concentracin de vitamina A (mg/g o ppm)=am*cs*d/as wm
Dnde:
Am: rea del pico de vitamina A en la muestra
As: rea del pico de vitamina A en el estndar
Cs: concentracin de vitamina en el estndar mg/ml
D: factor de dilucin
Wm: peso de la muestra g

CONCLUSIN
De acuerdo a los resultados obtenidos podemos concluir que el mtodo de
ensayo es por HPLC es preciso, exacto, especifico y sensible para los parmetros
evaluados en este estudio ya que se encuentra ron dentro de rangos establecidos.

BIBLIOGRAFIA
cromatografa lquida de alto rendimiento . Wiley. De la crtica Hung, LB; Parcher,
JF; Shores, JC; Ward, EH (1988). "Fundamentacin terica y experimental para la
programacin de superficie de cobertura en la cromatografa gas-slido con un
gas portador adsorbible"

Gerber, F.; Krummen, M.; Potgeter, H.; Roth, A.; Siffrin, C.; Spoendlin, C. (2004).
"Aspectos prcticos de la cromatografa lquida de alta resolucin en fase reversa
rpida usando partculas 3m columnas de relleno y columnas monolticas en el
desarrollo farmacutico y la produccin trabaja bajo buenas prcticas de
fabricacin actuales"