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INSTITUTO TECNOLOGICO

SUPERIOR DE CALKINI EN EL
ESTADO DE CAMPECHE
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ASIGNATURA:

BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR

MAESTRO:
DR. IVAN ALFREDO ESTRADA MOTA

CARRERA:
INGENIERIA BIOQUIMICA
OCTAVO SEMESTRE

INTEGRANTES:
SERGIO JOEL AMEZQUITA AKE 3845
KARIME AGELICA POOT UUH

3838

JOSE LUIS REYES CAN EK

3863

ZILA JAFET BALAM PUC

3994

INDICE
CAPITULO 1. INTRODUCCION..................................................................................4
CAPITULO 2. MARCO TEORICO...............................................................................6
2.1 ADN BACTERIANO............................................................................................ 6
2.1.1 EL GENOMA BACTERIANO: SU ESTRUCTURA..............................................6
2.1.2 FUNCIONES DE ADN..................................................................................9
2.1.3 REPLICACIN DEL ADN............................................................................. 10
2.1.4 ARN BACTERIANO..................................................................................... 11
2.1.5 TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENTICO...............................................11
2.2 PLASMIDOS.................................................................................................... 14
2.2.1 MANTENIMIENTO DE LOS PLASMIDOS.......................................................15
2.2.2 OBTENCION DE INSERTOS........................................................................15
2.3 EXTRACCIN DE ADN PLASMDICO:................................................................17
2.4 MEDIOS DE CULTIVO...................................................................................... 19
2.5 ELECTROFORESIS.......................................................................................... 21
2.6 ESPECTROFOTOMETRA DE ABSORCIN........................................................24
CAPITULO 3. JUSTIFICACION................................................................................27
CAPITULO 4. OBJETIVOS....................................................................................... 28
CAPITULO 5. MATERIALES Y METODOS................................................................29
5.1 DIAGRAMAS.................................................................................................. 29
5.2 CULTIVO DE MEDIO MASIVO LQUIDO.............................................................32
5.3 SEMBRADO DE BACTERIAS RECOMBINANTES...............................................32
5.4 ENSAYO DE MINIPREP.................................................................................... 33
5.5 ELECTROFORESIS......................................................................................... 34
5.6 ESPECTROFOTOMETRIA................................................................................35
CAPTITULO 6. RESULTADOS Y DISCUSION...........................................................36
6.1 RESULTADOS................................................................................................ 36
6.1.1 Resiembra de Bacterias Recombinantes en medio LB......................................36

~2~

6.1.2 Cultivo Masivo en medio LB Lquido..............................................................36


6.1.3 Extraccin de Plsmido por Miniprep.............................................................38
6.1.4 Electroforesis............................................................................................. 39
6.1.5 Espectrofotometra...................................................................................... 40
ECUACION PARA HALLAR LOS MICROGRAMOS..................................................41
6.2 DISCUSION.................................................................................................... 42
CAPITULO 7. CONCLUSIONES............................................................................... 43
CAPITULO 8. BIBLIOGRAFIA..................................................................................44

~3~

RESUMEN

~4~

CAPITULO 1. INTRODUCCION
Los plsmidos son molculas de DNA extracromosmico, circular y generalmente de
pequeo tamao que se encuentran en muchas especies bacterianas y que se pueden
replicar de manera independiente del DNA cromosmico. A diferencia de ste, los
plsmidos no son necesarios para la viabilidad general de la clula, pero pueden
contener genes que contribuyen a la supervivencia en condiciones especiales, como los
que confieren resistencia a antibiticos, a metales etc. Algunas clases de plsmidos
poseen adems la propiedad conocida como "replicacin relajada", esto es, estn
presentes en forma de muchas copias por clula, lo que facilita enormemente su
aislamiento y purificacin.1
Los plsmidos poseen un inters singular en Ingeniera Gentica por ser uno de los
sistemas vectores ms sencillos de usar. Un vector de clonacin es un sistema que
permite introducir en una clula hospedadora un fragmento de DNA que se pretende
clonar; en esta clula hospedadora el vector se replica y expresa, en su caso. La
molcula que resulta de la unin de un DNA vector con el DNA de inters (denominado
entonces "inserto") se denomina molcula de vector recombinante. 1
Existen unos requerimientos bsicos que un plsmidos debe poseer para que sea un
buen vector al aplicar su uso en la biologa molecular. El mismo debe poseer un origen
de replicacin, un gen para un marcador de seleccin (ya sea resistencia a algn
antibitico) y un lugar de clonaje mltiple (MCS). El MCS es una regin donde pueden
digerir varias enzimas de restriccin pero solamente una vez. 2
Existe una gran variedad de mtodos para el aislamiento de ADN plasmdico, en
particular para aquellos plsmidos encontrados en

Escherichia coli y otras

enterobacterias. Estos mtodos se diferencian en la pureza del producto final, en el


tiempo necesario para llevarlos a cabo y en la posibilidad de aplicarlos en aislamientos
a pequea o gran escala; sin embargo todos incluyen tres etapas comunes: crecimiento
de las bacterias y amplificacin del plsmido, cosecha y lisis de las bacterias y
purificacin del ADN plasmdico.3

~5~

Se debe conocer si el DNA a ser extrado proviene de una clula procaritica o


eucaritica dado que los componentes que forman la pared y membrana celular de
estos organismos es distinta. Existen diversos mtodos de extraccin de DNA que se
ajustan a las necesidades de cada tipo de muestra, estos incluyen tratamientos fsicos,
qumicos, enzimticos o una combinacin de los mismos. 2
El procedimiento de desnaturalizacin alcalina, descripto por Birnboim & Doly constituye
la base de varios protocolos de extraccin de ADN plasmdico. Para la extraccin de
ADN plasmdico se lisan las clulas por el agregado de un detergente (por ejemplo
SDS) y NaOH. Las condiciones alcalinas (pH 12-12,5) desnaturalizan por completo las
molculas lineales de ADN, pero no las molculas CCC (las cuales sufren una
desnaturalizacin parcial). El ADN cromosmico estar en mayoritariamente en forma
fragmentada (mltiples molculas lineales) y el plsmido que en relacin es ms
pequeo, se mantendr cerrado. Cuando el extracto celular es neutralizado (por
ejemplo con cido actico) bajo condiciones de alta concentracin salina (acetato de
potasio), el ADN cromosomal precipita; obedeciendo a la reasociacin inespecfica de
las largas cadenas de ADN simple cadena, que ocurre en mltiples sitios formando una
masa insoluble. Parte del ARN precipita, pero siempre quedan cantidades detectables
de esta molcula, a menos que se utilicen RNasas durante el proceso de extraccin.
Tambin precipitan algunas protenas debido a que la reaccin se realiza en presencia
de SDS y alta fuerza inica, pero la extraccin mayoritaria de las protenas se realiza
posteriormente con cloroformo. Finalmente, el ADN purificado se suele concentrar
mediante precipitaciones alcohlicas. El cambio de polaridad del medio que genera el
agregado de alcohol, y la disminucin de la temperatura vuelven insoluble al ADN,
pudindose recuperar en un precipitado si es centrifugado a altas velocidades. Este
protocolo es comnmente utilizado para minipreps de ADN plasmdico, es decir
extracciones a partir de un pequeo volumen (1-1,5 ml) de cultivo bacteriano saturado.

~6~

CAPITULO 2. MARCO TEORICO


2.1 ADN BACTERIANO
Las bacterias son microorganismos con una extraordinaria capacidad de
adaptacin a diferentes condiciones ambientales. Para comprender la esencia de esta
capacidad es importante conocer las bases de su gentica, es decir como est
organizada la informacin gentica, como realizan y regulan su expresin, que
mecanismos de variacin gnica poseen.
Entre otras, la capacidad infecciosa de las bacterias patgenas, radica en que poseen
la informacin gnica necesaria para colonizar los tejidos de un husped, invadirlos y/o
producir sustancias txicas que en definitiva causarn la enfermedad.
Por otro lado, el conocimiento del modo de funcionamiento gentico de las
bacterias, sumado al hecho de que estos microorganismos son de relativo fcil manejo
en el laboratorio, que en general tienen un rpido crecimiento, ha llevado a que
podamos utilizarlos para sintetizar productos tiles a la medicina, tanto para el
diagnstico como para la prevencin y tratamiento de varias enfermedades. Estas
posibilidades se han visto incrementadas a partir del desarrollo de la ingeniera gentica
y la disponibilidad de tcnicas de biologa molecular. 4

2.1.1 EL GENOMA BACTERIANO: SU ESTRUCTURA


Toda la informacin gentica esencial para la vida de la clula bacteriana, est
contenida en una nica molcula de ADN de doble cadena, circular y covalentemente
cerrado, a la que podemos referirnos como cromosoma bacteriano. Muchas bacterias,
poseen adems ADN extra cromosmico, tambin circular cerrado, denominado ADN
plasmdico, por estar contenido en estructuras llamadas plsmidos, que portan
informacin gnica para una variedad de funciones no esenciales para la clula en
condiciones normales de crecimiento.

~7~

En trminos bioqumicos, la composicin y estructura de los cidos nucleicos


bacterianos, es la misma que para cualquier clula.
Brevemente, conviene recordar que los cidos nucleicos son macromolculas
compuestas de nucletidos unidos en forma covalente por medio de enlaces
fosfodiester entre los carbonos de las posiciones 3 y 5 de dos residuos de azcares
adyacentes, que conforman un esqueleto de azcares y fosfatos que es constante a lo
largo de toda la macromolcula.
La variacin entre los distintos nucletidos que conforman la cadena de cido nucleico,
est dada por sus bases nitrogenadas, que en el caso del ADN son Adenina (A), Timina
(T), Citosina (C) y Guanina (G), y en el caso del ARN en vez de T se encuentra Uracilo
(U). A y G se denominan bases pricas o purinas, mientras que T, U, y C se denominan
bases pirimidnicas o pirimidinas. De esta manera, una cadena o hebra de cido
nucleico, tendr una estructura primaria determinada por la secuencia de las bases que
la componen. 4

~8~

El

ADN

como

macromolcula,

est

compuesto por 2 cadenas nucleotdicas o


hebras antiparalelas, que se enlazan
entre si conformando una doble hlice.
Los enlaces entre las dos hebras de ADN
estn dados por puentes de hidrgeno
entre las purinas de una cadena con las
pirimidinas de la otra. De esta forma, la A
forma dos puentes de hidrgeno con la T,
mientras que la C forma 3 puentes de
hidrgeno con la G. A esto se le llama
complementariedad de bases, es decir
que la A es complementaria a la T y la C
lo es a la G. (Fig. 1) Estos enlaces
permiten mantener estable la estructura
de la doble hlice de ADN en la que
pueden distinguirse pares de nucletidos o mejor dicho pares de bases (pb).
Estos pb pueden utilizarse como unidad de tamao o longitud para las molculas de
ADN, y de esa manera podemos decir por ejemplo que el ADN cromosmico de
Escherichia coli tiene un tamao de 4,2 millones de pb o lo que es lo mismo 4.200
kilobases (Kb).
Como sabemos, todas las clulas deben enfrentarse al problema de como lograr
contener en su estructura molculas tan grandes como el ADN. Volviendo al ejemplo de
E. coli, los 4.200 Kb de su genoma, implican una longitud de 1,3 mm, es decir unas
1.000 veces la longitud de la clula. Las bacterias, no poseen histonas asociadas a su
genoma y por tanto no tienen la posibilidad de compactar su ADN en estructuras tipo
nucleosomas como las clulas eucariotas. Por lo tanto, deben solucionar el dilema de
como compactar su cromosoma de otra manera. 4

~9~

Esto se logra, porque el ADN circular cerrado es capaz de adoptar una estructura
terciaria denominada de superenrollamiento, que implica el enrollamiento del eje de la
doble hlice sobre s mismo. (Fig. 2)
Este superenrollamiento se dice que tiene
sentido negativo, porque es en el sentido
contrario al del enrollamiento de una hebra de
ADN sobre la otra, y supone para la bacteria
una fuente de almacenamiento de energa
para ser utilizada en una variedad de procesos
fisiolgicos que la requieren, como por ejemplo
la separacin de las 2 hebras de ADN
necesaria para la replicacin y la transcripcin.
El cromosoma bacteriano, es suficientemente
largo como para formar varios lazos circulares,
que

como

tales

pueden

su

vez

superenrollarse, formando de esta manera una


serie de dominios topolgicos independientes.
Esta organizacin en dominios, colabora al
estado de compactacin general del genoma
bacteriano, e impide que con la ruptura de una hebra en un punto cualquiera del
cromosoma, se pierda el total del superenrollamiento, manteniendo de esta forma la
energa almacenada.
Las bacterias poseen enzimas capaces de alterar la estructura del ADN modificando su
superenrollamiento. Estas enzimas que se genricamente "topoisomerasas", actan
introduciendo o eliminando vueltas superhelicoidales, cumpliendo un importante rol en
los procesos de replicacin y transcripcin del ADN. Por otra parte, es interesante
mencionar que algunas de estas topoisomerasas, como la ADN girasa, son blanco de
accin para los antibiticos del grupo de las quinolinas, como el cido nalidxico.

~ 10 ~

2.1.2 FUNCIONES DE ADN

El ADN confiere a la bacteria todas sus caractersticas genticas. El cromosoma se


subdivide en segmentos denominados loci que actan como unidades genticas
funcionales (genes). Cada gen posee una secuencia de bases y por lo tanto,
determina la estructura de un polipptido. La localizacin de cada gen dentro de un
cromosoma constituye el denominado mapa gentico de la bacteria. Se ha
establecido que la composicin de bases de un cromosoma se expresa como el
porcentaje de guanina-citosina sobre el nmero total de bases y este porcentaje

puede ser utilizado para estudiar relaciones filogenticas entre diferentes bacterias.
Interviene en los mecanismos de transferencia gentica de bacteria madre a hija.
La duplicacin del ADN trae aparejada la simultnea divisin celular.
Regula la sntesis proteica ya que es capaz de portar genes que codifican hasta
4.000 cadenas poli-peptdicas diferentes, cuya sntesis requiere la formacin inicial
de ARN a partir del ADN mediante la ARN-polimerasa en un proceso denominado
transcripcin. 5

2.1.3 REPLICACIN DEL ADN


El ADN se reproduce mediante un mecanismo semiconservador, o sea que las
cadenas se separan y cada una de ellas acta como un molde para la nueva cadena
suplementaria que se ir formando, obtenindose como resultado dos nuevas hlices
dobles idnticas a la original (Figura 3).
El cromosoma es considerado un replicn, es decir, que es quien decide el momento de
duplicarse pues es portador de los genes iniciador y autoduplicador. El autoduplicador
es el gen que est unido a la ADN-polimerasa y el iniciador es el gen que le informa al
autoduplicador para que comience la replicacin.
El autoduplicador estara unido a la membrana y ocupara un sitio del ADN denominado
oriC y en ese lugar ira girando la molcula de ADN (Figura 4). La duplicacin del ADN
por la ADN-polimerasa implica la ruptura de los puentes de hidrgeno entre ambas
cadenas y su separacin y esto ocurre por giro del cromosoma sobre el punto de unin
en el mesosoma. Terminada la replicacin los dos cromosomas se separan dividiendo el

~ 11 ~

mesosoma sobre el cual estaban fijos, asegurando al mismo tiempo la divisin


bacteriana mediante la formacin de septos. 5
2.1.4 ARN BACTERIANO
Son tres los tipos de ARN presentes en el citoplasma bacteriano:

ARN mensajero (ARNm) que lleva el menaje gentico que codifica la sntesis de

protenas recogida en forma de tripletes de bases (codones).


El ARN ribosmico (ARNr) que es quien traduce el mensaje del ARNm. Consta de

Fig. 3. Duplicacin del ADN bacteriano


en dos cadenas idnticas.

dos

subunidades (50S y 30S) con dos lugares

Fig. 4. Replicacin del ADN a partir de


su unin al mesosoma y posterior
divisin en dos cadenas completas.

funcionales: aminoacil o aceptor (sitio A) donde se unen los aminocidos y peptidil

o dador (sitio P).


El ARN de transferencia (ARNt) es el encargado de transportar los aminocidos
hacia el ribosoma para realizar la sntesis proteica.

2.1.5 TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENTICO


Las bacterias pueden cambiar su composicin gentica no slo por mutaciones
sino por la adquisicin de ADN proveniente de otras bacterias o virus. Estas

~ 12 ~

transferencias pueden llevarse a cabo por los siguientes mecanismos: Transformacin,


Transduccin, Transfeccin, Conversin y Conjugacin.
El ADN transferido se denomina exogenote por su condicin de extrao y puede
permanecer libre en el citoplasma bacteriano o incorporarse al ADN cromosmico
(endogenote) en un proceso de recombinacin o integracin.
TRANSFORMACIN
Ciertas bacterias son capaces de tomar ADN exgeno a partir del medio
ambiente e integrarlo a su cromosoma propio. El ADN se fija a la pared celular, es
dividido en pequeos fragmentos, atraviesa la membrana citoplasmtica y en el interior
se separan las dos cadenas de las cuales slo una se integrara al cromosoma.
TRANSDUCCIN
Es la transferencia de un fragmento de ADN de una bacteria a otra por
intermedio de un bacterifago cuyo cido nucleico es un ADN bicatenario. La
transduccin puede ser generalizada o restringida.
Transduccin generalizada: al ingresar el fago induce una nucleasa que fragmenta el
cromosoma bacteriano a la vez que se forma ADN vrico y protenas de envoltura viral.
Las protenas rodean al ADN vrico y a los fragmentos de ADN bacteriano. Se produce
la lisis celular con liberacin de los bacterifagos nuevos. Al infectarse una nueva clula
con el fago portador del fragmento de ADN bacteriano, la bacteria no es lisada sino que
el fragmento de ADN se incluye en el ADN de la bacteria infectada (Figura 5).

Fig. 5. Esquema de una transduccin generalizada completa. Termina


con una nueva clula infectada que adquiere un nuevo fragmento de
genoma bacteriano.

~ 13 ~

Transduccin restringida o especializada: Cuando un fago no ltico infecta una bacteria,


el ADN fgico se incorpora al ADN bacteriano (profago) y la bacteria permanece en
estado lisognico hasta que algn factor induce la transformacin del profago en fago
vegetativo y es en ese momento en el que el profago se separa del ADN bacteriano
arrastrando algunos genes circundantes y la bacteria inicia un ciclo ltico con la
liberacin de bacterifagos portadores de genes propios y ajenos. Cuando este
bacterifago infecta a otra bacteria le transfiere ciertas caractersticas de la bacteria
anterior pero sin dar lugar a un ciclo ltico. (Figura 6).

Fig. 6: Esquema de una transduccin restringida. En la cual la bacteria


adquiere una porcin de ADN fgico y una porcin de ADN bacteriano.

TRANSFECCIN
Es la infeccin de la clula bacteriana con el ADN obtenido previamente de un
virus. El resultado es la produccin de virus completos dentro de la bacteria con la
posterior lisis de sta. Para que se produzca la transfeccin la bacteria debe estar en
estado de competencia. Tiene gran aplicacin en ingeniera gentica.
CONVERSIN
Cuando el ADN de un bacterifago se integra a un cromosoma bacteriano
estamos en presencia de una conversin lisognica y aunque no hay transferencia de
genes de una bacteria a otra, la bacteria infectada puede adquirir caractersticas que
ante no posea como ser la produccin de toxinas.
CONJUGACIN

~ 14 ~

Es la transferencia de material gentico de una bacteria a otra por contacto


directo entre ellas. La capacidad de transferir ADN est codificada en el plsmido que
se conoce como factor de transferencia o factor sexual. Las clulas que lo poseen se
llaman F+, masculinas o donantes y las que carecen de l se denominan F-, femeninas
o receptoras. El resultado de la conjugacin es una bacteria con las caractersticas de
las dos cepas progenitoras. Para que se realice la transferencia es necesaria la
presencia de pili sexuales (que son filamentos huecos) o de pili de sujecin o anclaje
que mantendran juntas a las dos clulas establecindose un puente entre las
membranas citoplasmticas por las que pasara el ADN. En algunas bacterias el factor
F+ se encuentra integrado en el cromosoma y estas clulas pueden transferir genes
cromosmicos a bacterias F- con gran frecuencia y se denominan Hfr (high frecuency
recombination). 5

~ 15 ~

2.2 PLASMIDOS
Los plsmidos son las molculas circulares de ADN de doble cadena que se
encuentran naturalmente en varias especies de bacterias. Estos elementos genticos
son extracromosomales, se replican de manera independiente del cromosoma
bacteriano y codifican para una gran variedad de enzimas que confieren resistencia a
antibiticos y metales pesados, degradan complejos orgnicos y/o producen toxinas,
etc. Dadas estas caractersticas, los plsmidos han sido empleados como vectores o
vehculos de clonacin de molculas de ADN forneas que permiten el transporte y
manipulacin del mismo. Es as como, hoy en da, se dispone de una gran variedad de
plsmidos sintticos de naturaleza modular con caractersticas diversas para lograr ya
sea clonacin de una fragmento de ADN genmico, de cADN o de PCRA, o para la
expresin de los mismos y obtencin del respectivo producto proteico. 6
Entre otras propiedades de los plsmidos que favorecen su utilizacin como vector de
clonacin se incluyen:
1. Su pequeo tamao que hace que el ADN sea fcil de aislar y manipular.
2. Su naturaleza circular que hace que el ADN sea ms estable durante la
extraccin.
3. Su origen de replicacin independiente del control directo de la replicacin del
cromosoma bacteriano.
4. Su mltiple nmero de copias, de manera que se aumenta la eficiencia de la
extraccin del ADN plasmdico.
5. La presencia de marcadores seleccionados, tales como genes de resistencia a
antibiticos, haciendo as ms fcil la deteccin y seleccin de las bacterias que
contienen plsmidos.
La estructura modular de todo plsmido comprende bsicamente:
1. Un origen de replicacin autnomo que permita un alto nmero de copias por
bacteria (replicacin relajada).
2. Genes de resistencia a antibiticos.
3. Marcadores de seleccin
4. Un sitio mltiple de clonacin, caracterizado por la presencia de los sitios nicos
para enzimas de restriccin, no encontrados en ninguna otra regin del plsmido.

~ 16 ~

2.2.1 MANTENIMIENTO DE LOS PLASMIDOS


El ADN plasmdico se puede mantener a -20 C por periodos prolongados y ser
introducido de nuevo en las clulas de nuevo en clulas hospedadoras competentes
cada vez que se necesite. Las clulas hospedadoras se eligen de acuerdo a las
caractersticas del ADN forneo.
Las clulas ms empleadas son las bacterias Escherichia coli K12, las cuales
han sido genticamente modificadas para dar lugar a un amplio rango de cepas con
caractersticas diferentes. En lneas generales, las clulas hospedadoras deben ser
hospitalarias, es decir, deben proporcionar las funciones necesarias y compatibles para
la replicacin del ADN vector y no lo deben degradar, as mismo deben ser accesibles
de manera que el ADN forneo pueda ser introducido en las mismas.
Actualmente, la introduccin de los plsmidos en la clula hospedadora se
realiza por calor o por electroporacin. En cualquier caso, la clula debe ser
previamente sometida para favorecer la introduccin del ADN forneo. Dicho proceso
se denomina adquisicin de competencia. 6

2.2.2 OBTENCION DE INSERTOS


Las plsmidos son un medio para mantener y amplificar las secuencias de ADN
forneas de inters. Para el estudio de dichas secuencias, primero que todo se debe
liberar el fragmento de inters (inserto) de plsmido en que se encuentra clonado.
Los plsmidos presentan un sitio mltiple de clonacin en donde se encuentran
sitios nicos para determinadas enzimas de restriccin, de manera que al realizar la
digestin del ADN plasmdico con la enzima de restriccin adecuada, generalmente la
misma enzima empleada en el proceso de clonacin, se obtiene la liberacin del inserto
clonado, lo cual se puede observar mediante electroforesis en geles de agarosa teidos
con bromuro de etidio. 6

~ 17 ~

Los genes de enzimas que confieren resistencia a diversos antibiticos han


hecho de los plsmidos un excelente mtodo para introducir genes extraos y verificar
su funcin. Esto se ha logrado debido a que muchos de los plsmidos nativos han sido
modificados por medio de la ingeniera gentica, dndole muchas ms ventajas para el
investigador como son: capacidad de expresin de las protenas clonadas, la presencia
de una secuencia con varios sitios nicos de restriccin para utilizarlos como blancos
en la clonacin, genes que codifican enzimas que facilitan la visualizacin de las clonas
positivas (ej. -galactosidasa) (Fig.7). 6
Una de las principales limitaciones para clonar determinadas secuencias en los
plsmidos es el tamao de las mismas; es por eso que cada da aparecen nuevos
vehculos de clonacin que ofrecen nuevas ventajas para los investigadores, llegando
incluso a permitir la clonacin de fragmentos de cromosomas. Sin embargo, los
plsmidos son, y seguirn siendo, los elementos de eleccin para obtener, manejar y
conserva secuencias de genes de inters dentro la investigacin cientfica. Otros
vectores utilizados son los bacterifagos de los que hablaremos ms adelante, y los
cosmidos que son vectores creadores para poder clonar grandes fragmentos de ADN.

Fig. 7: Esquema de un plsmido. A la derecha se observa el sitio de


clonacin con varios sitios nicos de restriccin.

~ 18 ~

2.3 EXTRACCIN DE ADN PLASMDICO.


Existe una gran variedad de mtodos para el aislamiento de ADN plasmdico, en
particular para aquellos plsmidos encontrados en

Escherichia coli y otras

enterobacterias. Estos mtodos se diferencian en la pureza del producto final, en el


tiempo necesario para llevarlos a cabo y en la posibilidad de aplicarlos en aislamientos
a pequea o gran escala; sin embargo todos incluyen tres etapas comunes: crecimiento
de las bacterias y amplificacin del plsmido, cosecha y lisis de las bacterias y
purificacin del ADN plasmdico.

La mayora de los mtodos explota, de una u otra forma, las diferencias existentes entre
el ADN cromosmico y el ADN plasmdico:
Los plsmidos tienen un pequeo tamao en relacin con el cromosoma bacteriano.
El ADN cromosmico de las bacterias es circular, pero al ser extrado la mayor parte
se obtiene fragmentado, en molculas lineales.
Los plsmidos son molculas de ADN circular, cerrado en forma covalentes (CCC
covalently closed circular).
El procedimiento de desnaturalizacin alcalina, descripto por Birnboim & Doly
constituye la base de varios protocolos de extraccin de ADN plasmdico. Para la
extraccin de ADN plasmdico se lisan las clulas por el agregado de un detergente (por
ejemplo SDS) y NaOH. Las condiciones alcalinas (pH 12-12,5) desnaturalizan por
completo las molculas lineales de ADN, pero no las molculas CCC (las cuales sufren
una desnaturalizacin parcial).

El ADN cromosmico estar en mayoritariamente en forma fragmentada


(mltiples molculas lineales) y el plsmido que en relacin es ms pequeo, se
mantendr cerrado. Cuando el extracto celular es neutralizado (por ejemplo con cido
actico) bajo condiciones de alta concentracin salina (acetato de potasio), el ADN
cromosomal precipita; obedeciendo a la reasociacin inespecfica de las largas cadenas
de ADN simple cadena, que ocurre en mltiples sitios formando una masa insoluble.
Parte del ARN precipita, pero siempre quedan cantidades detectables de esta molcula,

~ 19 ~

a menos que se utilicen RNasas durante el proceso de extraccin. Tambin precipitan


algunas protenas debido a que la reaccin se realiza en presencia de SDS y alta fuerza
inica, pero la extraccin mayoritaria de las protenas se realiza posteriormente con
cloroformo.

Finalmente,

el

ADN

purificado

se

suele

concentrar

mediante

precipitaciones alcohlicas. El cambio de polaridad del medio que genera el


agregado de alcohol, y la disminucin de la temperatura vuelven insoluble al ADN,
pudindose recuperar en un precipitado si es centrifugado a altas velocidades.
Este protocolo es comnmente utilizado para minipreps de ADN plasmdico, es decir
extracciones a partir de un pequeo volumen (1-1,5 ml) de cultivo bacteriano saturado.
En lneas generales, cuanto ms chico sea el plsmido, mejor es el resultado obtenido,
ya que a medida que se incrementa el tamao, sus propiedades se asemejan cada vez
ms a las del ADN cromosmico. Con plsmidos mayores a 25 kb el aislamiento se
hace dificultoso y el rendimiento es muy bajo. Sin embargo para los vectores de uso
rutinario el rendimiento es muy bueno y el producto obtenido es lo suficientemente puro
como para realizar digestiones con endonucleasas de restriccin sin necesidad de una
purificacin ulterior. 7

~ 20 ~

2.4 MEDIOS DE CULTIVO.


Un medio de cultivo es un sustrato o solucin de nutrientes en los que crecen y
se multiplican los microorganismos en el laboratorio, con el objeto de aislar diferentes
especies bacterianas, proceder a su identificacin y llevar a cabo una serie de estudios
complementarios. Los sustratos energticos y la materia orgnica sinttica (sustratos
como protenas, derivados de la celulosa etc.) pueden suministrarse por sustancias
nutritivas contenidas en la maceracin de carnes y vsceras. Los aminocidos o
pptidos los aportan peptonas, que contienen todos los productos de degradacin de
las protenas, sin vitaminas, y su composicin exacta vara segn el tipo de sustrato y
enzima utilizados, como pepsina, tripsina, papana, entre otros. Los factores de
crecimiento se suministran por maceracin y adicin de sangre: suero, extracto de
levaduras, lquidos ascticos, etc.8
El diseo y la optimizacin de medios de cultivo es una tarea cotidiana en
microbiologa. Sin embargo el concepto formal de optimizacin esta vagamente definido
entre los microbilogos y, la mayora de las veces los mtodos para hacerlo estn mal
empleados. La aparente razn que explica esta situacin es que el diseo y la
optimizacin de medios de cultivo son procesos matemticos que requieren de un
conocimiento mnimo de los mtodos estadsticos.

Disear y optimizar un medio de cultivo para lograr una respuesta poblacional


deseada tiene muchas ventajas, es decir, la definicin que se tenga de las condiciones
nutricionales facilita la comprensin e interpretacin de las respuestas fisiolgicas que
manifiestan la poblacin en estudio y tales respuestas se pueden magnificar. El diseo
de un medio de cultivo tiene como fin seleccionar el nmero mnimo de requerimientos
nutricionales (componentes qumicos) que promuevan la respuesta deseada (variable
de seguimiento), y la optimizacin es la bsqueda de las concentraciones de esos
componentes seleccionados que generan la mxima respuesta de la variable de
seguimiento.10
Algunas bacterias pueden crecer bien en casi cualquier medio de cultivo; otras
requieren medios especiales y otras no pueden crecer en ninguno de los medios inertes

~ 21 ~

existentes hasta ahora. Los microbios que se introducen en un medio de cultivo para
que comiencen a crecer se denominan inoculo. Los microbios que crecen y se
multiplican en un medio de cultivo se denominan cultivo. Para satisfacer los
requerimientos de los microorganismos que se desean cultivar se necesita que
contengan los nutrientes adecuados para el microorganismo de estudio que se desea
desarrollar. Tambin debe contener humedad suficiente, un pH ajustado de manera
apropiada y una concentracin conveniente de oxgeno, tal vez: ausente por completo.
El medio que se va a sembrar debe ser estril, es decir, en un principio no debe
contener microorganismos viables, de modo que el cultivo contenga solo los microbios
(y su descendencia) que se agreguen al medio. Por ltimo el medio sembrado debe
incubarse a la temperatura correcta.
Cuando se desea que las bacterias se desarrollen en un medio solido se agrega un
agente solidificante como el agar, que consiste en un polisacrido complejo proveniente
de un alga marina que se utiliza desde hace mucho tiempo como espesante de
alimentos como jaleas y helados. El agar posee algunas propiedades muy importantes
que lo convierten en valioso para la microbiologa y nunca se encontr un sustituto
satisfactorio. Pocos microorganismos pueden degradar el agar, de modo que
permanece en estado slido. Los medios con agar suelen utilizarse en tubos de ensayo
o en placas de Petri. Los tubos de ensayo se denomina tubos en pico de flauta o
inclinados cuando el medio se solidifica manteniendo el tubo en un ngulo adecuado
para lograr una gran variedad de superficie para el crecimiento. Los cultivos en placas
de Petri, denominados as en honor a su inventor, se realizan en placas pocos
profundad con una tapa que cubre perfectamente la base para evitar la contaminacin.
Para favorecer el crecimiento microbiano en medio debe de proporcionar una fuente de
energa as como fuentes de carbono, nitrgeno, azufre, fosforo y cualquier otro factor
de crecimiento que el organismo no pueda sintetizar. Un medio qumicamente definido
es uno del que se conoce la composicin qumica exacta. En el caso de un
microorganismo quimiohetertrofo, el medio qumicamente definido debe contener
factores de crecimiento orgnicos que acten como fuente de carbono y energa. 11

~ 22 ~

Antes de 1930, la preparacin de los medios de cultivo inclua la incorporacin y


medicin de cada uno de los componentes del medio e incluso la preparacin de
algunos de ellos: por ejemplo, los extractos de carne. En la actualidad, la preparacin
de la mayora de los medios de uso rutinario es un proceso mucho ms simple, debido
a que estn disponibles comercialmente en forma de polvos deshidratados complejos y,
solo hay que disolverlos en la cantidad de agua indicada, ajustarles el pH, distribuirlos
en tubos y esterilizarlos.12

2.5 ELECTROFORESIS
La electroforesis en gel de agarosa es un mtodo bastante til para separar,
identificar y purificar fragmentos de ADN. La agarosa es un polmero lineal, extrado de
algas marinas, en el cual las molculas de ADN de doble cadena migran de manera
inversamente proporcional al logaritmo en base 10 (log 10) de sus tamaos
moleculares. Dado que el ADN est cargado negativamente debido a los grupos
fosfatos de la molcula, la migracin en la cmara de electroforesis ocurre del polo
negativo al polo positivo.
Entre los factores que afectan la tasa de migracin del ADN en los geles de agarosa
incluyen:
El tamao del fragmento.
Como ya se mencion, las molculas lineales de ADN de doble cadena se desplazan
en los geles de agarosa de una manera inversamente proporcional la log 10 de sus
tamaos moleculares, de modo que a menor tamao, mayor velocidad de migracin.
Concentracin de agarosa
Existe una relacin lineal entre el logaritmo de la movilidad electrofortica del ADN y la
concentracin del gel: a mayor concentracin menor rango de separacin.
La concentracin del ADN

~ 23 ~

Las molculas circulares y las lineales presentan diferencias en su migracin a travs


de la matriz agarosa; es as como las formas circulares plegadas migran ms rpido
que las formas circulares con rompimiento s del enlace fosfodiester en una de las
cadenas y que las formas lineales.
Voltaje aplicado
A voltaje bajo la migracin de las molculas lineales es proporcional al voltaje aplicado.
Sin embargo, si la fuerza inica del campo es elevada, la movilidad de los fragmentos
de alto tamao molecular se incrementa diferencialmente. Por lo tanto, el rango de
separacin efectiva en los geles de agarosa decrece cuando se eleva el voltaje
aplicado.
Amortiguador utilizado.
La migracin del ADN se ve afectada tanto por la composicin como por la fuerza inica
del amortiguador empleado, de manera que se debe establecer un balance de iones
que genere fuerza inica suficiente para lograr la conductancia elctrica, sin exceder y
ocasionar en el peor de los casos un calentamiento excesivo con fusin de la agarosa y
desnaturalizacin de ADN. Entre los amortiguadores ms empleados se encuentran:
Tris-acetato-EDTA, Tris-borato-EDTA (TBE) y Tris-fosfato-EDTA (TPE). 6
Los cidos nucleicos de un tipo determinado pueden separarse por electroforesis en
geles de poliacrilamida, ya que sus movilidades electroforticas en esos geles varan en
proporcin inversa a sus masas moleculares. Sin embargo, los DNA de ms de unos
pocos miles de bases son muy grandes para penetrar los geles de poliacrilamida, aun
los menos entrecruzados. Esta dificultad se soluciona en parte por el uso de geles de
agarosa. Los geles con bajo contenido de agarosa permiten el fraccionamiento de
molculas de DNA relativamente grandes en distintos rangos de tamao. De esta
manera, por ejemplo, pueden separarse los plsmidos del DNA cromosmico
bacteriano de mayor tamao.
Las distintas bandas de DNA presentes en un gel deben detectarse para poder
aislarlas. El DNA de doble cadena se tie con facilidad por cationes aromticos polares,

~ 24 ~

como el ion etidio, el naranja de acridina o la proflavina. Estos colores se unen al DNA
de doble cadena por intercalacin (se deslizan entre los pares de bases) y al iluminarlos
con la luz UV producen fluorescencia mucho ms intensa que la generada por el
colorante libre. En un gel teido con bromuro de etidio pueden detectarse cantidades de
DNA tan pequeos como 50 ng. El DNA de cadena simple y el RNA tambin estimulan
la fluorescencia del ion etidio, pero en mucha menor media que el DNA de doble
cadena.
La electroforesis en gen convencional puede separar DNA de hasta 100000 pares de
bases, inclusive cuando los geles contienen tan solo 0.1% de agarosa, sin embargo el
desarrollo de la electroforesis en gel de campo pulsado (EGCP) por Charles Cantor y
Cassandra Smith extendi este limite a DNA de hasta 10 millones de pares de bases
(6.6 millones de kDa).13
La electroforesis en gel es una tcnica muy utilizada para separar molculas o
fragmentos de molculas de cidos nucleicos. Los materiales ms comunes para
separar molculas de cidos nucleicos son polmeros como la poliacrilamida o la
agarosa. Estos geles se colocan en la cubeta de electroforesis, sumergidos en un
tampn de pH alrededor de 8. De esta forma, las molculas de DNA o RNA sometidas a
electroforesis se desplazarn al polo positivo ya que a pH superiores a 5 poseen carga
negativa. Los geles se comportan como un tamiz molecular y permiten separar
molculas cargadas en funcin de su tamao y forma. As, molculas de DNA de
diferente tamao, van a emigrar de forma distinta en un gel de electroforesis. 14
El aparato electrofortico moderno tiene los siguientes componentes: un contenedor
que evite la contaminacin y derramamiento de las biomolculas, dos polos que
atraern a las biomolculas, una fuente de poder generadora de campo elctrico
regulable, una matriz que permita un segundo punto de resolucin y, finalmente, una
solucin amortiguadora de pH que mantenga la integridad de las biomolculas.

15

Algunas aplicaciones electroforticas de alta resolucin requieren que el aparato pueda


ser enfriado para evitar la formacin de corrientes. Otros tienen sistemas de
observacin en tiempo real (Invitrogen, 2008a) o sistemas pticos automatizados.
Algunos ms han sido adaptados para no solamente realizar electroforesis sino tambin

~ 25 ~

para transferir las biomolculas que se separaron en la matriz a una superficie donde
puedan ser fijadas. Este mtodo se conoce como electrotransferencia y se emplea para
aplicaciones de hibridacin en membrana.16
La electroforesis en agarosa es accesible debido a su bajo costo, a la diversidad de
diseos de cmaras, y a que es fcil de preparar. El uso de acrilamida como matriz
slida, en lugar de la agarosa, aumenta la resolucin a la escala de pares de bases y se
aplica en el monitoreo de los pequeos ARNs, la separacin de molculas durante la
secuenciacin y en la separacin de molculas de pesos moleculares similares pero
diferente composicin de nucletidos en gradientes desnaturalizantes.
El aparato electrofortico ms miniaturizado es el Bioanalyzer 2100. Esta mquina
realiza la electroforesis en matrices de tan solo 1 2 mm (a diferencia de las matrices
tradicionales que pueden medir varios centmetros) con gran resolucin gracias a un
sistema ptico-digital de lectura. El aparato electrofortico ms automatizado es
QIAxcel. Est basada en micro electroforesis en capilares y permite la visualizacin de
los datos en tiempo real. Se puede realizar el procesamiento de miles de muestras de
forma automtica. Los costos elevados de estos aparatos son prohibitivos para
laboratorios individuales, pero se les encuentra en instalaciones compartidas.15

2.6 ESPECTROFOTOMETRA DE ABSORCIN.


La espectrofotometra UV-visible es una tcnica analtica que permite determinar
la concentracin de un compuesto en solucin. Se basa en que las molculas absorben
las radiaciones electromagnticas y a su vez que la cantidad de luz absorbida depende
de forma lineal de la concentracin. Para hacer este tipo de medidas se emplea un
espectrofotmetro, en el que se puede seleccionar la longitud de onda de la luz que
pasa por una solucin y medir la cantidad de luz absorbida por la misma.
Fue uno de los primeros mtodos fsicos que se aplic al anlisis cuantitativo y a la
determinacin de estructuras, sin embargo, a la escasa informacin cualitativa que
proporciona impide la resolucin simultnea, de manera sencilla, de mezclas de
componentes con espectros solapados. La introduccin de tratamientos matemticos
de los espectros de absorcin as como de cualquier seal analtica, ha aumentado el
poder de resolucin de la espectrofotometra de absorcin. 17

~ 26 ~

Fue introducida en los comienzos de la segunda guerra mundial, aunque a pesar de


haber demostrado sus ventajas en la resolucin de problemas analticos especficos,
esta nueva tcnica se ha abierto camino con cierta dificultad. Esto debido a la falta de
equipos a precios razonables y a la limitacin de esta tcnica a la obtencin de la
primera derivada. La introduccin de la diferenciacin electrnica ha hecho posible la
obtencin de derivadas de orden superior y ha abierto a la espectrofotometra de
derivadas a un amplio campo de aplicaciones a un precio razonable, aumentando
constantemente su popularidad como una tcnica de resolucin que permite la
deteccin y localizacin de las longitudes de onda de componentes mal resueltos, de
espectros complejos y la reduccin de interferencias debidas a la absorcin de fondo.
En la espectrofotometra UV-visible puede hacerse una distincin entre dos grandes
grupos de instrumentacin: fotmetros y espectrofotmetros. Los primeros son
instrumentos sencillos y baratos, que utilizan filtros para seleccionar la banda de
longitudes de onda que incide sobre la muestra. En cambio los espectrofotmetros son
aparatos ms complicados y caros que usan un sistema monocromados (prisma o red
de difraccin. Esto permite la variacin continua en la seleccin de la longitud de onda y
por tanto, la regin espectral permitida es muy amplia. Como sistema de deteccin usan
fototubos o fototubos multiplicadores.18
El fundamento de la espectroscopia se debe a la capacidad de las molculas para
absorber radiaciones, entre ellas las radiaciones dentro del espectro UV-visible. Las
longitudes de onda de las radiaciones que una molcula puede absorber y la eficiencia
con la que se absorben dependen de la estructura atmica y de las condiciones del
medio (pH, temperatura, fuerza inica, constante dielctrica), por lo que dicha tcnica
constituye un valioso instrumento para la determinacin y caracterizacin de
biomolculas.
La regin UV se define como el rango de longitudes de onda de 195 a 400 nm. Es una
regin de energa muy alta. Provoca dao al ojo humano as como quemadura comn.
Los compuestos con dobles enlaces aislados, triples enlaces, enlaces peptdicos,
sistemas aromticos, grupos carbonilos y otros heterotomos tienen su mxima
absorbancia en la regin UV, por lo que sta es muy importante para la determinacin
cualitativa y cuantitativa de compuestos orgnicos. Diversos factores -como pH,

~ 27 ~

concentracin de sal y el disolvente- que alteran la carga de las molculas, provocan


desplazamientos de los espectros UV.
La fuente de radiacin ultravioleta es una lmpara de deuterio.
En la regin visible apreciamos el color visible de una solucin y que corresponde a las
longitudes de onda de luz que transmite, no que absorbe. El color que absorbe es el
complementario del color que transmite.
Por tanto, para realizar mediciones de absorcin es necesario utilizar la longitud de
onda en la que absorbe luz la solucin coloreada.
La fuente de radiacin visible suele ser una lmpara de tungsteno y no proporciona
suficiente energa por debajo de 320 nm.
Ley de Lambert-Beer
Esta ley expresa la relacin entre absorbancia de luz monocromtica (de longitud de
onda fija) y concentracin de un cromforo en solucin:
A = log I/Io = cl
La ley de Lambert-Beer se cumple para soluciones diluidas; para valores de c altos,
vara con la concentracin, debido a fenmenos de dispersin de la luz, agregacin de
molculas, cambios del medio, etc.17

~ 28 ~

CAPITULO 3. JUSTIFICACION
Es importante recalcar que los plsmidos poseen un inters singular en la disciplina
de la Ingeniera Gentica por ser uno de los sistemas vectores ms sencillos de
usar. Un vector de clonacin es un sistema que permite introducir en una clula
hospedadora un fragmento de DNA que se pretende clonar; en esta clula
hospedadora el vector se replica y expresa, en su caso por eso este tipo de
estudios son de suma importancia ya que se han podido hacer ciertas
combinaciones entre genes de diferentes especies, para as solucionar problemas
y/o enfermedades. Por ello recurrimos a la investigacin de diversos mtodos de
extraccin de este ADN plasmdico en su forma ms pura, en esta prctica se
utiliz la silica ya que por argumentos de otros artculos encontramos que utilizando
esta sustancia obtenemos un ADN plasmdico ms puro. Cabe mencionar que en
este documento es de importancia y de crecimiento para nuestra vida acadmica ya
que implico la investigacin de artculos para poder comparar y evaluar el mejor
mtodo a utilizar y con esto poder comparar resultados, sacar nuestras propias
conclusiones y saber cmo mejorar a la hora de la ejecucin de este tipo de
prcticas.

~ 29 ~

CAPITULO 4. OBJETIVOS

Preparar las soluciones y medios de cultivos utilizados en un laboratorio de


biotecnologa utilizando reactivos apropiados.
El objetivo de esta prctica consiste en la purificacin del DNA del plsmido

recombinante contenido en una cepa de la bacteria Escherichia Coli.


Familiarizarse con las propiedades de DNA plasmdico.
Conocer diversos mtodos de extraccin y purificacin de plsmidos.
Comparar los diversos mtodos de extraccin de DNA plasmdico.
Determinar la concertacin y pureza de DNA mediante espectrofotometra.

~ 30 ~

CAPITULO 5. MATERIALES Y METODOS


5.1 DIAGRAMAS EXPERIMENTALES
DIAGRAMA DE EXPERIMENTAL DE PREPARACION DE MEDIO LQUIDO
4.2 g CALDO
LAURIL
SULFATO DE
SODIO

rea de
Rehidratar
trabajo.

Preparacin del medio


CALDO Desinfectar
LAURIL
SULFATO DE SODIO

Verter

En 4 tubos 30 ml y
rotular por equipo

Punto
ebullicin

de

Calentar

Aforar

En matraz
Erlenmeyer 120
ml

Esterilzar

Autoclave a 121C

Enfriar y refrigerar

Por 24 hrs

Fermentar

A temperatura de
40 C por unos1015 minutos

DIAGRAMA EXPERIMENTAL DE SIEMBRA DE BACTERIAS RECOMBINATES


Siembra de bacterias
recombinantes

Destapar
tubo

Destapar placa de
bacterias

Colonia
lista para
aislar

Enfriar asa
Bacteria resembrada
en LB con el mtodo
de pentgono
Picar colonia
Fermentar 37 Cpor
24 hrs
Resguardar el medio
liquido y placas LB.

~ 31 ~

DIAGRAMA EXPERIMENTAL DE LA EXTRACCION DE PLASMIDO POR MINIPREP

Extraccin de Plsmido
por Miniprep

Centrifugar
Medio liquido

Clulas
resuspendidas
en tubo falcn.

Centrifugar 3
veces 3300
y 4400 rpm 8
minutos

Pastilla
resuspendida

Decantar SN
Agregar 200 l
Solucion 1.
Resuspension 2 tubos con
volmenes
iguales

Resuspension en
un medio adecuado

Verter en 2
tubos eppendorf

Pastilla

Agregar 200 l
Solucion 2 Lisis,
vortexear

Clulas lisadas, ADN


desnaturalizado,
protenas
precipitadas, plsmido
relajado en solucin

Vortexear
Agregar 200 l
de solucion 3.
Neutralizacion

Clulas
suspendidas,
listas para
invertir

1. Agregar
500 l
Solucion
lavado

SN en 2
tubos
nuevos listos
para
refrigeracin

Centrifugar
14500 rpm
por 5 min

Pastilla

Tubos
listos
para
la
estrategia con
solucin
de
Agregar 500 l
Solucion silica.
Centrifugar

Decantar

Pastilla

Pastilla
lavada
2. Agregar 50
l Agua grado
biologa
molecular

~ 32 ~

En
agua a
56C en
3
min

DIAGRAMA EXPERIMENTAL DE LA ELECTROFORESIS

ELECTROFORESIS
Disolucin de
agarosa

Pesar 0.3 gr
de Agarosa

Calentar a 45 C y
verter en la cmara
Geles en proceso.

Pipetear
7 l ADN
3 l colorante

Agregar la disolucin.
27 ml amortiguador
273ml agua de HPLC

Depositar
en el pozo

Lectura de electroforesis a 85V por 35


min

Teir gel con


C21H20N3Br

Florecimiento de los zurcos del ADN


para su lectura en la cmara UV

DIAGRAMA EXPERIMENTAL DE LA ESPECTROFOTOMETRIA


ESPECTROFOTOMETRIA

Invertir 20 veces

- 0.004 nm
-0.0085
nm

Pipetear
-991 l agua
molecular
-18 l
plsmido
Realizar
lectura de
absorbancia

~ 33 ~

Disolucin
menor de
1ml-100ml
2 cuarzos limpios.
1 ml Muestra
blanco (agua)
1 ml disolucion
Equipo
calibrado de 0
a 260 nm
-

5.2 CULTIVO DE MEDIO MASIVO LQUIDO


En la prctica se prepar el medio de cultivo CALDO LAURIL SULFATO DE SODIO, se
pes 4.2 g del medio y se diluyo en 120 ml de agua. Luego se agito y se calent en la
parrilla de agitacin, hasta que se diluyo bien el medio de cultivo. A cada equipo se le
reparti 30 ml en un tubo de ensayo y se rotulo el nombre del equipo. Se esteriliz en
autoclave a 121 C, enseguida se colocan los tubos pero no se tapan por completo. Se
apag por completo la autoclave, y se esper a que salga el vapor. Se sac los tubos
del autoclave y se cerraron bien todos los tubos. Despus se dej enfriar los tubos y se
refrigero.
Despus de 24 horas se sac un comisionado para que haga el encendido de las
campanas de extraccin y se esper 10 minutos para que se estabilice el flujo de la
campana. Se esterilizo la campana de extraccin y todos los materiales que se usaran
con alcohol y algodn bien mojado en toda el rea que usaremos. Y tambin nuestras
manos de los que trabajaran. Se encendi el esterilizador de perlas para esterilizar el
asa, colocando dentro el asa. Se sac los tubos que usaremos de refrigeracin. Se
meti al fermentador a una temperatura de 40 C para calentarlos unos 10 a 15 minutos
para poder atemperar el medio. Se meti a la campana de extraccin todos los
materiales para iniciar el sembrado. Picando una de las colonias de la placa, para luego
depositarlo en el medio lquido y se agito el asa para que la bacteria se suelte en l.
5.3 SEMBRADO DE BACTERIAS RECOMBINANTES
Para el sembrado se destapo el tubo que contiene el medio ligeramente. Se destapo la
placa que contiene las bacterias (se vio el espacio en que se enfri el asa). Se ubic la
colonia que se va aislar, y se cierra la placa. Se dej enfriar el asa en el medio de la
placa y se pic la colonia. As resembrando las bacterias en placa LB, tomando 1
colonia de bacterias y sembrando con el mtodo ya conocido de pentgono.

~ 34 ~

5.4 ENSAYO DE MINIPREP


Despus de 24 horas se sac los medios lquidos que estaban resguardados en la
incubadora y se procedi a centrifugar y enseguida se verti en un tubo falcn, sin
derramar lquido, y en caso de derramar limpiar lo cado con etanol. Se Coloc de
nuevo en la centrifuga tres veces, la primera 5 min a 3000rpm, luego 2 min por 4400
rpm y ultimo por 1 min a 4400 rpm. Se decant el sobrenadante (SN), en un frasco con
cloro y sacar el resto con un micro pipeta con cuidado, sin tocar la pastilla. Se tom la
pastilla un poco disuelta y se pas a colocar en dos tubos eppendorf igualando sus
volmenes de cada tubo.
A continuacin con el agregado de soluciones a estos tubos. A cada tubo se le agrego
200 l de solucin de resuspension, sin que la punta de la micropipeta tope con el tubo.
Y en este paso nuestro equipo, no us el vortex, tampoco se invirti; sino que
enseguida se le agrego 200 l de la solucin de lisis cada tubo. Se invirti y pasamos a
vortexear para la suspensin de la pastilla. Despus se agreg la solucin de
neutralizacin 200 l a cada tubo y ahora si de igual manera se invirti varias veces.
Se centrifugo los tubos a mxima velocidad 14, 500 rpm por 5 min. Se coloc el SN a
otro tubo sin tocar el debris celular. Y entramos en la parte de las estrategias, en el cual
a nuestro equipo le toco agregar 500 de solucin silica. Se invirti varias veces y se
centrifugo a mxima velocidad a 14500 rpm por 15 s, se aspir el SN y lo eliminamos,
se continu agregando 500 l de solucin de lavado. Se resuspendio la pastilla con el
vortex y Se centrifugo por 15 s. a 14500 rpm; se volvi a aspirar el SN, se centrifugo
para bajar el lquido de la pared de los tubos.
Por ltimo se sec a temperatura ambiente, de forma horizontal por 10 min. Se agreg
al tubo 50 l de agua grado biologa molecular y se resuspendio la pastilla con vortex.
Se calent agua a 56 C con tiempo de 3 min; se pas a centrifugar durante 30 s y se
extrajo el SN, colocando en un tubo nuevo para resguardarlo en el refrigerador a -20C

~ 35 ~

5.5 ELECTROFORESIS
Para la electroforesis se hizo un gel de agarosa a 1%, 30 ml de agua destilada. Se
pes 0.3 gr de gel agarosa. Enseguida pasamos a la preparacin del amortiguador TAE,
en una probeta se midi 27 ml de TAE, para el cual se us Agua a grado HPLC y se
aforo a 300 ml. Para la realizacin de geles se roci con etanol el equipo para hacer
geles y todos los componentes; ya seco se arm la cmara de ctodo de electroforesis;
se coloca la base de acrlico y se ajusta ligeramente con las mariposas de la cmara,
las peinetas (9 dientes), del lado contrario con los cuales se harn pozos, el ojo de buey
es una parte del equipo que se equilibra y se coloca en medio de la cmara; ya armado
se disolvi los 30 ml de TAE y 0.3 gr de agarosa ya medidos, y para quitar los grumos
se calent a 45C tres veces por un 1 minuto, una vez ya disuelta la agarosa se levanta
el ojo de buey y se vierte la disolucin en el centro, lentamente sin formar burbujas.
Cuando haya quedado opaco el gel, quitar de la base y colocarlo en el electrodo. Para
los geles se llen los lados con el TAE que todo quede sumergido, se sac el peine
suavemente moviendo de lado a lado, en una parte del parafin colocar un colorante
promega, se coloca 3 l por cada muestra. Se pipeteo 7 l de muestra de ADN y 3 l
de colorante y mezclar subiendo y bajando. Colocar en la escalera con cuidado y
conectar la fuente de poder, se ajust los voltajes 85V y oprimir el botn de inicio. Al
termino la lectura de la electroforesis en un tiempo de 35 min, se le apret STOP y se
desconect todo el equipo y se procedi a teir el gel con bromuro de etidio en la
maquina mecedora agregando una pisca y dejar por 15 min. Se prendi la foto
documentador UV, rociar con alcohol y limpiar la lmpara de UV, de ltimo se sac el
gel del amortiguador y se coloc en la cmara UV para su siguiente lectura.

~ 36 ~

5.6 ESPECTROFOTOMETRIA
En el anlisis espectrofotomtrico se hizo una serie de disoluciones de dos tipos en una
con agua y otros con TAE. El cual se tena que hacer una disolucin de 1 ml de
plsmido en 1000 ml de agua, nuestro equipo preparo su disolucin en el que se us
991 l de agua molecular en un tubo eppendorf y 9 l de plsmido porque es de
disolucin menor donde enseguida se tap el tubo y se invirti 20 veces
aproximadamente. Para su respectiva lectura de absorbancia, nos percatamos que las
cubetas estn lavadas, realizar los ajustes a la maquina e introducirse; para la
absorbancia se ajust la longitud de onda a 260 nm y oprimir la tecla ENTER de lector,
se procede al pipeteo del blanco suavemente y constante, despus pipetear agua
destilada mismo blanco para las mediciones

~ 37 ~

CAPTITULO 6. RESULTADOS Y DISCUSION


6.1 RESULTADOS
6.1.1 Resiembra de Bacterias Recombinantes en medio LB.
Luego de nuestro resembrado de las bacterias recombinantes en la caja de Petri,
observamos que el crecimiento de las colonias en el medio LB de esta forma se obtuvo
satisfactoriamente lo esperado.

~ 38 ~

6.1.2

Cultivo Masivo en

medio LB

Lquido

Despus

del

espera en

el

nuestro

tubo con el medio

liquido ya

sembrado

tiempo
que

de

metimos

fermentador

al
para

que

incubaran a 37 C,

al sacarlo

observamos

con

xito

crecimiento

de

el

cultivo
era

bacteriano
el

esperado.

Fig. 10. Resiembra de Bacterias Recombinantes en medio LB.


Observacin del crecimiento de colonias de las bacterias
recombinantes en el medio.

Fig. 9. Tubo con Cultivo Masivo Lquido.


Observacin del crecimiento de bacterias que se tuvo
en el medio lquido, despus de la incubadora.

~ 39 ~

como

6.1.3 Extraccin de Plsmido por Miniprep.

El procedimiento para la extraccin del plsmido que utilizamos es el mtodo de silica,


al termin de todo el procedimiento conseguimos extraer una cierta cantidad plsmido
en un tubo eppendorf.

Fig. 10. Tubo Eppendorf con Plsmido. Muestra obtenida de


plsmido por el mtodo de solucin de silica.

~ 40 ~

6.1.4 Electroforesis
El resultado obtenido a travs de la electroforesis no fue algo tan satisfactorio como lo
que estuvimos esperando, a comparacin de los dems equipos que si les resulto una
muy buena observacin por parte de ellos, nosotros pudimos observar algunos
fragmentos del ADN Plasmdico aunque no fue tanto como el de los otros equipos.

Fig. 11. Gel de Agarosa por Electroforesis. Observacin del gel de


agarosa despus de la electroforesis, por medio del
fotodocumentador visualizamos a travs de rayos UV el
fraccionamiento del ADN Plasmdico despus de la electroforesis.

~ 41 ~

6.1.5 Espectrofotometra
Para obtener un resultado la detallado de la obtencin del plsmido, realizamos la
verificacin por medio del espectrofotmetro, el cual lee a una cierta longitud de onda
de 260 nm es la lectura de lo plsmidos. Entonces nuestro resultado al pasarlo por la
espectrofotometra fueron las siguientes figuras.
Obtuvimos 2 resultados porque el primero no se obtuvo una lectura esperada que fue
de 0.002A, mientras que al repetir la lectura se tuvo una lectura aceptable de 0.085A
aunque la fig. 13; B, se muestre 0.088A por se estaba balanceando.

Fig. 12; A. Primera Lectura por Espectrofotmetro. Obtencin de una lectura muy baja,
definiendo que no haba suficiente plsmido.
Fig. 13; B. Segunda Lectura por Espectrofotmetro. Obtencin de una Lectura ms
aceptable a la anterior demostrando que cierta cantidad de plsmidos.

~ 42 ~

CONCENTRACIN DE ADN (g/l)

(0.085A) x

(1009 l disolucion)
50 g de ADN /ml
x
=238.23 g /ml
(18 l plasmido)
1 unidad de DO (260 nm)

DO= Densidad ptica

~ 43 ~

6.2 DISCUSION

~ 44 ~

CAPITULO 7. CONCLUSIONES
Con respecto a nuestro miniprep por causas de un mal manejo de las instrucciones no
lo realizamos adecuadamente, esto tuvo una repercusin al momento de ver las bandas
en la electroforesis, ya que aunque notamos ligeramente unas bandas, no fue la que
nosotros esperbamos, con ello al realizar la electroforesis nos dio como resultado que
nuestra cantidad de plsmido era muy inferior ya que tuvimos que diluir ms cantidad
de plsmido para que las lecturas estuvieran satisfactorias, por lo que podemos concluir
que en nuestro tubo eppendorf el concentrado de plsmido fue menor, adems
comparndolo con el otro equipo que realizo la misma tcnica que nosotros hubo solo
una ligera diferencia, por lo que el miniprep con solucin de slica no nos dio un
resultado satisfactorio, por lo que recomendamos el uso de otra tcnica ms sencilla
como lo fue con isopropanol ya que en ese si se tuvo una cantidad mucho mayor de
ADN plasmdico.

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CAPITULO 8. BIBLIOGRAFIA
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