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El ecosistema ruminal, mtodos

de estudio y aplicaciones
Nestor E. Obispo. Ph.D.
E-mail: nobispo@gmail.com

Por qu nos interesa el rumen?


Generar conocimientos sobre el ecosistema
Manipulacin del ecosistema ruiminal
Mejorar la productividad
Disminuir el impacto ambiental

Dificultades
Falta de conocimientos sobre la diversidad de las
poblaciones microbianas del rumen.
y de los mtodos adecuados a travs de los cuales se
puedan evaluar los cambios microbianos.

Evolucin de los vertebrados

Falla en el desarrollo de las enzimas

para hidrolizar los enlaces -1,4 de los


carbohidratos estructurales que
forman la fibra vegetal.

Desarrollo de relaciones simbiticas

entre el animal y los microorganismos


anaerobios (bacterias, protozoarios y
hongos) del rumen.

Fermentadores
Postgstricos

Ciego
chigire
conejo
tapir

Pregstricos

Rumen
bovino
ovino
caprino
crvidos
camlidos
jirfidos

Colon
caballo
rinoceronte
elefante

Fermentadores Pregstricos
Los animales con fermentacin pregstrica
derivan ventajas de la relacin simbitica:
Celulosa y otros polisacridos son hidrolizados
a compuestos de menor tamao que son
importantes fuentes de energa para el
hospedero;
Reducen moderadamente el volumen de la MS
que ha de pasar al tracto posterior;
Sintetizan vitaminas (excepto A y D);
Los cuerpos de los microbios son fuentes de
protena para el hospedero.
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El ms grande espacio de fermentacin


animal en el mundo

Aproximadamente 1,3 billones de cabezas


bovinas
Bacterias 1010 a 1012 cells/mL
Volumen del Rumen desde menos de 1L
en el Blue Duiker a 200L en una vaca

Reduccon del tamao de particula

El msticado al comer (mnima)


Preparacin para el tragado;
Liberacin de los constituyentes solubles;
Las particulas vegetales que se han daado durante
la masticacin, son areas para la adhesin
microbiana.
La msticado durante la rumia (extensiva)
Disminucin del tamao de la particula para el
pasaje por el orificio reticulo-omasal;
Ms dao de la particula vegetal para la adherencia
de los microorganismos.
Digestin microbiana (Fermentacin);
Contracciones ruminales.
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El ambiente ruminal

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El ambiente ruminal

Condicin ambiental casi constante dentro de


ciertos limites, e ideal para el desarrollo de
microorganismos anaerobios.
Capacidad:
3 - 15L oveja
35 - 200L vaca

Temperatura: 38 - 40 C
Los protozoarios no sobreviven a
temperaturas superiores a los 40 C por
perodos prolongados.
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El ambiente ruminal

pH: 5,5 - 7 (en las llamadas dietas normales)

Limites extremos: 4,5 - 7,5;


Los protozoarios son ms sensibles que las bacterias celulolticas,
desaparecen si sube a 7,8, o baja alrededor de 5;

Bacterias celulolticas descienden en nmero a 6,5 y son eliminadas


a 5,9;

Es el factor ms variable;
Depende de la naturaleza de la dieta, frecuencia de alimentacin;
Es un reflejo de la cantidad de cido producido por la accin

microbiana sobre los sustratos, y es mediado por la absorcin y la


capacidad tampn de la saliva.
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El ambiente ruminal

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El ambiente ruminal

Presin osmtica:
El licor ruminal es hipotnico con respecto al plasma
Licor ruminal: 250 mOsm Kg-1
Plasma: 300 mOsm Kg-1

Materia seca:
10 - 13%

Tensin superficial:
45 - 59 dinas cm-1

Gases: CO2 (65%), CH4 (27%), H2 (0,2%), H2S (trazas), CO


(trazas) N2 (7%), O2 (pequeas cantidades transitorias).
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El ambiente ruminal

Potencial redox (Eh): -150 a -350 mV (Clark, 1977)

Muchas sustancias reductoras estn asociadas a las

partculas y al material en estado coloidal y no a las


bacterias;

Los anaerobios facultativos remueven el oxigeno o lo


reducen;

Los forrajes tienen Eh ms bajo que los concentrados.


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Microorganismos del rumen

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Alimente los microbios y deje que ellos alimenten a la vaca


Alimento
Ingerido

AGV
Protena Microbiana
Vitaminas

Los nutrientes del alimento


ingerido, una vez fermentados,
resultan en compuestos diferentes

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Protozoarios
Observados por Gruby y Delafond (1843).
Clasificacin:

Basada mayormente en caractersticas morfolgicas;


Tamao poblacin: 106 organismos mL-1;
Mayormente ciliados (algunos flagelados);
Varan en tamao (15 - 20 m ancho por 10 - 200 m
largo).

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Protozoarios

Fermentan constituyentes de las plantas, Isotrichidos:


carbohidratos solubles, Entodiniomrfos, solubles y celulosa;

Se reproducen por fisin binaria, pero actividades de


conjugacin se dan en el genero Dasytricha (Warner,
1966);

Exposicin con un adulto faunado, permite el pase


de un animal a otro por la saliva. Tambin se sugiere
la va aerosol;

Son depredadores;
Dificultades para cultivarlos in vitro en medios
purificados (bacterias en los cultivos).
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Los hongos anarobios


Warner (1966) observ que el protozoario flagelado
Callimastix frontalis incrementaba en nmero
dramticamente despus la alimentacin del animal y
luego disminua 10h despus;
Orpin (1974) investig estas variaciones en el
organismo, observando que estaba asociado a las
grandes partculas del alimento y sugiri que era all
donde se secuestraba el flagelado;
Orpin (1975) logr el aislamiento, del N. frontalis,
revelando su ciclo de vida y luego identificndolo como
un hongo anaerobio.
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Los hongos anarobios

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Los hongos anarobios

Nmero 102 -106 UFC


Fermentan los sustratos ms recalcitrantes
Generos
Neocallimastix
Caecomyces (anteriomente Sphaeromonas)
Piromyces (anteriormente Piromonas)
Orpinomyces
Ruminomyces
Anaeromyces
Cyllamyces
(Chen et al., 2007)

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Bacterias

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Bacterias

The rumen and Its Microbes (Hungate, 1966)

Pocos progresos:
Primeros experimentos, von
Tappeiner (1984 1940);
Baker y Harris (1947) observan
cocos que degradan la celulosa en
el rumen;

Rpidos avances:
Hungate y sus alumnos, desarrollan
y modifican tcnicas anaerbicas y
determinan las bacterias anaerbicas
que ms ocurren en el rumen
Hungate (1947) aisla en cultivos
(Hungate 1950, Bryant y Burkey
puros varias bacterias celulolticas
1953).
aisladas del rumen bovino;
Sijpestein (1948, 1951) Holanda,
crecimiento de bacterias
celulolticas y eventualmente
aislamientos de cepas puras;
Marston (1948) Inglaterra,
estudios in vitro con cultivos
mixtos de bacterias ruminales.

El futuro es ms promisorio
Las tcnicas moleculares abren
nuevos
caminos
para
la
investigacin del rumen.
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Ecuacin de Nermst
Hungate (1969) calcul la concentracin de O2 necesaria
para desarrollar en un medio de cultivo un Eh de -0,33V
(crecimiento de metanognicos), a este potencial el
medio contiene 1,48 x 10-56 moleculas de O2 L-1

Dificultad de obtener bajos Eh;


La cantidad de O2 permisible disuelto en solucin en el
medio de cultivo, llega a ser una funcin estadstica de
un nmero finito de molculas;
Es muy cuesta arriba la obtencin de un bajo Eh
simplemente por la remocin del O2;

Para obtener el Eh ms bajo, hay que aadir un sistema


reductor con un potencial ms bajo.

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Desarrollar medios de cultivo con las caractersticas


del ambiente ruminal

Condicin anaerbica;
Potencial Eh;
Osmolaridad;
Factores de crecimiento microbiano;
pH;
entre otros.

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Trampa para Oxigeno

Gas libre de O2

Tapn de silicn

Cu 2 O

2Cu + O2

(+1)

300C

Cable (Cromel 21) Conectado a la


corriente elctrica de 110V (genera
calor en la columna para acelerar
reaccin oxido-reduccin del cobre

Cu + H2 O

Cu 2 O + H2
300C

Tapn de silicn

Gas con O2

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Preparacin de animales fistulados al rumen

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Cmo saber si una bacteria es del rumen?


Dr. Bryant (1959)

El organismo puede vivir en el ambiente;


El nmero de una especie dada que ocurre en el rumen,
es considerablemente superior a su nmero en el
alimento o en el agua;
Utiliza los sustratos presentes en el rumen o en el
alimento (celulosa, hemicelulosa, pectina, almidn, entre
otros);
Los productos finales de la fermentacin son compatibles
con los presentes o fcilmente metabolizados en el
rumen;
Las condiciones para su cultivo, pH, Eh, temperatura y
requerimientos nutricionales similares con las halladas en
el rumen;
Repetidos aislamientos de una especie particular sobre un
perodo de tiempo, en diferentes huspedes, en varios
lugares, son buenas evidencias.
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Poblacin 1011 cel mL-1 de contenido ruminal


Celulolticos

Hemicelulolticas

Ruminococcus flavefaciens
Ruminococcus albus
Fibrobacter succinogenes
(Bacteroides succinogenes)
Eubacterium
cellulosolvens
Butyrivibrio fibrosolvens
Pectinolticas

Butyrivibrio fibrosolvens
Prevotella ruminicola
Fibrobacter succinogenes
Ruminococcus flavefaciens c-94
Rumincoccus albus 7
Amilolticas

Streptococcus bovis
Butyrivibrio fibrosolvens
Ruminobacter amylophilus
Prevotella ruminicola
Succinimonas amylolytica
Lachnospira multiparus
Selenomonas ruminantium
Succinivibrio dextrinosolvens Succinivibrio dextrinosolvens
Fibrobacter succinogenes
Eubacterium ruminantium
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Bacterias utilizadoras de otros substratos:


Lactato: Veillonela alcalescens, Megaesphaera elsdenii.

Bacterias metanognicas (arquoebacterias):


Methanobrevibacter ruminantium, Methanomicrobium mobile,
Metanosarcina barkeri y Methanobacterium formicicum.

Productores de cido lctico:


Lactobacillus lactis, L. vitulinus y L. ruminis.

Bacterias proteolticas:
Ruminobacter amylophilus, Prevotella ruminicola,
Selenomonas ruminantium, Butyrivibrio fibrosolvens,
Butyrivibrio akacticidigens.
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Mtodos de cultivo

in vitro: fermentacin con contenido ruminal


completo:
Esttico o sistema cerrado;
Sistemas continuos se intenta mantener
condiciones estables (RUSITEC).
Cultivos puros: Envuelve el aislamiento de una cepa
de bacteria y su subsecuente caracterizacin (slo
da informacin de un organismo).
Cultivos mixtos: (Da informacin sobre actividades
competitivas, sinergisticas, entre otras).
in vivo in vitro: La llamada tcnica vivar (Fina
et al., 1958; 1962);
in situ: tcnica de la bolsa de nylon (Hopson et al.,
1963; Johnson, 1966).

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Cultivos puros:
Descripcin de las especies aisladas: celulolticas, amilolticas,
proteolticas y otras;
Uso de gases (CO2, N2) libres de O2;
Los contenedores de los cultivos son sellados con tapones de
caucho;
El medio de cultivo que intente reproducir el del ambiente
ruminal, contiene: 40% de licor ruminal, minerales, resazurina
(indicador), cistena (agente reductor), bajo presin de CO2, libre
de O2, sustratos.

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Fermentacin in vitro:
Celulolticos requieren poca cantidad de protenas o amninocidos,
usan amonio o urea.
Factores de crecimiento de los celulolticos entre otros, el Ac.
Valerico, PABA, Isobutirico, Isovalerico.
Estado de madurez y liginificacin del forraje afecta la actividad
degradativa, incluyendo las diferencias entre la pared celular de
leguminosas y gramneas.

Soluciones anaerobias para las diluciones;


Los tubos rodados de Hungate;
Caldos de cultivo anaerobios;
Mtodos de conteo basados en la probabilidad
estadstica (NMP).
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Contribucin de las tcnicas in vitro:

Estudios sobre la biohidrogenacin de los cidos


grasos (Wilde y Dawson, 1966);
Metabolismo del cido ctrico (Wright, 1971);
Hidrlisis del Biuret (Bauriedel, 1971; Bauriedel
et al., 1971);
Degradacin y efectos del oxalato (James et al.,
1967);
Efectos de la cristalinidad de la celulosa sobre su
digestibilidad (Baker et al., 1959);
Fijacin de N en el rumen (Jones y Tomas, 1974);
Efectos de las grasas en la degradacin de la fibra
(Jenkins y Palmquist, 1982);
Degradacin de varios compuestos de lignina
(Chen et al., 1985).

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Determinacin del valor nutritivo del alimento

El valor nutritivo de los alimentos de los rumiantes es determinado,

principalemente por su digestibilidad;


Las tcnicas de digestibilidad in vivo, no son adecuadas para estas
determinaciones a nivel de un laboratorio;
Las tcnicas in vitro permiten simular la actividad fermentativa en el
rumen.
Tiley y Terry (1963)
Produccin de Gas in vitro
Rusitec
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Tcnicas de produccin de gas


Permite determinar la extensin y la cintica de
degradacin del alimento a travs del volumen de
gas producido durante el proceso fermentativo
(Theodorou et al 1994).

Sistemas continuos de cultivo:


RUSITEC

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Qu balance tenemos del aporte de la microbiologa


anaerobia en el estudio del ecosistema ruminal?

El actual estado de arte de la alimentacin y nutricin de


los rumiantes se soporta en casi su totalidad en los estudios
del ecosistema ruminal, un ejemplo son las manipulaciones
alimenticias del animal;

Basado en las dificultades para aislar y cultivar los


organismos presentes en el rumen, quedan muchas
interrogantes sobre si se han aislado todas las que son o no;

Las metodologas emergentes abren nuevas posibilidades


para aclarar muchas interrogantes.
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Reacciones tpicas que generan metano


4 H2 + CO2 CH4 + 2 H2O
4 formato CH4 + 3 CO2 + 2 H2O
4 2-propanol + CO2 CH4 + 4 acetona + 2 H2O
2 etanol + CO2 CH4 + 2 acetato
Metanol + H2 CH4 + H2O
4metanol 3 CH4 + CO2 + 2 H2O
acetato CH4 + CO2

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El futuro de la microbiologa del rumen

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Uso de la biologa molecular en la identificacin


de los protozoarios del rumen

Regensbogenova et al, 2004 (Acta Protozool, 43: 219 - 224)

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APPLICATION OF MOLECULAR TECHNIQUES TO ASSESS CHANGES IN


RUMINAL MICROBIAL POPULATIONS AND PROTOZOAL GENERATION
TIME IN COWS AND CONTINUOUS CULTURE

Sanjay Kumar R Karnati,


Tesis de Doctorado O SU
2006.

Manipulacin del rumen

Los protozoarios son depredadores de


microorganismos;

Contribuyen poco a la economa del husped;


Su eliminacin incrementa la produccin de
PM y mejora perfiles fermentativos.

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Una vaca produce al ao


entre 45-100 kg de gas
metano

Alternativas ????

Rebao Nacional
Cambios en la alimentacin
Vacunas anti-metanognicos
Eliminacin de protozoarios
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Aceites de maz y de coco como desfaunantes en el


rumen de ovinos mantenidos en aislamiento

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Totales: 2,7x
Celulolticas: 1,14x

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GRACIAS