DNA humano mtodos de extrao : Patentes e Aplicao

Uma vez que os experimentos pioneiros realizados por Friedrich Miescher,

em l861, avanos extraordinrios foram alcanados no campo da
manipulao de DNA. Hoje cidos nucleicos podem ser extrados a partir de
qualquer tipo de material biolgico tais como tecidos, clulas e vrus. Alm
disso, o aumento do conhecimento do genoma humano est pavimentando
o caminho para um emprego eficaz da farmacogenmica e testes preditivos
genticos baseados na medicina. Neste contexto, a recuperao de ADN a
partir de diferentes fontes de amostras biolgicas (por exemplo, tecidos de
autpsia arquivados fixados em formalina, manchas de sangue seco, o soro
ou plasma congelado, armazenado a longo prazo de sangue total) tambm
uma rea emergente em estudos de epidemiologia gentica. Assim, tendo
em conta o papel crucial desempenhado pelo DNA na investigao
biomdica e em suas aplicaes relacionadas, aqui vamos rever as
principais patentes emitidas relevantes e avanos recentemente publicados
na rea de extrao de DNA a partir de amostras e purificao humanos.
INTRODUO
Em 1869, o mdico suo Friedrich Miescher realizada a primeira extrao
de DNA durante um experimento para identificar os compostos qumicos
fundamentais celulares usando linfcitos coletados a partir do pus dos
curativos cirrgicos. Os estudos iniciais de Miescher demonstrado que as
protenas so o principal composto citoplasmtica. Durante a purificao de
protenas que tambm encontrada uma substncia desconhecida precipitar
quando o cido foi adicionado e, em seguida, novamente suspensas por
meio de um tratamento alcalino. Este material foi chamado de cido
nucleico a partir de Richard Altman, um estudante Miescher [1]: era o ADN.
Aps esta primeira precipitao do DNA em bruto, ele desenvolveu alguns
protocolos para se obter maiores quantidades deste material biolgico.
Depois de Miescher, foram desenvolvidas vrias tecnologias de purificao
com base na qumica do DNA e propriedades fsicas. Primeira rotina de
extraco de ADN foi realizada em 1958, por Stahl e Meselson, usando a
centrifugao de gradiente de densidade, para demonstrar a replicao
semi-conservadora de ADN.
Hoje em dia, o ADN pode ser isolado a partir de qualquer fonte de material
biolgico tais como tecidos, clulas e vrus. tambm de salientar que o
conhecimento cada vez mais do genoma humano est pavimentando o
caminho para um emprego eficaz de farmacogenmica [3] e testes
preditivos genticos baseados na medicina [4]. Portanto, a coleta e a
extrao de DNA a partir de amostras humanas esto se tornando dois
passos cruciais realizados em investigao biomdica. A este respeito, a
recuperao e amplificao de cidos nucleicos a partir de diferentes fontes
de amostras biolgicas (por exemplo, arquivado tecidos de autpsia fixados
em formalina, manchas de sangue seco, o soro ou plasma congelado, a
longo prazo armazenados (LTS) sangue completo) so campos que crescem
em retrospectiva estudos genticos.

Os mtodos para o isolamento de cidos nucleicos normalmente comear

por adio da amostra a uma / soluo de lise contendo detergente
caotrpico. Alternativamente, as clulas podem ser primeiro concentradas
por centrifugao e, em seguida, suspenso numa soluo. As solues de
suspenso tpicos so hipotnico, tal como a utilizada num passo de prtratamento de lise de glbulos vermelhos [7] ou solues isotnicas, soluo
salina tamponada como fosfato de [8], de glicose [9] ou o sorbitol [10]. O
reagente de lise geralmente contm um detergente para dissolver
membranas celulares e para solubilizar as protenas e lpidos, tais como os
detergentes aninicos dodecilsulfato de sdio (SDS) e N-lauroil sarcosina
[11,12]. Para este efeito, no inico [13] e os detergentes catinicos [14]
tambm foram relatadas. Aps a lise, o ADN purificado por separao a
partir do lisado de complexo, que no contm ADN material celular tal como
ARN, lpidos e protenas. Purificao de ADN pode ser realizada utilizando
protocolos baseados em coluna ou base de soluo.
Dada a crescente importncia do DNA na investigao biomdica e em seus
aplicativos relacionados, aqui vamos rever as principais patentes emitidas
relevantes e avanos recentemente publicados na rea da extraco de
ADN e purificao de amostras humanas.
COLHEITA
O primeiro passo crucial na realizao de extrao de DNA a recolha e
armazenagem de amostra. Sangue total perifrico (o principal recurso
utilizado para obter o ADN para estudos genticos humanos) pode ser
obtido usando tubos Vacutainer com EDTA ou tratados citrato de sdio para
impedir a coagulao. A heparina no recomendado porque pode inibir
Polymerase Chain Reaction (PCR) ou Restriction Fragment Length
Polymorphism anlise (RFLP). Antes da extraco de DNA, as amostras de
sangue total pode ser conservada por um mximo de trs dias a + 4 C, ou
vrios anos congelado (-20 C ou -80 C). O tempo de armazenamento e
modo de conservao afecta a razo de recuperao do DNA. Alguns
protocolos exigem a eliminao dos glbulos vermelhos do sangue (RBC)
com um tampo de lise especfica para a separao de glbulos vermelhos
por gradiente de Ficoll para melhorar a recolha linfcitos.
Vrios grupos de pesquisa tm conseguido usando pequenas quantidades
de amostras de sangue total no purificados como substrato para a PCR. A
amplificao de DNA a partir de 1 ul a 2 ul de sangue total em reaces de
100 ul foi obtida depois de um pr-tratamento trmico cclico em + 95 C e
+ 55 C [15]. Alm disso, observou-se que Tth (T. thermophilus), mas no a
polimerase Taq de ADN amplificado a partir de pequenas amostras de
sangue no tratado e no purificada.
As amostras biolgicas tambm podem ser coletados e armazenados
usando papel FTA. FTA uma sigla para Technology Fast para Anlise de
cidos nucleicos. uma especialidade de papel tratada quimicamente para
a preservao de cidos nucleicos. Quando as amostras biolgicas tais
como sangue e saliva so manchadas sobre papel de TLC, o tratamento
qumico do papel [um radical monovalente de base fraca (tal como "Tris",
tris-hidroximetil metano, quer como a base livre ou como o carbonato); um

agente quelante (tal como EDTA, cido etileno diamino tetra actico); um
detergente aninico (tal como SDS, de sdio Sulfato de dodecilo) e,
opcionalmente, cido rico ou de um seu sal de urato] lisa as clulas e
desnatura as protenas. Danos de cido nucleico a partir de nucleases, a
oxidao, a luz ultravioleta (UV) dano, micrbios, e o fungo reduzida
quando as amostras so secas e devidamente armazenada no carto FTA.
Digno de nota, as amostras biolgicas armazenados desta forma so
extremamente estveis temperatura ambiente.
A maioria das amostras de tecido clnicos so rotineiramente fixados em
formalina e embebidos em cera de parafina. Este processo essencial para
fins de arquivamento e para manter a excelente morfologia celular. Para que
dizem respeito fixao dos tecidos pela formalina, bem sabido que a
desnaturao e a modificao de macromolculas por formalina (por
exemplo, alquilao e reticulao de grupos funcionais), leva a sua
insolubilizao, minimizando assim a perda de cidos nucleicos a partir de
tecidos fixados . Por outro lado, a solubilizao de ADN a partir de amostras
fixadas com formalina est negativamente correlacionada com a durao do
tratamento com formalina e o rendimento de extraco de ADN podem ser
seriamente reduzida quando comparado com uma amostra no fixadas [1721]. Os tecidos tambm ir permanecer indefinidamente estvel para a
extraco de cidos nucleicos e protenas, se mantida a -70 / -80 .
Dada a crescente nfase sobre o papel da gentica no desenvolvimento do
cncer e preveno, os mtodos simples e de baixo custo so necessrios
para obteno de DNA para estudos de larga escala. Embora a fonte de DNA
para estudos epidemiolgicos vem frequentemente a partir de coleces de
sangue, este mtodo muito invasivo para alguns participantes e caro
para estudos de grande escala. Por isso, vrios meios de coletar clulas
bucais tornaram-se uma abordagem atraente para a obteno de DNA. Os
mtodos de recolha de clulas bucais so de dois tipos: procedimentos seca
que usam um cytobrush ou outros implementos para raspagem da mucosa
oral e procedimentos molhadas que envolvem lquidos balanando na boca
e cuspir em um recipiente de recolha. H vantagens e desvantagens
associadas a cada tipo de coleo. As vantagens do mtodo abanada
parecem ser maiores rendimentos de DNA mdia, fragmentos de ADN mais
longos, e, possivelmente, percentagens mais elevadas de ADN humano [22,
23]. No entanto, o mtodo abanada exige manuseio e centrifugao passos
lquido durante o processamento da amostra, que resultam em aumento de
custos para materiais, e-mails e processamento de amostras antes de
congelar. As vantagens da coleta de rosto seco, tal como o mtodo
cytobrush, so montagem simples para correspondncia de grande escala,
porte leve, e um processamento eficiente e de baixo custo para
arquivamento de longo prazo.
Mtodos de extrao de DNA
3.1. SDS-proteinase K proteinase K uma serina protease de largo espectro
utilizada para digerir protenas e remover a contaminao a partir de
preparaes de cido nucleico. A adio de proteinase K para preparaes
de cidos nucleicos rapidamente activa nucleases. Este proteinase estvel
ao longo de um ampla faixa de pH (4-12) e ativa em presena de agente

de desnaturao de protenas, tais como SDS, uria e EDTA [24,25]. A

principal funo da SDS dissolver a bicamada lipdica e tambm actua
como agente de desnaturao da protena. Protena se desenrola aumenta a
acessibilidade para a protease resultando num aumento da actividade de
proteinase K [25]. Aps a incubao com proteinase K, uma fenolclorofrmio ou uma extraco de salificao realizada.
Fenol-clorofrmio extrao mtodo fenol-clorofrmio o mtodo de
isolamento de DNA mais utilizada e reconhecida como o padro-ouro para
avaliar outros mtodos de extrao. O fenol um cido carblico corrosivos,
inflamveis e txicos que podem desnaturar protenas rapidamente. Uma
mistura de (25: 25: 1) de fenol, clorofrmio e lcool isoamlico (PCIA)
utilizado para atingir um inativao completa RNAse [26]. Emulso bifsico
formado quando estes solventes orgnicos so misturados com a amostra.
Aps centrifugao desta emulso dividido em duas fases: a fase superior
contm ADN diludo em gua, enquanto a fase inferior composta por
solventes orgnicos e compostos hidrfobos celulares. Ps-tratamento com
clorofrmio necessrio remover todos os vestgios de fenol a partir da fase
aquosa. Em seguida, o DNA pode ser precipitado por adio de uma soluo
de acetato de sdio (pH 5,2) para alcanar uma concentrao final de 0,3 M
e etanol (a -20 C) ou isopropanol (temperatura ambiente) em 2: 1 ou 1: 1
rcios. Quando as amostras so tratadas com etanol frio, tm que ser
incubados a -20 C durante uma hora, enquanto que na precipitao com
isopropanol, a amostra deve ser incubada a temperatura ambiente apenas
de alguns minutos. Depois disso, o ADN pode ser recolhido por
centrifugao e lavado com etanol frio a 70% para eliminar o excesso de
sal. Finalmente, o ADN pode ser ressuspenso em gua destilada esterilizada
ou de tampo TE (Tris 10 mM; EDTA 1 mM, pH 8,0) [26]. Recentemente, um
protocolo phenolchloroform revisited para extraco de ADN a partir de
sangue completo muito tempo armazenado tambm tem sido relatada [27].
Os problemas associados ao contacto fsico do operador com os solventes
poderia ser evitado atravs da adio de um gel de polmero, tal como um
polmero de slica gel mistura da amostra [28]. Um mtodo para o
isolamento de ADN que utiliza compostos menos nocivos, tais
Salga Fora Mtodo
Este um protocolo de baixo custo muito adequado para purificao de
DNA aps a digesto de Proteinase K-SDS. Solubilidade da protena depende
de vrios factores incluindo pH, temperatura e fora inica da soluo.
Neste mtodo de extraco de ADN conseguido por precipitao da
protena a uma concentrao elevada de sal. Baixa concentrao de sal
aumenta a solubilidade da protena (salga in) enquanto a alta solubilidade
da protena sal concentrao diminuir rapidamente levando precipitao
de protenas (salga). Depois de completa a digesto com proteinase K,
salificao realizada por adio de NaCl saturado (aproximadamente 6M)
para dentro do tubo e a amostra agitada vigorosamente durante 15
segundos, seguido de centrifugao a 3000 xg durante 15 minutos. O
sedimento de protena precipitada deixado na parte inferior do tubo e o
sobrenadante contendo o ADN transferido para um outro tubo e o ADN
recuperado por precipitao com etanol ou isopropanol, tal como descrito

antes. Este mtodo apresenta uma boa relao 260/280 exibindo boa
Desproteinizao
Mtodo para extrair ADN de secado Amostras Este mtodo de alto
rendimento rpida [31] fornecida para libertar DNA de amostras biolgicas
secas em substrato slido, em especial quando so adsorvidos sobre um
material celulsico, tais como papis de base de algodo (por exemplo,
Schleicher & Schuell 903 ( S & S 903), cartes Fitzco FTA e esfregao
bucal). O protocolo pode ser realizada num nico tubo, o que simplifica
muito o processo de extraco de ADN de amostras biolgicas,
especialmente sangue total, secou-se sobre papis base de algodo. Este
mtodo compreende quatro etapas: o contacto de uma amostra biolgica
com a soluo de extraco de ADN; incubao da mistura a uma
temperatura baixa; incubao da mistura a temperatura elevada, e isolar o
sobrenadante que contm ADN extrado. Um disco de material celulsico
que contm a amostra biolgica adicionado a um tubo ou um bem, tal
como um poo de microtitulao. Qualquer superfcie de substrato pode ser
mergulhado na soluo de extraco de ADN adicionado ao tubo ou poo
contendo o disco (s) numa quantidade de cerca de 50 ul. A soluo de
extraco de disco e ADN so primeiro incubadas temperatura ambiente
(+ 25 C) e em seguida a + 95 C. O sobrenadante isolado por
centrifugao, tal como 3000? g durante 10 minutos, e, em seguida,
utilizada para anlise molecular. Tambm tem sido relatado que o
sobrenadante pode ser utilizado como molde para reaces de amplificao
de sequncia de uma diluio de 8 vezes, com um volume de reaco final
de 10% a 20%.
Cromatografia protocolo baseado
Frequentemente protocolos tradicionais so muito demorados e requerem a
utilizao de solventes perigosos, como fenol ou clorofrmio. Estes
problemas levaram ao desenvolvimento de kits comerciais rpidas com
base em propriedades cromatogrficas DNA. H quatro formas de
purificao com base nas propriedades cromatogrficas de ADN:
Cromatografia por excluso de tamanho (SEC), cromatografia de permuta
inica (IEC), cromatografia de afinidade (AC) e mini-coluna de centrifugao
(MSC) [32,33]. Tamanho ADN recuperado e rendimento so influenciadas
pelo mtodo de cromatografia utilizada para a purificao genmica.
Cromatografia de Excluso de Tamanho (SEC), tambm conhecido como gel
de filtrao ou cromatografia de permeao em gel um mtodo de
resoluo cromatogrfica baixo onde as molculas em soluo so
separados de acordo com o seu volume hidrodinmico. Geralmente, esta
tcnica aplicada a grandes molculas ou complexos macromoleculares,
tais como protenas e cidos nucleicos.
Quando a amostra transportada por gua atravs da coluna, a tcnica
conhecida como cromatografia de filtrao gel (CFG) [34,35]. Trs tipos de
matriz so vulgarmente empregues para a purificao de ADN por GFC:
poliacrilamida (Sephacryl ou Bio Gel), dextrano (Sephadex) ou agarose
(Sepharose). Tipo de matriz seleccionada de acordo com o tamanho do
ADN e a filtrao realizada a baixa presso. Kit comercial permite a

separao de contaminantes de DNA somente quando taxa de ADN /

contaminante maior do que 3: 1 [36]. Em particular, no h nenhuma
ligao de ADN para a matriz e a sua separao se baseia apenas em
tamanho. Molculas mais pequenas tendem a passar mais tempo no
labirinto de canais e poros. Consequentemente, as molculas maiores e
ponderados moleculares mais elevados (isto , ADN) so eludos a partir da
coluna antes de molculas pequenas (por exemplo, ARNm e protenas).
Sephadex G-200 em coluna de purificao resultados o rendimento mais
elevado de ADN, tambm remover mais contaminantes do que quer a
electroforese em gel ou precipitao com acetato de amnio. Sephadex G200 colunas so superiores s colunas base de slica com base em tanto
rendimento e pureza, mas requerem mais tempo de preparao e
centrifugao a baixa velocidade (130? G) para garantir o uso adequado de
Sephadex G-200 prolas.
Uma outra aplicao interessante cromatogrfica baseado na
cromatografia de permuta inica (IEC), permitindo a separao de ies e
molculas polares de acordo com a sua carga elctrica. Ele pode ser usado
para quase qualquer tipo de molcula carregada, incluindo cidos nucleicos,
protenas, oligonucletidos e cidos aminados. Purificao de ADN obtida
por meio de cromatografia de permuta aninica (isto , em DEAE celulose).
Os cidos nucleicos so retidos na fase estacionria, mas pode ser eluda
por aumento da concentrao das espcies carregadas negativos e / ou
modificao do pH deslocando o ADN a partir da fase estacionria. DNA
geralmente detectada por luz UV absoro.
Cromatografia de afinidade (AC) separa misturas bioqumicas com base em
interaces biolgicas altamente especficos, tais como ARNm e que entre o
oligo (dA) ou cDNA e oligo (dT). AC combina a capacidade de
fraccionamento por tamanho de SEC com a capacidade de conceber uma
cromatografia de ligao reversivelmente um subconjunto da molcula
conhecida.
Kits comerciais normalmente proporcionam slica-membrana para
purificao de cidos nucleicos a partir de qualquer tipo de amostra, tais
como esfregaos bucais, fluido cerebrospinal, sangue, fluidos corporais ou
clulas lavadas a partir da urina. O procedimento spin-coluna no requer
homogeneizao mecnica, de modo total de hands-on tempo de
preparao mais ou menos 40 minutos. Os tecidos ou sangue so
incubados com um tampo de lise durante alguns minutos e, em seguida os
lisados celulares brutos so carregados para uma coluna de separao por
centrifugao de ADN genmico a partir de centrifugao outras fraces de
clulas. Coluna de centrifugao de alta velocidade de execuo combina
com processo livre de solvente, o que permite um rendimento elevado e
nveis baixos de contaminantes. Purificao de DNA tambm pode ser
automatizado usando algum kit comercial.
A purificao do grnulo-Baseado Magntica
Bio-separao magntica uma tcnica emergente que mostra uma ampla
gama de possveis aplicaes em biocincia. Micro- magntico ou nanoesferas pode ser facilmente e rapidamente separados por foras magnticas

e pode ser usado em combinao com ligandos bio-afim (por exemplo,

anticorpos ou protenas com uma alta afinidade para o alvo). Os alvos
podem ser clulas, bactrias ou ADN / ARN. Partculas magnticas para
bioseparao consistir em um ou mais ncleos magnticos geralmente
[magnetite (Fe3O4) ou maghemite (gama Fe2O3)] com uma matriz de
revestimento de polmeros, slica ou hidroxiapatite com grupos terminais
funcionalizado. Saiyed et ai. [40] desenvolveram uma abordagem universal
para extrair DNA genmico utilizando nanopartculas magnticas nuas como
um meio de purificao. Em uma extraco tpica, 30 ul de 1% (w / v) de
soluo de SDS so adicionados a um volume igual de amostra (sangue
completo, a suspenso de clulas de cultura, ou homogenato de tecido). O
tubo misturada por inverso suave para duas ou trs vezes e incubaramse temperatura ambiente durante um minuto. Aps a incubao, 10 ul de
nanopartculas magnticas so adicionadas ao ligado celular, seguido de 75
ul de tampo de ligao (cloreto de sdio 1,25 M e 10% de polietileno glicol
6000). A suspenso misturada por inverso e deixou-se repousar
temperatura ambiente durante 3 minutos. O pellet magntica imobilizado
atravs da aplicao de um magneto externo, permitindo sobrenadante
descarga. O sedimento magntico lavada com etanol a 70% e secou-se. O
sedimento ento ressuspenso completamente em 50 ul de tampo TE e as
partculas magnticas ligadas ADN so eludos por incubao a + 65 C
atravs de agitao continua. Este procedimento simples, rpido e barato
de ADN produz suficiente para 30 reaces de PCR a partir de pequena
quantidade de espcimes biolgicos em menos de 15 minutos.
Baseado-dendrmero ADN Mtodo de Extraco
Dendrmeros so uma nova classe de materiais polimricos. Eles tm
gerado um grande interesse para vrias aplicaes, devido s suas
propriedades estruturais excepcionais, tais como monodispersity, alta
densidade de grupos funcionais perifricos, forma globular bem definida e
multi-valncia.? No entanto, dendrimer apenas um motivo arquitectnico
e no um composto. Dendrmeros inicos Poly no apresentam uma forma
persistente, e pode sofrer alteraes de tamanho, forma, e flexibilidade
como uma funo de aumento das geraes.? Eles so sintetizadas como
uma nica entidade molecular possuindo homogeneidade estrutural e
qumica elevada. Eles oferecem uma superfcie macromolecular
precisamente controlada, com uma base de custos muito mais baixos do
que as protenas e fornecer um andaime para a fixao de vrios elementos
funcionais em propores e posies precisas. Diversas estratgias foram
concebidas para modificar dendrmeros com molculas da droga, materiais
genticos, agentes de direccionamento, corantes e agentes de imagem,
seja por encapsulamento ou conjugao.
Fukushima et ai. [41] desenvolveram um mtodo base de dendrmero para
extrair eficientemente biopolmeros tais como o ADN, ARN e protenas a
partir de clulas. Neste mtodo, uma pluralidade de molculas de
dendrmero (por exemplo, um dendrmero de poliamida multi-ramificado)
formada sobre as paredes de um canal de fluxo em forma de U de um
biochip atravs do qual uma soluo contendo ADN alvo feito fluir.
Dendrmero produzida por fornecimento de tratamento de silano amino
sobre as superfcies de canal de fluxo e que cobre um filme de amidoamina,

o qual produzido pela reaco de acrilato de metilo com etilenodiamina,

em cima da rea tratada com amino-silano como uma unidade dendron. Em
seguida, as molculas de polmero da sonda (como um oligonucletidos)
complementares para as molculas de biopolmero-alvo esto ligados para
as pontas dos dendrmeros. Quando uma soluo contendo o DNA-alvo
vertida para o biochip estruturado como descrito acima e feita para fluir
atravs do canal de fluxo, o ADN alvo combina com o ADN sonda de uma
forma complementar. Consequentemente, o ADN alvo capturado de uma
maneira altamente eficiente. Dependendo do tipo de alvo (ADN, ARNm ou
protena), o valor da densidade ptima de molculas de ADN sonda ligada
s pontas de dendrmero, pode ser obtida por alterao da quantidade de
camada de dendrmero (geraes). Sob condio normal, dendrmeros
segundo ou superiores gerao so utilizados. Enquanto o mtodo
convencional utilizando contas magnticas requer partes mveis mecnicas,
este mtodo elimina a necessidade, o que torna possvel miniaturizar
facilmente a rea de pr-processamento onde um biopolmero-alvo ou
protena recuperada.
Matrix Mill para Extrao de DNA
A patente descrito por Weeden et ai. [42] refere-se a um dispositivo
electromagntico desenvolvida para permitir o processamento de um
grande nmero de pequenas amostras de tecidos orgnicos a serem
processados para a extraco do ADN. Amostras de tecido (10 a 100 mg)
so colocados numa pluralidade de tubos no ferrosos (96 na forma de
realizao preferida) que apresenta um pino ou "micro pilo", com pelo
menos um ncleo ferroso inseridos nos tubos. 50? L de hidrxido de sdio
0,1 M so adicionados juntamente com o pilo de moagem. Basicamente,
um campo electromagntico pulsante acciona os motores 96 "" separadas
(em uma matriz de clulas 12? 8), cada um com aproximadamente a
mesma fora, de modo que at 96 amostras podem ser processados
simultaneamente. Eletromagnetismo fornece a energia para o movimento
destes pinos e piles que aproximam o movimento aleatrio do mtodo
manual de preparao de argamassa-and-pilo normalmente usado para
extrao de DNA. A placa de poos mltiplos imprensada entre as
estruturas inferiores e superiores da bobina e do poder ligado para entre 10
segundos e 5 minutos. De notar que a contaminao da amostra evitada
por uma camada de folha de plstico na superfcie inferior do conjunto de
bobina superior. Os extractos, em pH alcalino, so neutralizados com cido
actico ou de Tris-HCl (pH 7,0) e diluiu-se para anlise de PCR. Dez
segundos de moagem verses de ADN suficientes para mais de 100 ensaios
de PCR.
O moinho de matriz reduz o tempo necessrio para separar o DNA a partir
de tecido. Isto poupa cerca de 10 horas por 100 amostras, ou seja, 10 horas
de tempo tcnico vs. cerca de 5 minutos de tempo tcnico para a extraco.
H seis usinas de matriz de existncia. Um est presente no laboratrio de
Weeden; cinco outros esto sendo testados em campo em locais que
envolvem plantar, bem como tecidos animais. Um padro custos moinho
matriz ao redor $ 5.000.
Anlise Forense e Extrao de DNA mitocondrial

As clulas podem conter centenas de milhares mitocndrias, cada um

possuindo vrias cpias do DNA mitocondrial (mtDNA). O ADN genmico
mais longo do que o mtDNA, mas mtDNA exibe um maior nmero de cpias.
Esta caracterstica faz com que o mtDNA muito til quando a quantidade de
DNA genmico muito baixo. Alm disso, um mtDNA fontes tpicas de
DNA recuperado de cenas de crimes, incluindo cabelos, ossos, dentes e
fluidos corporais como saliva, smen e sangue. Nos seres humanos, o
mtDNA estritamente herdado da me [43-45]. Assim, as seqncias de
mtDNA obtidos de indivduos maternalmente relacionados, tais como um
irmo e uma irm ou uma me e uma filha, vai corresponder exatamente
um ao outro, na ausncia de uma mutao de novo. Portanto, o mtDNA
muito til em casos de pessoas desaparecidas como amostras de mtDNA de
referncia pode ser fornecido por qualquer parente materna do indivduo em
falta [46-48]. Apesar da sua utilidade para a anlise, a extraco de mtDNA
de cabelo, ossos e dentes excepcionalmente difcil, e alguns
procedimentos foram publicados. Em protocolos tradicionais, um dente ou
um osso lavada com uma soluo aquosa de hipoclorito de sdio, gua, e,
em seguida, o etanol, para remover o contaminante ou aderentes a partir da
superfcie. Depois de serem secos e em p, a amostra descalcificados por
uma soluo aquosa contendo EDTA durante muitas horas e, em seguida,
digerido por uma soluo de enzima proteoltica. Depois disso, o ADN
extrado por PCIA e, em seguida, precipitado por etanol.
Os produtos comerciais de extraco de mtDNA so laborioso, dispendioso e
pode requerer o uso de produtos qumicos orgnicos txicos.
Um protocolo bem conhecido e amplamente utilizado para extrair o mtDNA
de cabelo tem sido adotado pela Unidade de Anlise de DNA do FBI II como
padro forense dos Estados Unidos. Este mtodo comea com moagem do
cabelo, seguido de uma incubao de 2-24 horas, com proteinase K, a
extraco do cido nucleico pela PKA, e a concentrao do ADN em um
micro-concentrador centrfugo. Tempo necessrio para concluir uma
extraco da amostra pode levar 2-3 dias [49,50]. Um procedimento
modificado de extraco de tiocianato de guanidina em combinao com
leite de vidro para extrair o mtDNA de cabelo e dentes foi publicada por
Baker et al.
Um mtodo de patente recente por Carlson et al. [52] combina o uso de um
tampo de lise com um novo protocolo de ligao de slica simplificada para
extrair ADN a partir de tecidos, cabelo, dentes, ossos, material vegetal,
matrizes slidas e outras amostras de ADN a partir da qual a extraco
geralmente considerado como sendo difcil. O protocolo permite que o ADN
a ser rapidamente extrado das amostras em apenas 5 minutos at 2 horas,
dependendo do tipo de amostra e no requerer a utilizao de digesto
enzimtica, ou produtos qumicos orgnicos txicos, tais como fenol,
clorofrmio, tiocianato de guanidina, ou 2-mercaptoetanol. Outra vantagem
a eliminao (ou a reduo drasticamente) de amostra de triturao,
antes da lise. Este mtodo tambm permite extrair DNA de sangue
manchado em papel FTA com resultados idnticos aos obtidos utilizando um
kit comercial.

Alm disso, os recentes avanos em dispositivos micro-fludicos fabricados

por sistemas mecnicos micro-eletro-tecnologia (MEMS) permitiram a
automatizao de muitos protocolos biomdicas. Tecnologia MEMS capaz
de integrar vrios dispositivos micro num nico chip com as vantagens do
sistema de miniaturizao, alta sensibilidade e anlise rpida. Chang et ai.
[53] demonstraram a eficcia de um dimensional (3-D) do sistema de microchip de trs fludico para extrair o mtDNA utilizando um protocolo de
purificao esferas magnticas. Micro-bombas, um micro-misturadores, e
um mdulo de controle de micro-temperatura esto integrados dentro de
um nico chip para executar todo o processo automaticamente. Com a
incorporao de esferas magnticas, extraco a partir de clulas de mtDNA
pode ser executado automaticamente, e uma elevada concentrao, o
mtDNA purificada obtida aps a lise das clulas, num perodo de tempo
mais curto.
Atual e desenvolvimentos futuros
Desde o primeiro isolamento de ADN foi realizado com sucesso por Friedrich
Miescher, em 1869, e a extraco de ADN inicial desenvolvida a partir de
gradiente de densidade por centrifugao estratgias Meselson e Stahl em
1958, tem sido desenvolvido muitas tcnicas para a purificao de ADN.
No incio do terceiro milnio, o DNA tem assumido um papel central na
medicina com o advento da farmacogenmica e os testes genticos
baseados
em
preditivos
para
doenas
complexas
comuns.
Consequentemente, os esforos atuais em medicina molecular e
epidemiologia gentica dependem cada vez mais disponveis coortes com
bio-bancos de amostras contendo ADN como a base de estudo. Neste
contexto, a recolha e a extraco do ADN a partir de diferentes fontes de
amostras biolgicas (por exemplo, tecidos de autpsia arquivados fixados
em formalina, manchas de sangue seco, congelado soro ou plasma, sangue
total LTS) esto crescendo campos da medicina molecular. Assim, os
cientistas so confrontados com o problema de escolher mtodos que no
s so capazes de recuperar grandes quantidades de cidos nucleicos, mas
tambm produzir cpias amplificveis.
Apesar da maioria dos grupos de pesquisa em todo o mundo ainda
realizadas extrao de DNA usando protocolos tradicionais, como Proteinase
K e mtodos de salga-out, sistema de extraco de cido nucleico
automatizado foram desenvolvidos devido influncia de rpido
crescimento da tecnologia de automao hoje em dia. A automatizao
processo de extraco de cido nucleico potencialmente vantajosa por
uma srie de razes, incluindo para reduzir o tempo de trabalho, diminuir os
custos do trabalho, aumentar a segurana do trabalhador e ao mesmo
tempo proporciona oportunidade para aumentar a reprodutibilidade e a
qualidade dos resultados. Alm disso, o emprego de anlise gentica
baseada em contextos clnicos em chama em alta sensibilidade e
especificidade. No entanto, a melhoria dos pontos fracos para alguns dos
instrumentos precisa ser realizado todo o tempo. No tempo mdio, um
sistema tudo-em-um bio-molculas de extraco, ou o invento de um
sistema de extraco em miniatura e porttil pode tornar-se um potencial
de desenvolvimento no futuro.

RECONHECIMENTO
Nenhum declarado.