Está en la página 1de 36

Universidad Nacional de Trujillo

Facultad de Medicina

1. ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
DEFINICION:
Las enzimas de restricción, también conocidas como endonucleasas, son aquellas que
reconocen una secuencia entre 4-8 pb en DNAds. El sitio de reconocimiento se llama
sitio de restricción, y la enzima rompe un enlace fosfodiester en la hebra de arriba y otro
enlace fosfodiester en la hebra complementaria.
En 1975 Daniel Nathans y Hamilton O. Smith descubrieron un tipo de proteínas –las
enzimas endonucleasas o enzimas de restricción- que actúan como “tijeras
moleculares”, cortando la doble cadena de ADN a través del esqueleto de fosfatos sin
dañar las bases. El descubrimiento de estas enzimas condujo a dichos microbiólogos al
Nóbel en 1978 y dio origen a la ingeniería genética.
Las enzimas de restricción permiten cortar el genoma de cualquier organismo en
pequeños fragmentos llamados fragmentos de restricción. La colección de miles o
millones de estos fragmentos se llama biblioteca génica.
Las mismas permiten cortar DNA de hebra doble, donde reconocen secuencias
palindrómicas (secuencias que se leen igual en ambas direcciones).
Son extraídas de organismos procarióticos (bacterias), donde actúan como un
mecanismo de defensa, para degradar material genético extraño que entre en la célula.
Las bacterias tienen la capacidad de metilar su DNA, lo cual sirve para distinguir entre
el DNA extraño y el DNA propio. Las enzimas de restricción no pueden cortar DNA
metilado, de este modo solo afectan el DNA extranjero y no el DNA bacterial.
Este sistema es análogo a
un sistema inmune, y le
permite distinguir a la
bacteria entre su propio
DNA y el DNA exógeno,

SEMINARIO: TÉCNICAS MOLECULARES DEL ADN

1

Universidad Nacional de Trujillo
Facultad de Medicina

siendo este último degradado por la enzima de restricción. El DNA propio no es
reconocido por sus enzimas de restricción, puesto que previamente lo ha modificado por
metilación a través de la acción de una metiltransferasa (enzima que transfiere grupos
metilo desde S-adenosilmetionina a bases específicas). Se conocen aproximadamente
1200 tipos diferentes de enzimas, las cuales actúan a 37º C y se inactivan rápidamente.

El término “restricción” proviene del mecanismo de acción que cumplen estas enzimas
en las bacterias que las sintetizan. Cortan el ADN del virus que las parasitan
“restringiendo” la duplicación del mismo.
Las enzimas de restricción cortan dejando extremos cohesivos o romos. Los extremos
cohesivos son generados cuando la enzima corta las dos hebras asimétricamente,
dejando los extremos de cada hebra de simples cadenas complementarias entre sí. Por
otro lado, los extremos romos son generados cuando la enzima corta las dos hebras por
el mismo lugar, generando dos extremos doble cadena.
Estas moléculas son indispensables para la ingeniería genética, ya que producen
fragmentos que se pueden unir entre sí fácilmente (con la ayuda de un “pegamento
molecular”: la enzima ligasa). Estas enzimas tienen la capacidad de reconocer una
secuencia determinada de nucleótidos y extraerla del resto de la cadena. Esta secuencia,
que se denomina Restriction Fragment Lenght Polymophism o RLPM, puede volver a
colocarse con la ayuda de otra clase de enzimas, las ligasas. Análogamente, la enzima
de restricción se convierte en una "tijera de ADN", y la ligasa en el "pegamento". Por lo
tanto, es posible quitar un gen de la cadena principal y en su lugar colocar otro.

Figura 1.
Enzimas de restricción. Este tipo de endonucleasas puede dejar dos tipos de extremos.
En el primer caso, el corte genera nucléotidos de simple cadena llamados extremos
SEMINARIO: TÉCNICAS MOLECULARES DEL ADN

2

Universidad Nacional de Trujillo
Facultad de Medicina

cohesivos. Estos extremos se pueden unir por medio de otra enzima, la ADN ligasa. En
el segundo caso, se generan extremos doble cadena (extremos romos). Estos extremos
también pueden ser unidos con la ayuda de una enzima ligasa pero, como no los
extremos no son complementarios, la unión será más inespecífica.
Fragmentos de restricción:
La longitud de los fragmentos de restricción depende de los sitios de corte de la enzima.
Si ocurriese un cambio de bases en el sitio de corte, la enzima respectiva dejará de
reconocer a éste como tal, dando lugar a un corte en otro sector y por lo tanto se
originará un fragmento de restricción de mayor longitud. También hay que tener en
cuenta que un cambio en una base puede crear un sitio de corte en una zona donde
habitualmente no existía, dando lugar a la aparición de un fragmento de restricción de
menor

longitud.

Estas variaciones de reconocen como RFLP o Polimorfismo de longitud de los
fragmentos de restricción.
RFLP, uso en identificación de personas:
A lo largo de todo el genoma existen determinadas regiones en las cuales las bases se
repiten en secuencias cortas. Estas regiones se conocen como repeticiones en tandem de
número variable o VNTR . Se han identificado numerosas enzimas de restricción que
actúan a este nivel, las cuales al cortar determinan la aparición de fragmentos cuyas
longitudes

dependerá

del

número

de

VNTR

existentes.

Como hay una gran cantidad de regiones VNTR y diferentes entre sí, el patrón de
bandas resultante es exclusivo de cada individuo, dado que la probabilidad que se repita
en

dos

sujetos

diferentes

es

inferior

a

una

cada

cien

millones.

Esta particularidad resulta útil en la identificación de las personas y en la genética
forense, ya que no existe un individuo con idéntico patrón génico que el otro.

SEMINARIO: TÉCNICAS MOLECULARES DEL ADN

3

con pesos moleculares de 400.  Requieren ATP. con pesos moleculares menores de 80. No necesitan ATP.  Estas endonucleasas reconocen secuencias especificas en el DNA. Esta es la razón por la cual las enzimas de restricción pertenecientes al tipo I no han sido muy utilizadas en biología molecular. para lo que requieren Sadenosilmetionina y es estimulada por Mg2+ y ATP.000 daltons o mayores. Mg2+ y S-adenosilmetionina para su actividad.  Las secuencias de reconocimiento de las enzimas tipo II son de tipo palíndrome (se leen igual de izquierda a derecha que de derecha a izquierda).  Los sitios de ruptura en el DNA no son específicos.Universidad Nacional de Trujillo Facultad de Medicina TIPOS DE ENZIMAS DE RESTRICCIÓN: Sistemas tipo I:  Son complejos multienzimáticos.  Estas enzimas tipo II son las utilizadas en el clonamiento de genes. actividad ATPasa y actividad nucleolítica sobre DNA.  Las enzimas de restricción correspondientes a este tipo tienen diferentes actividades enzimáticas. SEMINARIO: TÉCNICAS MOLECULARES DEL ADN 4 . Sistemas tipo II  Enzimas diferentes realizan la restricción y modificación. recuperar secuencias conocidas. y así.  Son menos complejas. sino que es al azar y en sitios distantes al de reconocimiento. mutilar y restringir. puesto que permiten romper el DNA en sitios específicos.  Sus actividades principales son reconocer la secuencia especifica del ADN. ocurriendo entre 1 y 5 kb del sitio de reconocimiento. rompiéndole en ambas cadenas y generando fragmentos equimolares en la molécula de DNA sustrato. como metilación de DNA. La restricción ocurre en el sitio de reconocimiento ó adyacente. pero la restricción no ocurre en el sitio de reconocimiento.000 daltons  Requieren únicamente Mg2+ para la actividad nucleolítica.

Si las moléculas a utilizar presentan extremos ciegos. con aproximadamente unas 85 secuencias específicas de reconocimiento diferentes. por ejemplo utilizando la enzima transferasa terminal.  Dada su especificidad. puesto que permiten la unión espontánea del gen a clonar con el vector. dejando productos con extremos ciegos Ej: Alu I Aunque se utilizan ambas clases de fragmentos (con extremos ciegos y con extremos escalonados). en ingeniería genética se prefieren aquellos con extremos complementarios. estas enzimas han sido extremadamente útiles en biología molecular. Ejemplos de enzimas de restricción tipo II: MICROORGANISMO ENZIMA SECUENCIA Arthrobacter luteus Alu I AG· CT TC· GA Escherichia coli RY13 Eco RI G· AATTC CTTAA· G Escherichia coli J62 Eco RV GAT· ATC CTA· TAG Klebsiella neumoniae Kpn I GGTAC· C C· CATGG SEMINARIO: TÉCNICAS MOLECULARES DEL ADN 5 . hay que conferirles extremos cohesivos.  Se han aislado alrededor de 350 diferentes endonucleasas de restricción del tipo II. pero que reconocen la misma secuencia de DNA. dejando productos con extremos complementarios (cohesivos) Ej: Eco RI  Cortes simétricos.Universidad Nacional de Trujillo Facultad de Medicina  Se denominan isoquizómeros a aquellas enzimas que han sido obtenidas de diferentes especies de bacterias.  Provocan 2 tipos de cortes:  Cortes escalonados. que posibilita el predecir los posibles fragmentos producidos a partir de una secuencia conocida de DNA.

SEMINARIO: TÉCNICAS MOLECULARES DEL ADN 6 .Universidad Nacional de Trujillo Facultad de Medicina Nocardia otitis-caviarum Not I GC· GGCCGC CG CCGG· CG Haemophilus aegyptus Hae III RGCGC· Y Y· CGCGR Haemophilus influenzae Hinf I G· ANTC CTNA· G R: significa base púrica (A ó G) Y: significa pirimidina (C ó T) N : significa cualquier nucleótido * : indica ruptura enlace fosfodiester Sistemas tipo III  Es similar al sistema tipo I. ocurre a aproximadamente 10 a 20 nucleótidos de distancia del sitio de reconocimiento. aunque resulta estimulada por él.  La actividad metilasa requiere S-adenosilmetionina únicamente como donador de grupos metilo y se han aislado formas metilantes libres de actividad nucleolítica.  Comprende endonucleasas que requieren ATP y Mg2+ aunque no tienen actividad de hidrólisis de ATP detectable  La actividad endonucleasa no tiene un requerimiento estricto de Sadenosilmetionina.  Utilizan una enzima oligomérica que realiza todas las actividades enzimáticas. sugiriendo que la endonucleasa y la metilasa son componentes del mismo complejo molecular que es capaz de disociarse en condiciones apropiadas. y rompen el DNA 25-27 pb más allá del sitio de reconocimiento.  El sitio de ruptura de DNA. por estas enzimas del tipo III.

En algunas ocasiones se puede determinar cual es él numero de copias de un gen presentes en un determinado genoma. Estudio del numero de copias de un gen. Las enzimas de restricci6n han sido utilizadas para la construcción de los mapas genéticos de pequeños genomas como plásmidos. zona de los promotores. zonas de poliadenilación. Este análisis se realiza mediante la detección de la ausencia de sitios de reconocimiento para determinadas endonucleasas de restricción. SEMINARIO: TÉCNICAS MOLECULARES DEL ADN 7 . como por ejemplo determinación de exones e intrones de un gen. secuencias adyacentes a los extremos 5'. y en general todo tipo de estudios de carácter estructural en los que es imprescindible el desarrollo de mapas de restricción. Además de este uso son imprescindibles para la caracterización de genes obtenidos por técnicas de DNA recombinante. bacteriófagos o virus. Vamos sin embargo a desarrollar brevemente algunos aspectos en los que la utilización de estas enzimas tienen una aportación especifica al campo de la biología molecular.Universidad Nacional de Trujillo Facultad de Medicina Aplicaciones: El descubrimiento de las endonucleasas de restricción ha permitido el desarrollo vertiginoso de lo que se denomina tecnología del DNA recombinante.

para evitar la posibilidad de separación en los procesos de recombinación meiótica. Mediante el análisis del tamaño de los distintos fragmentos de restricción que producen SEMINARIO: TÉCNICAS MOLECULARES DEL ADN 8 . Este hecho permite la detección de enfermedades congénitas tanto en individuos afectados como en individuos portadores. Este tipo de aproximación se ha utilizado en el análisis del numero de copias presentes en el genoma humano para él interferían 1'5'. así como para él numero de copias presentes para la subunidad a de la gonadotropina corionica humana '14'. Estas alteraciones pueden ser detectadas utilizando endonucleasas de restricción. permitiendo un diagnostico prenatal. ya que una determinada alteración puede originar o suprimir el sitio de reconocimiento de una endonucleasa de restricción determinada. separación mediante electroforesis. o RFLPs (~restriction fragment length polymorphisms~). La técnica utilizada consiste en el análisis de las variaciones en los tamaños de los fragmentos de restricción. Generación de fragmentos para ser usados como sondas marcadas en “Southern”y “Northern” blotting. Medicina: Existen una serie de enfermedades congénitas debidas a alteraciones en la estructura del DNA. Se basa en la obtención de DNA de los individuos afectados por la enfermedad en estudio. en DNA extraído de fibroblastos fetales mediante amniocentesis o biopsia de vellosidades corionicas. podemos tener una aproximación del número de copias presentes en el genoma mediante la observación del numero de bandas de hibridación obtenidas en el digerido del DNA genómico. transferencia a nitrocelulosa e hibridaci6n con sondas de DNA pertenecientes al gen en estudio o a un fragmento de DNA próximo a ese gen. Mediante digestión del DNA genómico con las enzimas de restricción para las que no existen sitios de reconocimiento en ese gen e hibridación con sondas de DNA para ello. Fragmentar DNA genómico para separación de electroforesis y “Southern Blot”. su digestión con una bacteria de diferentes enzimas de restricción. y lo que es más importante. como.Universidad Nacional de Trujillo Facultad de Medicina dentro de la secuencia codificante del gen.

acoplando los abundantes fragmentos de ADN formados durante la copia del material genético en la división celular. ADN ligasa. es decir que existen pequeñas variaciones en la estructura del DNA de unos individuos a otros. La ADN ligasa 1 es especifica para replicación de ADN y es la encargada de formar el enlace fosfodiester entre los fragmentos de la cadena rezagada. Estos tres genes codifican para cuatro ADN ligasas existentes. Participa también en el mantenimiento de la actividad genómica y su actividad. lo que se pretende con el análisis por RFLPs es asociar una variante determinada con una enfermedad determinada. LIG2. que requiere ATP como cofactor. La formación de un enlace fosfodiester entre estos grupos es una reacción endergónica. por ejemplo. Las ADN ligasas son blancos atractivos para la quimioterapia del cáncer y otras enfermedades. LIG4.libre en el 3`final de la cadena de ADN y un grupo fosfato en el 5`final. TIPOS: En los mamíferos se ha identificado 3 genes que codifican para el ADN ligasa: LIG1. 2. La ADN ligasa usada más habitualmente es la T4 ADN ligasa. Esta enzima requiere de un grupo OH. Hay que destacar que las poblaciones humanas son polimórficas. La enzima. ADN ligasa es una enzima que forma enlaces covalentes entre el extremo 5’ de una cadena polinucleotídica y el extremo 3’ de otra cadena polinucleotídica. Dos formas de ADN ligasa III SEMINARIO: TÉCNICAS MOLECULARES DEL ADN 9 . ADN LIGASA DEFINICIÓN: En 1967 la investigación en varios laboratorios simultáneamente llevó al descubrimiento de la ADN ligasa llamada también enzima de unión de polinucleótidos. la ADN ligasa II deriva del ADN ligasa III por medio de un mecanismo proteolítico. por el análisis del DNA de individuos pertenecientes a familias afectadas por esa enfermedad. podemos asociar un determinado modelo de restricción con el padecimiento de la enfermedad que estamos estudiando.Universidad Nacional de Trujillo Facultad de Medicina hibridación. repara los millones de discontinuidades de ADN generadas durante la vida normal de la célula.

menos de diez pares de la base se realizan los experimentos del ligación a las temperaturas muy bajas (~4-8°C) para un período largo de tiempo (a menudo de noche). es realizar la recombinación exitosa experimenta involucrando el ligase está controlando la temperatura óptima. La ADN ligasa III α expresada en forma ubicua forma complejos con la proteína XRRCC1 implicada en la reparación de roturas de cadena sencilla . Por ejemplo. Uno vital.En contraste. la ADN ligasa III β se expresa solo en células meióticas masculinas. coli u otras bacterias. la temperatura de la enzima óptima necesita ser equilibrada con la Tm de temperatura fundición (también la temperatura del recocido) del los fragmentos ligados de ADN. Si la temperatura ambiente excede la Tm. lo que sugiere que intervienen en la recombinación meiótica. en el plásmidos. el más bajo la Tm. La ADN ligasa IV parece estar implicada en la reparación directa de roturas de doble cadena DSB (double strand break) Las aplicaciones en la investigación de la biología molecular. Así para los fines pegajosos (los traslapo) mucho tiempo. El más corto el ADN fragmenta. E. La mayoría de los experimentos usa T4 ADN Ligasa (se aisló del bacteriófago T4) qué es muy activo a las 25°C. a menudo los genes.Universidad Nacional de Trujillo Facultad de Medicina se producen por remoción alternativa de intrones. Sin embargo para realizar el ligado exitoso. el apareamiento homólogo de los fines pegajosos no ocurrirá porque la temperatura alta rompe la vinculación de hidrógeno. Los ligasas de ADN disponibles comercialmente comunes se descubrieron originalmente en el bacteriófago T4. y a menudo trapacero. se usan los ligasas de ADN con las enzimas de la restricción para insertar ADN fragmenta. SEMINARIO: TÉCNICAS MOLECULARES DEL ADN 10 . Las ligasas de ADN se han vuelto una herramienta indispensable en la investigación de la biología molecular moderna para el recombinante generador las sucesiones de ADN.

Una actividad exonucleasa 5' 3' que elimina todos los nucleótidos (ribonucleótido o SEMINARIO: TÉCNICAS MOLECULARES DEL ADN 11 . una ADN polimerasa de tipo I posee dos tipos de actividades exonucleasas.Universidad Nacional de Trujillo Facultad de Medicina 3. Partiendo de una cadena inicial o “primer” la ADN polimerasa añade nucleótidos complementarios a la cadena molde extendiendo la nueva cadena de ADN en dirección 5’. Los ADN pol de tipo I terminan la replicación. Ésta que Constituye la piedra angular de la reacción de la polimerasa en cadena (PCR) que se utiliza para amplificar el ADN. La ADN polimerasa también se encarga de la reparación del ADN asociada a la replicación. sirviendo como patrón una cadena simple de ADN. El modelo de sustitución es altamente específico. La ADN polimerasa sólo puede catalizar el crecimiento de la cadena inicial en dirección 5'-3'. ensamblando los trifosfatos de desoxirribonucleósido en el ADN. tienen también actividades exonucleasas. ADN POLIMERASA DEFINICIÓN: La búsqueda de una enzima que sintetizase el ADN llevo al descubrimientos de la ADN polimerasa por Arthur Kornberg y colaboradores. Las actividades exonucleasas de la DNA pol: La ADN polimerasa son proteínas que además de las actividades polimerasas que poseen. Partiendo de una cadena inicial o “primer” la ADN polimerasa es capaz de añadir nucleótidos complementarios a la cadena molde estableciendo enlaces fosfodiéster. eliminando los cebadores ARN en los secuencias de Okazaki y corrigiéndo los errores producidos por la polimerasa de tipo III.3’. Para realizar ésta actividad. La ADN polimerasa es la enzima principal en el proceso de replicación. La ADN polimerasa es la principal enzima de la replicación.

aunque es probable que en levaduras y mamíferos contengan una subunidad adicional con una masa aproximada de 50kDa. Estas dos ADN polimerasas funcionan durante la fase S del ciclo celular en las células eucariontes. activa la polimerasa epsilon. Las polimerasas que poseen ésta actividad exonucleasas producen menos faltas pero son 10 veces más lentas. de este modo ha surgido que la replicación de la cadena rezagada se debe a la polimerasa epsilon. beta. diferenciándose en su localización. Esta actividad es muy útil para la reacción en cadena en tiempo real y en la técnica del marcado de sondas denominada translación nick (nick translation). La otra actividad (3' 5') es la actividad "proofreading". Además. la presencia de esta enzima en la horquilla de replicación reprime la acción de la polimerasa delta y por el contrario. La ADN polimerasa epsilon parece que también está involucrada en un tipo de reparación del ADN. actividad y sensibilidad a los inhibidores: alfa. gamma. Las polimerasas se utilizan también para el secuencaje. LA polimerasa delta es necesaria para la síntesis tanto de la cadena libre como de la cadena rezagada durante la replicación. delta y épsilon:  Las ADN polimerasas delta y epsilon: Dirigen la replicación de la cadena conductora o “leading strand” que es la cadena que crece de 5' a 3' en mismo sentido que crece la nueva copia de ADN. La interacción de las polimerasas delta y epsilon con el ADN ligasa I es diferente.Universidad Nacional de Trujillo Facultad de Medicina desoxiribonucleótido) situados al final del cebador. delta y epsilon tienen SEMINARIO: TÉCNICAS MOLECULARES DEL ADN 12 . osea la correción de errores. solamente en los eucariotas y archaea. El ADN polimerasa delta es un heterodímero compuesto de una subunidad P125 y otra P50. Esta actividad no existe en los procariotas (bacterias). P 125 es la subunidad catalítica tanto para la actividad de polimerasa como para la edición con actividad de exonucleasa 3`5`. TIPOS: Hay 5 ADN polimerasas diferentes bien caracterizadas. las ADN polimerasas gamma. Se considera que la actividad exonucleasa 5' 3' destruye una parte de los cebadores y como tal se pueden encontrar polimerasas desprovistas de éstas actividades.

 La ADN polimerasa alfa: Participa en el proceso de replicación del ADN dirigiendo la replicación de la cadena retardada o “lagging strand” que es la cadena que crece de 3' a 5' que es el sentido contrario al del crecimiento global de la nueva copia de ADN. La polimerización evita la hidrólisis a partir del extremo 3`. la ADN polimerasa I es una exonucleasa 3´5´. En efecto. No hay hidrólisis. Primero el enlace roto puede estar en una región de doble hélice. Así pues. La ADN polimerasa puede hidrolizar ADN progresivamente desde el extremo 3 ´-hidroxilo de una hebra de ADN. La ADN polimerasa 1 puede también hidrolizar ADN a partir del extremo 5` de la cadena. Una propiedad adicional enzimática de la ADN polimerasa es su capacidad para hidrolizar cadenas de ADN bajo ciertas condiciones.Universidad Nacional de Trujillo Facultad de Medicina actividad exonucleasa 3'5' y. Tercero. el centro activo para la actividad de nucleasa 5`3` es completamente diferente de los centros activos de la polimerización y SEMINARIO: TÉCNICAS MOLECULARES DEL ADN 13 . Los productos son mononucleótidos. y no puede ser parte de una doble hélice. son capaces de eliminar los nucleótidos del extremo 3' que han sido incorporados incorrectamente en un proceso conocido como corrección de pruebas. la ADN polimerasa 1 examina el resultado de cada polimerización que cataliza antes de la incorporación del siguiente nucleótido. Segundo la rotura puede ocurrir en el enlace fosfodiester Terminal o en un enlace a varios residuos de distancia del Terminal 5`. Cuarto. Esta actividad de nucleasa 5`3` es muy diferente al de la exonucleasa 3`5`. si los términos están convenientemente acoplados y están presentes los precursores activados. El nucleótido eliminado debe tener un termino 3´-OH libre. La polimerización generalmente no ocurre excepto si los pares de bases encajan en una doble hélice. Experimentos con una variedad de polímeros sintéticos han indicado que la ADN polimerasa I siempre elimina residuos no aparentes de los extremos antes de proseguir con la polimerización. la actividad de nucleasas 5`3` es intensificada por la síntesis concomitante de ADN. por tanto. Sin embargo si se produce un error en esta etapa puede ser corregido antes que sea incorporado al siguiente nucleótido.

mientras los restantes fragmentos grandes contienen las actividades de la polimerasa y de nucleasas 3` 5`. ADN polimerasa Localización  (I)  (III) (II)  nuclear nuclear nuclear nuclear SEMINARIO: TÉCNICAS MOLECULARES DEL ADN  mitocondrial 14 . En algunos casos estas mutaciones pueden deberse a la presencia de regiones de poliglutamina en la secuencia codificante de la ADN polimerasa gamma. El ADN polimerasa 1 puede dividirse en fragmentos de 75000 y 36000 daltons por división proteolítica controlada. Así pues la ADN polimerasa 1 contiene al menos 2 tipos de enzimas distintas en una cadena polipeptídica.  La ADN polimerasa beta: Se encarga de los procesos de reparación del ADN.Universidad Nacional de Trujillo Facultad de Medicina la hidrólisis 3`5`.  La ADN polimerasa gamma: Realiza la replicación del ADN mitocondrial. se ha encontrado que mutaciones en la ADN polimerasa delta. pueden ser responsables del inicio y desarrollo de tumores. Se está estudiando la relación entre mutaciones en la ADN polimerasa gamma (mitocondrial) con enfermedades neurodegenerativas como el Parkinson o algunos tipos de distrofia muscular. Por otra parte. probablemente en su dominio con actividad exonucleasa responsable de la corrección de pruebas. Los fragmentos pequeños tienen actividad de nucleasa 5` 3`original.

se utiliza ampliamente para clonar genes a partir de sus ARN mensajeros TRANSCRIPCIÓN REVERSA Y PCR (RT-PCR) SEMINARIO: TÉCNICAS MOLECULARES DEL ADN 15 . es decir. Su nombre obedece a que el proceso normal de la transcripción. codifica el ARN a partir de la secuencia inicial de ADN. el descubrimiento de un grupo de organismos capaces de invertir el sentido de este flujo conmovió los cimientos de este dogma central. que naturalmente producen ciertos virus para invadir el genoma de sus células blanco. ser completada la hebra de DNA de doble cadena. y no al revés. Estos organismos son un tipo de virus que se ha denominado Retrovirus. Sin embargo. Dicho híbrido podría separarse mediante ribonucleasas. formándose así un híbrido RNA/DNA. hace algún tiempo. afidicolina desoxi-TTP 3´-5´ exonucleasa desoxi-TTP TRANSCRIPTASA INVERSA DEFINICIÓN: Durante muchos años se creyó que ese flujo de información genética era unidireccional.Universidad Nacional de Trujillo Facultad de Medicina Función en síntesis cebar síntesis ADN reparación 3´-5´ 3´-5´ exonucleasa exonucleasa afidicolina afidicolina reparación replicación de ADN otras funciones inhibidores 4. Esta enzima se encuentra presente en los retrovirus. La transcriptasa inversa o retrotranscriptasa es una enzima de tipo ADN-polimerasa. La enzima transcriptasa reversa. que tiene como función sintetizar ADN de doble cadena utilizando como molde ARN monocatenario. hasta tal punto que dicho supuesto constituía el llamado "dogma central" de la biología molecular. la que se puede llamar "directa". catalizar la retrotranscripción o transcripción inversa. Una forma sencilla de síntesis de DNA de doble cadena a partir de transcriptasa inversa o también llamada DNA polimerasa/RNA dirigida sería partir de un cebador cola de poli-T que establecería bases complementarias con la cola de poli-A del RNA transcrito de la hebra a sintetizar. y posteriormente con la acción de una DNA-polimerasa y un nuevo cebador.

CARACTERÍSTICAS:  Técnica que consiste en la amplificación in vitro de un fragmento de ADN específico.Si se inicia la reacción con una copia del gen y este es copiado en el primer ciclo. Los resultados son comparados con los tejidos sanos los retrovirus. ya que en cada ciclo se copian las dos cadenas del ADN . tanto en las muestras.La concentración de copias aumenta exponencialmente.Universidad Nacional de Trujillo Facultad de Medicina Este método combina la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con el proceso de transcripción reversa. se ha detener dos copias ..Existen varios factores que influencian la eficiencia del proceso . SEMINARIO: TÉCNICAS MOLECULARES DEL ADN 16 . 1. En el caso del estudio de tejidos cancerigenos se realiza la extracción de ARN del tejido. y que está presente en muy bajas cantidades en el material clínico a investigar. es la etapa clave en el proceso de RT-PCR57. La transcripción reversa. la presencia de ARN o ADN contaminante. Tiene como propósito generar un gran número de copias de un fragmento de ADN de interés in Vitro . debe ser evitada con el fin de impedir la aparición de productos inespecíficos.tales como la acción de la enzima que lleva acabo la reacción y la presencia de estructuras secundarias en el ARN.tanto utilizando ARN total como ARNm. Es más sensible y requiere menos ARN .Sin embargo.En el segundo ciclo se a de concluir con la formación de cuatro copias. como en laboratorios y reactivos. El método de RT-PCR permite medir la expresión génica mediante una técnica alternativa al Northen Blot. etc. se efectúa la transcripción reversa y finalmente se lleva acabo el PCR.

cantidades elevadas de desoxirribonucleótidos trifosfato (dATP.  La reacción en cadena de la polimerasa.  Los elementos que se emplean y participan en esta técnica. dGTP. TÉCNICAS: La técnica del PCR consiste básicamente en la desnaturalización. en el transcurrir de pocas horas en in vitro. es una técnica que permite replicar entre cientos de miles y millones de veces.  Se emplean ADN polimerasas termoestables. extraídas de microorganismos adaptados a vivir a altas temperaturas. ya que es más específica. 2. dTTP) y dos oligonucleótidos cebadores de hebra simple complementaria a las secuencias conocidas del ADN patrón. dCTP. restrictivas para la mayoría de los seres vivos. (Polimerasa taq) una bacteria que vive en fuentes termales y que es muy resistente al calor. SEMINARIO: TÉCNICAS MOLECULARES DEL ADN 17 . son: la ADN polimerasa. estas son: la desnaturalización. alineación o hibridación y la extensión o amplificación.  El producto que se obtiene al finalizar la reacción es una gran cantidad de un fragmento génico con alto grado de pureza. y por ende se consigue una mejor fidelidad del proceso. estos procesos se repiten continuamente. pequeñas cantidades de ADN. lo que hace que no se inactive por desnaturalización cuando en el proceso se aumenta la temperatura.Universidad Nacional de Trujillo Facultad de Medicina  El fundamento de esta reacción en cadena es la repetición cíclica de 3 reacciones simples que varían sólo en cuanto a la temperatura de incubación. como las: Thermus aquaticus. la alineación y la extensión.

y empieza a sintetizar ADN. En la técnica de PCR in situ se realiza una primera amplificación de ADN SEMINARIO: TÉCNICAS MOLECULARES DEL ADN 18 . del ADN patrón de doble hebra en hebras simples. Para ello es necesario bajar la temperatura a 50-65ºC durante 20-40 segundos (según el caso). actúa la ADN polimerasa.  PCR in situ: Consiste en una reacción de PCR en secciones histológicas o células. donde los productos generados pueden visualizarse en el sitio de amplificación. por calentamiento a temperatura elevada ( mayor de 90 ºC) . es decir. tomando el ADN molde para sintetizar la cadena complementaria y partiendo del cebador como soporte inicial necesario para la síntesis de nuevo ADN. el cebador se unirá a su secuencia complementaria en el ADN molde. Los puentes de hidrógeno estables entre las cadenas de ADN sólo se forman cuando la secuencia del cebador es muy similar a la secuencia del ADN molde.  Modificaciones de la técnica: Éstas sirven para mejorar la especificidad de la reacción de las PCRs:  PCR anidada: (nested PCR) Técnica muy sensible de PCR en la que el producto de la primera amplificación. Es realizada sobre preparaciones fijas en un portaobjetos. la polimerasa de ADN polimerizará mil bases en un minuto. permitiendo así el alineamiento. La polimerasa une el híbrido de la cadena molde y el cebador. Los cebadores actuarán como límites de la región de la molécula que va a ser amplificada. C) La Extensión o Amplificación. es utilizado como molde para realizar una segunda amplificación con cebadores que se ubican dentro de la primera secuencia amplificada. La polimerasa sintetiza una nueva hebra de ADN complementaria a la hebra molde añadiendo los nucleótidos trifosfatos en dirección 5’3’. El tiempo de extensión depende tanto de la ADN polimerasa usada como de la longitud del fragmento de ADN que se va a amplificar. B) La Alineación o unión de los cebadores. Este tipo de PCR es muy específica.Universidad Nacional de Trujillo Facultad de Medicina A) La Desnaturalización. se producirá la hibridación del cebador. Hay una regla básica: en su temperatura óptima.

como son los productos previos que forman el molde principal. La PCR es precedida por una reacción usando la transcriptasa inversa para convertir el RNA a cDNA (ADN complementario). El principio es iniciar la síntesis a muy altas temperaturas de alineamiento lo cual sólo permite la formación única de los pares perfectamente alinéanos cebador-molde. De esta manera pueden detectarse cantidades pequeñísimas de genoma. para determinar la expresión de un gen o para identificar la secuencia de una transcripción de ARN. la genética. La temperatura de alineamiento es bajada de una forma gradual con cada ciclo. el mapa de ubicación de exones e intrones en el gen. aislar o identificar una secuencia conocida de tejido RNA. Una vez que las copias de la secuencia diana han comenzado a acumularse durante los primeros ciclos.  RT-PCR (Revese Transcription PCR): Utilizado para amplificar. esta técnica se desarrolla en diversos campos como la biología molecular.  PCR por contacto: Técnica utilizada para incrementar la especificidad sin comprometer la producción. si la secuencia del ADN geonómico de un gen es conocido. Los productos improbablemente tendrán secuencias de alineamiento falso. El resultado es una mejora en la producción del producto específico comparándolo con los protocolos que utilizan alineamiento a una única alta temperatura. medicina y otros. El beneficio de disminuir la temperatura de alineamiento es el incrementar la probabilidad de una interacción estable cebador-diana.Universidad Nacional de Trujillo Facultad de Medicina blanco y luego detección mediante hibridación in situ convencional con sondas de ADN/ARN. el alineamiento a alta temperatura llega a ser mucho menos crítico para la especificidad. SEMINARIO: TÉCNICAS MOLECULARES DEL ADN 19 . Esta tecnología es de gran alcance en la capacidad de amplificar específicamente una población de secuencias de menor representación. APLICACIONES BÁSICAS: Las aplicaciones de la PCR son múltiples. RT-PCR se utiliza ampliamente en perfiles de expresión. 3. incluyendo la transcripción de inicio y terminación de los sitios y.

virus o bacterias. virus de la inmunodeficiencia humana. SEMINARIO: TÉCNICAS MOLECULARES DEL ADN 20 . citomegalovirus. una célula somática o un espermatozoide. Una de las aplicaciones más útiles de la PCR en la oncología pediátrica es en la detección de traslocaciones cromosómicas. Mycobacterium tuberculosis. mutaciones en c-Ras y cáncer.despierta el interés de los investigadores por ampliar los conocimientos sobre la estructura y función de los genes. la secuenciación automática puede implementarse como método de screening para la localización de nuevas mutaciones. etc. lo que permite establecer un pronóstico de la enfermedad. Se emplea así en la secuenciación de ADN como un método de diagnóstico: Una vez que se ha caracterizado la relación con una enfermedad de una determinada mutación puntual (mutaciones en el gen de la galactosa 1P uridiltransferasa en la galactosemia. esta técnica permite identificar un gen a partir de un solo cabello. De la misma forma puede detectar rápida y exactamente la presencia de agentes infecciosos de lento crecimiento como Chlamydia trachomatis. Micoplasmas. En la detección de mutaciones: La técnica de PCR nos permite localizar mutaciones previamente descritas. y en muchos casos hecho posible. la tarea de identificación de personas. para vigilar la respuesta al tratamiento y en la detección de las recurrencias o de recaídas tempranas (se menciona que tiene una sensibilidad para detectar una sola célula tumoral entre un millón de células sanas). así como de anomalías de la expresión genética en ausencia de alteraciones del cariotipo. Toxoplasma gondii.Universidad Nacional de Trujillo Facultad de Medicina El producto que se obtiene al finalizar la reacción -una gran cantidad de un fragmento génico con alto grado de pureza. También se ha utilizado para realizar la subtipificación de neoplasias. Pneumocystis carinii. por ejemplo de hijos de desaparecidos. y para detectar el reordenamiento de tumores humanos con anomalías del cariotipo. En el campo de la microbiología e infectología. virus de la Hepatitis C. así mismo el PCR se ha utilizado para el estudio de la estructura y expresión de los oncogenes. incluyendo también la detección de la resistencia a los antibióticos. mediante el análisis de muestras del niño y de su abuela materna. Ha facilitado.) o de una pequeña deleción (deleción de tres bases en el gen CFTR de fibrosis quística ) puede desarrollarse un método de detección rutinario . Por su alta sensibilidad. se ha utilizado esta técnica para identificar el DNA de parásitos. herpesvirus.

En medicina. la PCR cuantitativa posibilita la determinación de la carga viral existente y por tanto. En el caso de infecciones virales que implican la integración del genoma del patógeno en el ADN del hospedador. e hizo posible reconocer mutaciones de genes vinculadas con enfermedades oncológicas. También ha facilitado el diagnóstico de enfermedades tales como las hemofilias A y B. determinación de la relación genética entre varios tipos de microorganismos similares. pues la existencia de anticuerpos maternos impide obtener resultados confiables. como en los servicios de donantes de sangre. para correlacionar la presencia de agentes virales o infecciosos en tejidos neoplásicos. 96 pruebas SEMINARIO: TÉCNICAS MOLECULARES DEL ADN 21 .  La PCR también se puede usar en revisiones médicas rutinarias. con los métodos convencionales. Entre las aplicaciones médicas de la PCR. la PCR se emplea fundamentalmente como herramienta de diagnostico:  Permite el genotipar la especie o especies que provocan un determinado cuadro infeccioso: para ello. del estadio de la enfermedad. La técnica de PCR tiene el potencial de realizar una rápida detección del DNA bacteriano en muestras de sangre. la distrofia muscular y la fibrosis quística. detección de microorganismos en células infectadas o transformadas. Ha sido aplicada. durante el primer año de vida. Permite detectar agentes infecciosos como los virus de las hepatitis B y C o regiones del genoma del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV). y evita los contratiempos encontrados con los cultivos sanguíneos en el diagnóstico de bacteriemia. Dada la sensibilidad de los test de PCR se pueden tomar muestras colectivas o "pools" (por ejemplo. para diagnosticar la presencia o ausencia de HIV en recién nacidos de madres ceropositivas.Universidad Nacional de Trujillo Facultad de Medicina Por lo que se puede emplear en: diagnóstico rápido de infecciones víricas. cabe destacar su aporte al desarrollo de nuevas estrategias de diagnóstico. A través de esta técnica se pueden detectar infecciones peligrosas en el donante (como VIH o Hepatitis B) mientras aún están en el periodo de incubación. se amplifica una zona del genoma bacteriano cuyo producto de PCR posea unas características de tamaño o temperatura de fusión que permitan identificarlo de forma inequívoca. por ejemplo. como es el de la infección por VIH.

 Rapidez  Especificidad  NO requiere uso de radioisótopos (riesgosos y costosos)  Practicable con tejidos procedentes de vestigios arqueológicos.  El diagnóstico de enfermedades hereditarias presentes en el genoma es un proceso largo y complicado que puede acortarse significativamente gracias a la PCR. 4. CARACTERÍSTICAS SEMINARIO: TÉCNICAS MOLECULARES DEL ADN 22 . Ventajas:  Producir grandes cantidades de segmentos de un gen. Cada uno de los genes prueba se pueden amplificar mediante sus correspondientes primers y posteriormente secuenciar para detectar la existencia de mutaciones. 1.Universidad Nacional de Trujillo Facultad de Medicina individuales).1. Si una de estas muestras colectivas da positivo. VENTAJAS Y LIMITACIONES: 4. se toman a partir de ella muestras progresivamente menores hasta que se encuentra el causante. se convierte a la vez en el principal inconveniente. 4. a partir de una muestra mínima de ADN  En un espacio corto de tiempo genera un elevado número de copias de ADN. Vemos que una de sus mayores ventajas de la técnica.2. por lo que es de gran importancia evitar contaminaciones. ya que es posible que el ADN no deseado (aunque se encuentre en una cantidad muy pequeña) se amplifique y obtengamos un resultado que no es real. Limitaciones:  Contaminación en la PCR La Reacción en Cadena de la Polimerasa es una técnica muy sensible.

M. por ejemplo utilizando sonicación ó enzimas de restricción. mediante el uso de electroforesis en gel y de hibridación utilizando sondas especificas. en cambio el Northern Blot.  Utiliza la hibridación de ácidos nucleicos para la detección de las moléculas buscadas. TÉCNICAS SEMINARIO: TÉCNICAS MOLECULARES DEL ADN 23 . 2.  Permite detectar qué genes son transcriptos en determinadas condiciones.  Esta técnica fue desarrollado por E.  El Southern Blot nos permite evidenciar el mismo material genético. la expresión de diferentes genes.Universidad Nacional de Trujillo Facultad de Medicina  Técnica que permite la identificación de secuencias específicas de DNA. Southern para la detección de genes específicos en el ADN celular.  Para analizar una muestra de DNA cromosomal ésta debe ser previamente fragmentada.

Inicialmente la muestra de ADN es segmentada por una sonicación o una enzima de restricción. Luego. son separados de mayor a menor tamaño mediante una electroforesis de gel de agarosa empleando corriente eléctrica.Universidad Nacional de Trujillo Facultad de Medicina El Southern Blot es una técnica que permite la identificación de secuencias específicas de DNA como anterior fue mencionado. el filtro se incuba con una sonda marcada. Una vez terminada la electroforesis y sin teñir el gel los fragmentos de DNA se traspasan a un filtro de nitro celulosa o a una membrana de nylon. específicamente para la secuencia que deseas identificar (el traspaso de las muestras desde el gel al filtro SEMINARIO: TÉCNICAS MOLECULARES DEL ADN 24 .

 Es aplicable para distinguir muestras de biopsias ante confusiones. La sonda se marca con un isótopo radioactivo o con un fluorocromo. a través del reconocimiento de secuencias complementarias de ácidos nucleicos (hibridización). para el caso de sondas con fluorocromo. La sonda unida al fragmento de ADN complementario se puede visualizar en el filtro de una forma sencilla mediante una exposición a una película de rayos X para el caso de sondas radiactivas o con una película sensible a la luz.Universidad Nacional de Trujillo Facultad de Medicina es una etapa esencial. etc. La identificación con ADN o "huella genética" se basa en el estudio de una serie de fragmentos de ADN presentes en todos los individuos pero que poseen la característica de ser altamente variables o polimórficos entre los mismos. El análisis de un determinado número de estas secuencias o fragmentos de ADN permite identificar a un individuo con una probabilidad muy cercana al 100%. porque el reconocimiento de bases complementarias entre sonda y secuencias de DNA en el gel es muy ineficiente). que reconocerá a la secuencia de DNA inmovilizada en el filtro. violadores. Esta sonda es una secuencia de ácido nucleico. 3.   Útil en patología forense para identificar criminales. SEMINARIO: TÉCNICAS MOLECULARES DEL ADN 25 .  Para la identificación de fragmentos de ADN que contienen un gen determinado de entre una mezcla de muchos fragmentos. DNAds ó RNAm. APLICACIONES BÁSICAS Las aplicaciones son: Se utiliza para caracterizar ADN clonado.

VENTAJAS Y LIMITACIONES SEMINARIO: TÉCNICAS MOLECULARES DEL ADN 26 . 4. Se puede determinar clonalidad a partir del gen de las cadenas pesadas de inmunoglobulinas en linfomas B o de receptores de los antígenos en los linfomas T.  Aplicable para el estudio de alteraciones oncogénicas.  Tratado de alteraciones genéticas hereditarias.Universidad Nacional de Trujillo Facultad de Medicina  Reordenamiento genético en procesos linfoproliferativos.  Para la construcción de patrones de ADN identificativos de cada individuo como auténticas tarjetas de identificación como el DNI.

perteneciente al organismo patógeno en la  Rapidez en el diagnóstico  Debido a la alta sensibilidad de estas técnicas. ARN ribosomal) que generan patrones distintivos de hibridación similares al polimorfismo observado en eucariotas. es básicamente una prueba para detectar las secuencias de ARNm que son complementarias a un fragmento de ADN o ARN llamado sonda. para poder desarrollar sondas moleculares específicas a un organismo tenemos que haber clonado y secuenciado o parcialmente caracterizado el material genético que permita identificar regiones específicas a cada organismo y a cada especie. SEMINARIO: TÉCNICAS MOLECULARES DEL ADN 27 . CARACTERÍSTICAS: Northern blot o análisis Northern (en alusión al nombre del científico inventor de esta técnica).e. muestra a ser estudiada y la sensibilidad del mismo a ser degradado. 1. Con frecuencia se usan secuencias repetitivas en el ADN (i.  El conocer parcial o totalmente el genoma del organismo en cuestión.  se encuentra limitado principalmente por la representación del material genético  Alta especificidad. el mayor riesgo es el de contaminación de las muestras lo cual disminuye la especificidad.Universidad Nacional de Trujillo Facultad de Medicina VENTAJAS LIMITACIONES  Alta sensibilidad.

ELECTROFORESIS DEL RNA SEMINARIO: TÉCNICAS MOLECULARES DEL ADN 28 . para lograr este resultado se siembra las muestras en un gel. El RNA mensajero se une al poli-dT y queda retenido en la fase sólida. realizamos una corrida electroforética hasta lograr que las moléculas se separen por tamaños de manera tal que se puedan distinguir las buscadas. Se aprovecha la circunstancia de que la mayor parte de los RNA mensajeros tienen una cola de poli-A.Universidad Nacional de Trujillo Facultad de Medicina Detecta la presencia del ARN mensajero en un tejido en particular y permite determinar así el tamaño de la trascripción de ese ARN mensajero. Transferimos todo el ARN mensajero de un tipo determinado de tejido desde un gel a una membrana de nylon o nitrocelulosa y por medio de la hibridación de la membrana. Después de la separación del ARN del ADN geonómico. 2. Procederos a detallar cada etapa antes mencionada con mayor precisión: EXTRACCIÓN DEL RNA Las células o los tejidos se homogenizan en una solución que contenga inhibidores de las ARNasas(ribonucleasas). el RNA purificado se precipita con etanol durante el paso final de todos los procedimientos. El RNA celular total se pasa por una columna que contiene polidT unido a una fase sólida. ya que estos van a impedir la degradación del ARN durante su aislamiento y almacenamiento. La presencia de un ARN en particular se detecta hibridizando esta membrana con una sonda de ácido nucleico. detectamos la presencia del ARN particular con una sonda de ácido nucleico que generalmente de ADN o ARN del gen que nos interesa. eludiendo el resto de RNA y posteriormente se elude el RNA mensajero. TÉCNICA O FUNDAMENTO EL Northen Blot es un técnica de detección de genes. Debemos tener en cuenta para la realización satisfactoria de nuestro trabajo que las soluciones acuosas de RNA deben almacenarse congeladas y que se asegure la desnaturalización y por ende la obtención de nuestro ARN intacto. generalmente de cADN o ARNr del gen de interés.

el tamaño de los RNAm varía. La electroforesis en gel es muy utilizada en la detección. incubando la membrana con sondas específicas radiactivas o de otra naturaleza. basada en el movimiento o migración de las macromoléculas disueltas en un determinado medio (solución tampón de electroforesis). Explicaremos la mecánica del procedimiento: Una corriente eléctrica se pasa a través del gel y el RNA se mueve lejos del electrodo negativo. La sensibilidad del método es muy elevada por ejemplo.000pb presente en el genoma humano (1 parte en 3 millones) puede ser detectada por este método a partir de 10μg de DNA geonómico. una secuencia única de 1. quedando libres y expuestas las bases nitrogenadas. la distancia movida depende del tamaño del fragmento del RNA ya que los genes son de diversos tamaños. La transferencia se realiza tras la desnaturalización del DNA o RNA. revelando su posición por autorradiografía de la membrana. que hibridan con la secuencia complementaria.Universidad Nacional de Trujillo Facultad de Medicina Recordemos que la electroforesis es una técnica analítica de separación que se fundamenta en la cinética. caracterización. a través de una matriz o soporte reticulado como resultado de la acción de un campo eléctrico. De esta manera puede identificarse un fragmento específico de DNA o RNA entre toda la población de estructuras separadas por electroforesis y transferidas a la membrana. pero éstas últimas presentan varias ventajas por lo que su uso es más extendido: tienen una mejor consistencia (las de nitrocelulosa son bastante frágiles y pueden desmenuzarse con la SEMINARIO: TÉCNICAS MOLECULARES DEL ADN 29 . de esta manera podemos separar a los RNAm por sus tamaños. cuantificación (por comparación con controles) así como preparación y purificación (por extracción de bandas desde el gel) que son los parámetros en los que se basa la utilidad del northen blot para de moléculas y fragmentos de RNA. TRANSFERENCIA A MEMBRANA Las moléculas de DNA o RNA separadas en los geles de agarosa pueden ser transferidas a membranas de nitrocelulosa o de nylon. la unión a la membrana ocurre a través del esqueleto azúcar-fosfato de la molécula de DNA o RNA. Las membranas de nitrocelulosa dan mejor resolución que las de nylon. Esto permite localizar e identificar secuencias específicas en los fragmentos transferidos. control de pureza.

la membrana se introduce en una bolsa de plástico hermética que contiene la disolución con la sonda.).Universidad Nacional de Trujillo Facultad de Medicina manipulación) y poseen mayor capacidad de unión de DNA. para evitar que al añadir la sonda. como ficoll (400kDa). Una vez en la membrana. el DNA se fija a ella mediante calentamiento a 80°C o iluminación con radiación UV al igual que en el Western Blot. La desnaturalización de los fragmentos de DNA. las cadenas de DNA desnaturalizadas no deben ser muy largas para que la transferencia sea efectiva. el tiempo de transferencia depende del grosor del gel. por electroforesis (electrotransferencia). timo de ternera. aunque los dos últimos sistemas necesitan dispositivos específicos. ésta es una inespecíficamente a la membrana y produzca un fondo en el revelado. La formación de las estructuras híbridas (heterodúplex) entre la sonda y la secuencia complementaria buscada es muy dependiente de las condiciones experimentales (particularmente de la temperatura). el segundo. esperma de salmón. del porcentaje de agarosa y del tamaño de los fragmentos de DNA. por centrifugación o por succión (mediante una bomba de vacío). previa a la transferencia. por lo que su uso es más restringido. además. se realiza introduciendo el gel en una disolución de NaOH que se neutraliza posteriormente. etc. polivinilpirrolidona (360kDa) o seroalbúmina bovina (66kDa). producen poca fluorescencia de fondo (fluorescencia inespecífica) al ser iluminadas con radiación UV. SEMINARIO: TÉCNICAS MOLECULARES DEL ADN 30 . pudiendo ser utilizadas para hibridaciones sucesivas. además de DNA heterogéneo de diversos orígenes (bacteriano. para realizar este bloqueo. utiliza hornos de hibridación. controlándose la temperatura por inmersión en un baño termostatizado. la membrana se sumerge en una disolución que contenga substancias de elevado peso molecular. introduciendo las membranas en botellas que contienen la disolución de la sonda. las regiones de la membrana no ocupadas por el DNA transferido deben bloquearse. la electrotransferencia se utiliza cuando la separación del DNA se ha realizado en geles de poliacrilamida (dado que el reticulado es más denso que el de la agarosa). lo que es muy útil para la detección de bandas de DNA. para realizarla se utilizan dos sistemas: en el primero. La transferencia puede realizarse por capilaridad.

La sonda marcada puede unirse de forma inespecífica y aumentar el ruido. las sondas moleculares se han preparado con nucleótidotrifosfatos (ATP. CTP. Las sondas marcadas con isótopos se visualizan mediante autorradiografía. SEMINARIO: TÉCNICAS MOLECULARES DEL ADN 31 . donde la energía radiactiva impresiona una película de rayos X. HIBRIDACIÓN Dentro de este proceso se pueden distinguir tres etapas bien marcadas:  Pre-hibridación o bloqueo La membrana une ácidos nucleicos. En ciertas aplicaciones se nota el uso de isótopos de energía intermedia o baja. se usan nucléotidos que contienen azufre-35 (35S) o tritio (3H). GTP. el marcado de sondas por métodos radiactivos no conlleva mayores riesgos y proporciona una alta sensibilidad a los ensayos. que contienen fósforo-32 (“P) en la posición alfa. dATP.Universidad Nacional de Trujillo Facultad de Medicina GENERACIÓN DE UNA SONDA MARCADA Tradicionalmente. dCTP. en general si las condiciones del laboratorio lo permiten y contando con personal entrenado para el uso de isótopos radiactivos. respectivamente. estos marcadores están incorporados en las bases del ADN. UTP o dTTP) radiactivos. dGTP.

APLICACIONES BÁSICAS Esta técnica se ha aplicado en estudios de la modulación de la síntesis de interleucina 6 en pacientes con artritis reumatoide SEMINARIO: TÉCNICAS MOLECULARES DEL ADN 32 . 3M NaCl.  La solución de hibridación presente en su infraestructura: 5x SSC. esto se logra incubando la membrana en una solución que carece de sonda marcada y utilizando condiciones que minimizan la hibridación inespecífica. 50% Formamida . La solución de pre-hibridación contiene compuestos que se unen inespecíficamente a la membrana previniendo la unión de la sonda a la membrana. La membrana es expuesta a un film por tiempos variables . Condiciones:  Estas deben ser determinadas empíricamente.Universidad Nacional de Trujillo Facultad de Medicina La membrana es incubada con una solución de pre-hibridación a la temperatura de hibridación. excepto a su hebra complementaria. 3.  La Temperatura debe ser optima para valga la redundancia optimizar la velocidad de la hibridación en presencia de formamida: 15-20 ºC bajo el Tm  Lavados Para remover la sonda que está unida en exceso de manera inespecífica pero poco complementaria.3M Citrato de Na). el film es revelado y analizado. estrictez. 5% Denhardt  DNA heterólogo (ssDNA espermio de salmón). 1% SDS. inmovilizada en la membrana. una medida de la probabilidad de separar dos hebras de ácidos nucleicos.  Hibridación La sonda marcada se aparea en solución con su hebra complementaria. 0. VISUALIZACIÓN El RNA puede ser visualizado capturando la radiación ionizante por una emulsión fotográfica.  Los factores que afectan la hibridación de ácidos nucleicos.

de los hígados mutantes y de los normales se separan en bandas por electroforesis en gel. El tamaño de las moléculas de RNA de cada una de las bandas que se unen a las sonda se puede determinar usando como referencia la migración de moléculas de RNA de tamaño conocido (patrones de RNA) que se someten a electroforesis junto con la muestra. 4. alternativamente podría ocurrir que el RNA de la albúmina se detectara en cantidades muy reducidas. Primero las diferentes moléculas de RNA intacto. El papel se incuba con una solución que contiene una sonda de DNA marcado cuya secuencia corresponde en parte a la cadena molde que produce el RNAm de la albúmina. Entonces. para que las moléculas de RNA sean accesibles a las ondas de DNA se hace una replica del patrón de bandas de RNA del gel con la transferencia de las moléculas fraccionadas de RNA a una hoja de nitrocelulosa o de papel de nailon. Por citar un caso: para analizar los RNA que codifican la albúmina con una fibra de DNA. En este caso el gen transferido podría volverse a estudiar con sondas de DNA masa selectivas que revelasen que zona de RNA esta ausente. Las moléculas de RNA que se hibridan en el papel con la sonda de DNA marcada (por ser complementarias aparte de la secuencia normal del gen de la albúmina) se colocan detectando la sonda unida mediante autoradiografía o métodos químicos. El RNA de la albúmina mutante también podría ser anormalmente corto y desplazarse a través del gel muy rápidamente. VENTAJAS Y DESVENTAJAS  VENTAJAS SEMINARIO: TÉCNICAS MOLECULARES DEL ADN 33 . Así se puede descubrir que las células hepáticas del ratón afectado fabrican albúmina de tamaño normal y en cantidades normales.Universidad Nacional de Trujillo Facultad de Medicina En el análisis de expresión de receptores que participan en la síntesis de moléculas en cultivos celulares En análisis de mutaciones y alteraciones del RNAm de enzimas En la regulación de la expresión génica de marcadores moleculares de células leucémicas humanas y moléculas del reconocimiento inmunológico.

uprm.cl/gmunoz/genweb/genetica/frame/textos/4_2enzim_restric.ar/medline/2005/09/la_molecula_de_la_vida.com. TEMA 1: ENZIMAS DE RESTRICCIÓN Enzimas de restricción http://www. Así.ucv. Por ejemplo. tales como RTPCR.ar/medline/archives/cat_adn. RNAs libres y las técnicas son esenciales. análisis del arsenal del gen y análisis de la protección del nucleasa. Proporciona una comparación relativa directa de la abundancia del mensaje entre las muestras en una sola membrana (hebra). http://www. no considerándose adecuada para estudios de rutina de una población grande. incluso una sola hendidura en el 20% de moléculas de la blanco de 4 KB disminuirá la señal vuelta por el 20%.html.dialogica.edu/biology/cursos/biologiageneral/EnzimasDNA.Universidad Nacional de Trujillo Facultad de Medicina Es un método estándar que sirve para la detección y la cuantificación de los niveles del RNAm a pesar del advenimiento de técnicas de gran alcance.php) http://www. Es el método preferido para determinar el tamaño de la trascripción y para detectar transcripciones alternativamente empalmadas. los reactivos.  DESVENTAJAS Una de las primeras limitaciones que podemos encontrar en este proceso estriba en que si las muestras del RNA han sido degradadas leve y uniformemente. También tenemos que esta técnica sensible pero sumamente laboriosa y costosa.htm http://ejb.htm SEMINARIO: TÉCNICAS MOLECULARES DEL ADN 34 .dialogica. la calidad de los datos y la capacidad de cuantificar la expresión se compromete seriamente.com.

net/ciencia/Article5216. http://www. Editorial Reverte S.urv.arizona.Universidad Nacional de Trujillo Facultad de Medicina http://aportes.. España Transcriptasa http://danival. & Gamba G.iespalomeras.html http://www.html http://www. Rev Invest Clin. 1979.A.A. (1996). Universidad de Zaragoza .edu/human Mas Eva. Revista Acuatic No.html http://allnatural. Microbiología cuarta edición.net/manipulacion-adn/tecnicas-ingenieria. 15 Fundamento de la reacción en cadena de la Polimerasa.html Adn Polimerasa http://www.quimica. html TEMA 2: PCR (Polymerase Chain Reaction) Bobadilla N. Reacción en cadena de la polimerasa.com/definition/ADN-polimerasa/Spanish http://laguna. 1999. Biología molecular en medicina.unam. Poza Julio.babylon.php http://allnatural.org/600%20microbio/7400notasvir/algunos/vir_algunos_retroviru. Madrid – España.html ADN Ligasa http://genemol.es/~w3siiq/DALUMNES/97/siiq39/Endo.educ. 48. TEMA 3: SOUTHERN BLOT SEMINARIO: TÉCNICAS MOLECULARES DEL ADN 35 .ar/biologia/nucleo-teorico/influencia-de-las-tic/tecnologiadel-adn-recombinante/como_cortar_y_pegar_el_adn_tij. 401-6.iespalomeras. Ciriza Jesús 2001.electronicafacil.html Lubert Stryer.Harley Johon P.fmedic. Bioquímica.biologia.org/biomolespa/Enzimas/las-ligasas. V.mx/~evazquez/0403/dna%20polimerasa.net/manipulacion-adn/tecnicas-ingenieria. Editorial MacGraw Hill.España Prescott Lasing M.

SEMINARIO: TÉCNICAS MOLECULARES DEL ADN 36 . Bruck Biología de los Microorgarnismos 10º edición. 2006. Inmunología 4º edición. Madrid – España. Madrid – España.php? option=com_content&task=view&id=55&Itemid=10 http://mail. David Burnett.htm G:\napo\Desarrollo teórico de temas. John Crocher.htm http://criminalistic. Michael T.fq. Madigan.uy/~microbio/ABMM/HerraMBas1. Jonathan Brostoff. John M.16.genome. Editorial Pearson Edicacion.htm http://caibco.org/index.ucv.ppt#609. Ivan Roitt. Barcelona –España. Northern y Western Blot Biología. Editorial Harcourt Brace.Las sondas son fragmentos conocidos marcados TEMA 4: NORTHERN BLOT Http: //www.gov. La Ciencia del Diagnostico del Laboratorio 2º edición. 2005. 1997. Editorial Mc Grau-Hill.ve/caibco/CAIBCO/Vitae/VitaeDos/Articulos/MedicinaMol ecular/microbio.edu.Universidad Nacional de Trujillo Facultad de Medicina G:\napo\¿Cómo estudiar la expresión de diversos genes Southern. Martinko.