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PRCTICA N 12

SEPARACIN E IDENTIFICACIN DE UNA MEZCLA DE


AMINOCIDOS MEDIANTE CROMATOGRAFA EN CAPA FINA
Fundamento
La separacin de aminocidos por cromatografa en capa fina puede
llevarse a cabo empleando diversos tipos de fases estacionarias en la
modalidad de cromatografa de adsorcin. El gel de slice es probablemente la
fase estacionaria con la que mejores resultados se obtienen.
En esta prctica llevaremos a cabo la separacin de tres aminocidos,
fenilalanina, -alanina y cido asprtico, empleando gel de slice como fase
estacionaria y una mezcla de propanol/NH 3 como fase mvil.

NH2
CH2 CH

H2N
COOH

CH2

CH2 COOH

Beta-Alanina

Fenil-Alanina

HOOC

CH2

CH

COOH

NH2
cido asprtico

En este caso, y a continuacin del desarrollo cromatogrfico es precisa


una etapa de revelado, ya que los analitos son incoloros. En dicha etapa se
utiliza la ninhidrina como agente de revelado, la cual forma con los
aminocidos un derivado de color azul-violceo, de acuerdo con la reaccin:

Reaccin
Reactivos y disoluciones necesarias
- Disoluciones patrn de 1 mg.ml-1 de cada uno de los aminocidos a separar,
en etanol del 96% (v/v), siendo a su vez 0.5 M en HCl.
- Fase mvil: n-propanol : NH3 30 % (7 : 3, v/v).
- Disolucin de revelado: Ninhidrina al 0.3 % (p/v) en alcohol n-butlico con
cido actico al 3 % (v/v).
- Disolucin problema: Disolucin que puede contener uno o varios de los
aminocidos seleccionados.
Instrumentacin y material necesarios
- Cromatoplacas comerciales de gel de slice de 0.2 mm de espesor y 10 cm
de longitud.
- Cmara de desarrollo.
- Pulverizador para lquido de revelado.
- Estufa termostatada a 110 C.
- Capilares de vidrio.
Procedimiento operatorio
Introducir la fase mvil en la cmara de desarrollo, de forma que
alcance un nivel de 1 cm aproximadamente, y tapar para que toda la
atmsfera interior se sature del eluyente. Cortar una placa cromatogrfica, con
unas dimensiones aproximadas de 5x10 cm.

Con ayuda de una regla y un lpiz, trazar muy suavemente sobre la


cromatoplaca, una lnea horizontal a aproximadamente 2 cm del borde inferior.
Depositar de forma espaciada entre 5 y 10 L de cada una de las disoluciones
patrn de aminocidos, as como la del problema, sobre la lnea anterior,
siguiendo las indicaciones del profesor/a. Se deber evitar que las manchas
se extiendan excesivamente (no ms de 0.5 cm de dimetro).
Dejar secar la placa entre 15 y 20 minutos, con objeto de que el cido
clorhdrico se evapore totalmente.
Introducir la placa en la cmara de desarrollo, cerrar la cubeta y
esperar hasta que el lquido eluyente (fase mvil) suba hasta las proximidades
del borde superior (aprox. 90-120 minutos). Sacar la placa y marcar con
cuidado la posicin que ha alcanzado el frente de disolvente. Secar la placa
en estufa a 110 C durante unos 10 minutos. A continuacin, pulverizar sobre
ella la disolucin de ninhidrina, e introducirla de nuevo en la estufa durante
otros 10 minutos. Al cabo de ese tiempo, debern hacerse claramente visibles
las manchas correspondientes a cada uno de los aminocidos.
Medir los valores de Rf de cada uno de los aminocidos e identificar los
que estn presentes en la disolucin problema.

Resultados

Dibujar la placa cromatogrfica con las manchas correspondientes a los


componentes separados.

Identificar los componentes de la muestra problema.

Observaciones

V B

Nota.- Como complemento de esta prctica y mientras tiene lugar el desarrollo


cromatogrfico, se puede llevar a cabo simultneamente una experiencia
sobre separacin de colorantes Por Ej. Una mezcla de Rojo Neutro, Rojo de
metilo, Naranja de metilo, Prpura de bromocresol y Azul de bromofenol-. Para
ello, se pueden emplear disoluciones de colorantes suministrados por el

profesor/a, o bien, utilizar las mezclas de colorantes que se encuentran en los


rotuladores. En este caso el propio rotulador sirve como medio para aplicar la
muestra sobre la placa cromatogrfica. Como es evidente, tanto en un caso
como en otro, no ser necesaria la etapa de revelado.
Como fase estacionaria emplearemos gel de slice, y como fase mvil
una mezcla de n-butanol: etanol:amoniaco en proporcin 60:20:20.