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Introduccin a la microscopa ptica

Seminarios y Talleres de la asignatura Citologa e Histologa


(curso 2015 - 2016)

Longitudes
tomo
100 pm
[1 ]

Fosfolpido
2,5 nm

Clula
animal
25 m

Bacteria
1 m

Clula
vegetal
100 m

Membrana
plasmtica
5 nm

m
10-10

10-9

10-8

10-7

10-6

10-5

10-4

10-3

10-9 m

10-6 m

10-3 m

1 nanmetro

1 micrmetro

1 milmetro

10-2

Longitudes
Las dimensiones menores que 100 am no estn
confirmados experimentalmente

Up quark
1 am

Quarks
100 am

Ncleo de tomo
10 fm

m
10-19

10-18

10-17

10-16

10-15

10-14

10-13

10-12

10-18 m

10-15 m

10-12 m

attmetro

femtmetro

picmetro

10-11

Longitudes
Longitud de Planck 1,6 x 10-35 m
(la longitud ms pequea que tiene sentido
en nuestro universo)

Neutrino
1 ym

m
10-24

10-23

10-22

10-21

10-24 m

10-21 m

yoctmetro

zeptmetro

10-20

Sitios web recomendados


Molecular Expressions Science, Optics & You

Powers of Ten
(Secret Worlds: The Universe Within)
http://micro.magnet.fsu.edu/primer/java/scienceopticsu/powersof10/index.html

Biovisions at Harvard University

The Inner Life of the Cell


http://multimedia.mcb.harvard.edu/anim_innerlife.html

(con explicaciones)

http://www.studiodaily.com/main/technique/tprojects/6850.html

(con msica)

Primera lente de la historia


Lente de Nimrud
750 - 710 ante cristo
fabricada de un cristal natural de montaa
descubierta por el arquelogo Austen Layard
en el pueblo Nimrud (norte de Iraq)
poca capacidad de aumentar imgenes
(posiblemente usado con fines ornamentales)

Primer microscopio
griego:
(micron) = pequeo
(skopein) = examinar, observar

Microscopio con una lente bi-convexa (ocular),


plano-convexa (objetivo) y un tubo extensible
aumentos totales 3 - 10

Microscopio ptico
produce imgenes aumentadas
de objetos pequeos a travs de
un sistema de lentes pticas
utilizando la luz
microscopio de luz

Tipos de microscopa
Microscopa de campo claro (= microscopia ptica)
Microscopa de campo oscuro
Microscopa de contraste de fases
Microscopa de fluorescencia
Microscopa electrnica
Microscopa de polarizacin
Microscopa confocal
Microscopa de excitacin de dos (tres) fotones
Microscopa de contraste de interferencia diferencial
Microscopa de reflexin de interferencia
etc..

Microscopa ptica
Microscopios simples

Microscopios compuestos

un sistema de lentes

ms que un sistema de lentes

Ocular
LUZ
Tubo

Ocular

Objetivo

El tubo tiene que tener una longitud exacta que est


determinada por el sistema ptico (objetivo/ocular)

Microscopio moderno
Tubo Binocular

Brazo

Pinza
Tornillo Macromtrico

Oculares

Revolver Portaobjetivos
Objetivos
Platina
Condensador

Tornillo Micromtrico

Fuente de iluminacin

Pie

Microscopios pticos modernos

Hay diferentes tipos de iluminacin de la muestra:


- transmisin (transmitted-light microscope)
- invertido
(inverted microscope)
- reflexin
(reflected-light microscope)
Las imgenes son de color
El aumento total est definido por la relacin:
aumento objetivo x aumento ocular
Aumento mximo de este tipo de microscopio: 2000x

Microscopio invertido
Utilizado sobre todo
en cultivo celular
(clulas = objetos transparentes
microscopio de transmisin)

Fuente de iluminacin
arriba

Objetivos abajo

Microscopio de reflexin
Utilizado tambin en investigacin criminal,
mineraloga, ciencia de los materiales
utiliza para la observacin la luz que la
muestra refleja haca arriba (funciona solo
con objetos no transparentes, es decir,
muestras opacas)
otro nombre:

lupa binocular
(ingles: stereo microscope)
Objetivos arriba

Fuente de iluminacin
arriba

Qu es la luz?

Ondas electromagnticas
Los movimientos ondulatorios tienen su origen en una vibracin.
Las ondas longitudinales se originan con la vibracin de materia y necesitan un
medio de materia para propagarse (en el espacio/vaco no hay ondas longitudinales).
Ejemplo:
Si vibran las cuerdas vocales se produce un sonido (propagado por el aire).
Si vibra el fondo marino se produce un tsunami (propagado por el agua).
Las ondas electromagnticas se originan con la vibracin de una carga elctrica y
NO necesitan un medio para propagarse (la luz se propaga por el espacio = vaco).
Ejemplos:
Si vibra un electrn se produce alguna forma de radiacin
(= onda electromagntica).

Ondas electromagnticas
Plano de
vibracin
Longitud de onda
Longitud de onda
Amplitud

Direccin de Propagacin

La luz es una onda electromagntica que se propaga en lnea recta, lneas


que se llaman rayos. El plano de vibracin es perpendicular a la direccin de
propagacin pero su plano puede variar (360).

Espectro electromagntico

m
10-14

10-12

10-10

10-8

10-6

luz UV

rayos csmicos
rayos gamma

10-4

10-2

10 0

luz IR

10 2

10 4

ondas radio
microondas

rayos X

luz visible

Caractersticas especiales
Experimento para
demostrar la
viabilidad del
modelo clsico de
la luz
(puede comportarse
como un rayo que
se propaga en una
lnea recta y que
sufre refraccin y
reflexin cuando
cambia de un medio
a otro con una
densidad ptica
diferente)

aire
reflexin

cristal
(ms denso)

refraccin

Caractersticas especiales
Las propiedades de la luz como onda electromagntica son imprescindibles para
explicar algunas caractersticas pticas de los microscopios que dependen de la:

difraccin

doble difraccin + interferencia

Interferencia de ondas electromagnticas


Dos ondas sin retraso de fase

Interferencia constructiva

max

max

Dos ondas con retraso de fase

Interferencia destructiva

min

max

10

Aberracin cromtica
Dispersin de la luz blanca por un prisma

La luz blanca es la suma de todos los colores de los que cada color tiene una longitud
de onda especfica. El ngulo de refraccin es distinto para los diferentes colores, lo
que produce la separacin de los colores al pasar por un prisma de cristal

Aberracin cromtica
diferentes
focos

Lente esfrica
Distintas longitudes de onda (= distintos colores) tienen diferentes focos
por su refraccin diferente imagen borrosa
se corrige mediante lentes especiales en los objetivos apocromticos

11

Tipos de objetivos
Objetivo normal

Objetivo de Inmersin

medio entre objetivo y muestra


aire

medio entre objetivo y muestra


aceite

Indicaciones en el objetivo

Fabricante
Correccin campo plano
Magnificacin
Propiedades pticas
especiales
Longitud del tubo
Espesor necesario del
cubreobjetos

Rosca
Correccin apocromtica
Apertura numrica
Inmersin de aceite
Distancia al cubreobjetos
(working distance)
Cdigo de color (magnificacin)
Limitador de retrocesin

12

Poder de resolucin
Capacidad de un objetivo de visualizar
dos puntos por separado
(expresado como la distancia d a partir de la cual
dos puntos producen dos imgenes distintas = limite de resolucin)

Poder de resolucin
Matemticamente el lmite de resolucin se puede describir como:

d=

0,61
AN

0,61
N sin

d = lmite de resolucin ( valores ms pequeos = ms poder de resolucin !)


= longitud de onda de la luz
N = ndice de refraccin del medio entre la lente frontal del
objetivo y la preparacin (en el caso de aire, N = 1)
= ngulo de apertura
El poder de resolucin de un objetivo es su capacidad (= poder) de visualizar
dos objetos muy cercanas (= con un d pequeo) como dos objetos separados
(= resolverlos) en una imagen. Por lo tanto, el lmite de resolucin y el poder
de resolucin tienen una relacin inversa porque ms pequeo que sea el valor
numrico del lmite de resolucin ms grande es el poder de resolucin.

13

Apertura numrica
La apertura numrica es definida como:

AN = N sin
N = ndice de refraccin del medio entre la lente frontal del
objetivo y la preparacin (N = 1 en el caso de aire)
= ngulo de apertura

ngulo de apertura

Lente frontal del objetivo


ngulo de apertura ()
Si el ngulo de apertura es ms grande
el objetivo capta ms informacin
proviniendo de la muestra.
Este ngulo depende de la construccin
del objetivo y, por lo tanto, es una
caracterstica (constante) del mismo

Muestra

14

Resolucin e ndice de refraccin


Aire

Aceite de inmersin

N=1

N=1,52
(igual al ndice de refraccin del cristal
no hay refraccin)
El objetivo puede captar ms de la luz
(= ms informacin) emitida por la muestra

Objetivo

Medio
entre objetivo y cubre
Muestra
entre porta y cubre

Poder de resolucin
Mtodos para aumentar el poder de resolucin
aumentando el ngulo de apertura
nica opcin: utilizando un objetivo que por su construccin tiene una
apertura numrica ms alta

reduciendo la longitud de onda de la luz


por ejemplo, utilizando luz ultravioleta ( = 350 nm) en lugar de luz
blanca (por definicin = 550 nm)

aumentando el ndice de refraccin del medio


(delante de la lente frontal del objetivo)
por ejemplo, utilizando un objetivo que est construido para utilizar
aceite de inmersin

15

Poder de resolucin
Mtodos para aumentar el poder de resolucin:

Un incremento en el aumento del objetivo aumentar


tambin la resolucin?

NO
magnificara ms la imagen pero
no aadira ms detalles (= informacin)

Poder de resolucin
Esta observacin de la diatomea Stauroneis phoeniceteron (alga unicelular) se
hizo con dos objetivos diferentes. Ambos tenan los mismos aumentos pero un
poder de resolucin distinto (apertura numrica 0,85 y 1,40 respectivamente).

Poder de resolucin BAJO


(no se ven los detalles)

Poder de resolucin ALTO


(todos los detalles visibles)

16

Sistemas de lentes
Un microscopio de campo claro

Oculares

de tipo transmisin
tiene tres sistemas de lentes
(el de tipo reflexin solo
tiene dos sistemas de lentes;
la lente simple delante de la fuente
de iluminacin no se considera
como un sistema de lentes)

Objetivos

Condensador

Fuente de iluminacin

Condensador
Lente frontal del objetivo

Plano del objeto (muestra)

Sistema de lentes del condensador


(enfocan la luz en el punto de observacin)

Diafragma iris
Fuente de iluminacin

17

El condensador puede influir en el poder de resolucin de


la imagen?

Apertura de iluminacin
Diafragma cerrado

Diafragma abierto
Lente frontal del objetivo
Aunque la apertura numrica
del objetivo sea alta, la cantidad
de luz que se utiliza en la
prctica para formar la imagen
depende tambin de la
apertura del diafragma iris
del condensador
(apertura de iluminacin)

Lente Condensador
Fuente de iluminacin

Fuente de iluminacin

Diafragma iris

18

Apertura de iluminacin resolucin


Diafragma cerrado

Diafragma abierto

(apertura de iluminacin < apertura numrica)

(apertura de iluminacin = apertura numrica)

Mucho contraste pero poca resolucin

Mucha resolucin pero poco contraste


(ajuste preferible)

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Microscopa de contraste de fases

Seminarios y Talleres de la asignatura Citologa e Histologa


(curso 2015-2016)

Observacin vital
La observacin de un organismo vivo (observacin vital) se puede llevar
a cabo con distintos tipos de microscopios. Microscopio de

campo claro

campo oscuro

luz polarizada

(caracterstico: fondo claro,


se pueden ver los colores)

(caracterstico: fondo negro,

(uso limitado a pocas

estructuras parecen

ocasiones)

iluminadas)

Observacin vital

contraste de interferencia diferencial

contraste de fases

los objetivos para este tipo de


microscopio llevan las letras:

los objetivos para este tipo de


microscopio llevan las letras:

DIC

Ph o PH

a veces tambin NIC

a veces tambin PL, NM o NH

(caracterstico: fondo claro, muy alta resolucin,


imagen parece plano con un relieve)

bordes de las clulas tienen un halo)

(caracterstico: fondo claro hasta gris,

Observacin vital
Clulas vivas normalmente
ni tienen color ni estructuras que disminuyen la intensidad de la luz
son transparentes
La tincin (artificial) no es una opcin en el cultivo celular, porque matara a las clulas

El retraso en la fase de la luz (que se genera cuando la luz pasa por las clulas) se utiliza
mediante difraccin e interferencia para aumentar el contraste

Interacciones de la luz con objetos


objeto de amplitud

Objeto que
disminuye la intensidad
de la luz (= su amplitud A)

Luz pasando por


un medio homogneo

Objeto que
cambia la velocidad
de la luz (= su fase )
objeto de fase transparente, densidad alta, N = alto

Interacciones de la luz con clulas

Clula
(vista del lado)

Las diferencias de densidad del medio que atraviesa la luz


provoca las diferencias en la fase (1 y 2) de los distintos haces de luz

Luz directa luz muestra


Luz directa

+ Luz muestra
(= luz difractada)

Plano de la imagen primaria


(de la muestra)

Foco de la luz directa


(del condensador)
Lente frontal del objetivo
Plano de la muestra
Lente del condensador
Fuente de iluminacin

Retraso de fase
La fase de la luz directa y de la luz muestra tiene una diferencia de
(es la diferencia habitual provocada por las clulas en un cultivo celular)

Onda luz directa

Onda luz muestra

Diferencia de fase
provocada por
pasar por la muestra

(la luz de la muestra por ser difractada es menos intensa que la luz directa)

Retraso de fase
En este caso la interferencia de ambas ondas no causa ningn cambio en
la amplitud sino slo un retraso en la fase, algo que no es visible

Onda luz directa

Onda luz resultante


(por interferencia)

Onda luz muestra

Retraso de fase
(luz resultante)
Amplitud igual

Medidas necesarias para convertir el retraso de


fase en un cambio de amplitud visible
Un cambio adicional de de la luz directa permitira la interferencia
destructiva (aunque el cambio en la amplitud sera pequeo, porque la luz difractada

Onda luz directa

Onda resultante
luz de interferencia

Onda luz muestra

Cambio de amplitud (luz de interferencia)


que proviene de la muestra es poco intensa comparada con la luz directa)

Medidas necesarias para convertir el retraso de


fase en un cambio de amplitud visible
La atenuacin de la intensidad de la luz directa no modificar el valor
absoluto del cambio de amplitud sino el valor porcentual de ese cambio

Onda luz directa

Onda resultante
luz de interferencia

Onda luz muestra

Cambio de amplitud (luz de interferencia)

(pero bajo estas condiciones la poca luz formara slo una imagen muy oscura)

Medidas necesarias para convertir el retraso de


fase en un cambio de amplitud visible
Un aumento de la intensidad de la luz general (fuente de iluminacin) aumentar la
intensidad de la luz directa y difractada incrementando as el cambio absoluto de
amplitud

Onda luz directa

Onda resultante
luz de interferencia
Onda luz muestra

Cambio de amplitud (luz de interferencia)


(el retraso de fase se ha convertido finalmente en una disminucin de la amplitud)

Visualizacin del retraso de fase


Resumen de las necesidades para convertir el invisible retraso de fase
en una visible disminucin de la amplitud de luz de interferencia:
1) Desplazar la fase de la luz directa por un adicional
har que el retraso de fase entre luz directa y de muestra sea finalmente
, lo que permite la interferencia destructiva

2) Atenuar la amplitud de la luz directa ajustndola a la amplitud


de la luz muestra
har que la interferencia destructiva sea ms efectivo (mayor porcentaje de la
reduccin por interferencia)

Cmo se puede influir la luz directa sin cambiar a la vez la


luz difractada por la muestra?

Importante:
Los mencionados cambios 1) + 2) se tienen que aplicar a la luz
directa despus de haber pasado por el plano de la muestra, es
decir, cuando la luz directa y difractada ya han entrado en el
microscopio por la lente frontal del objetivo

Microscopio de contraste de fases


Ojo
Ocular

Objetivo
Anillo de fase
Plano de objeto
Lente del condensador
Diafragma anular

La luz directa pasa nicamente por el


anillo de fase (zona gris) que
aumenta el retraso de fase a un valor
total de y adems atena su
intensidad
El paso de la luz directa pasa por un
diafragma anular cuya nica funcin
es controlar mejor el paso de la luz
directa.

Diafragma de iris
Fuente de iluminacin

Microscopio de contraste de fases


Ojo
Ocular

Objetivo
Anillo de fase
Plano de objeto
Lente del condensador
Diafragma anular

Diafragma de iris

La separacin espacial de la luz directa y de la luz


difractada por la muestra permite la modulacin
especfica de la luz directa
La luz que pasa por un objeto de
fase pequeo sufre difraccin, lo
que provoca la propagacin
semiesfrica de la luz desde este
punto de la muestra. La parte de
esa luz que entra en el objetivo
pasa mayoritariamente por el
centro y por los lados del anillo
de fase (zona blanca) y,
consecuentemente no est
afectada por la modulacin que el
anillo de fase tiene sobre la luz
directa (que pasa exclusivamente
por l).

Fuente de iluminacin

Diafragma anular - anillo de fase


Diafragma anular (en
el condensador)
Anillo de fase (en el objetivo)

Alineacin diafragma anillo de fase


Campo claro

Contraste de fase

Contraste de fase

(diafragma y anillo mal ajustados)

(diafragma y anillo bien ajustados)

Alineacin diafragma anillo de fase

Ocular especial
Ocular especial

Ocular normal

Alineacin diafragma anillo de fase


Slo el diafragma anular se puede ajustar para alinear el sistema
diafragma anular anillo de fase
El anillo de fase est fijado dentro del objetivo

Anillo de fase

Diafragma
anular
(diafragma y anillo mal ajustados)

(diafragma y anillo bien ajustados)

En los microscopios invertidos modernos el diafragma anular no es ajustable sino fijo y


ya pre-centrado en estos microscopios no hace falta alinear los dos componentes.

10

Otros problemas y soluciones


La imagen sigue siendo mal aunque los componentes estn bien alineados o
se trata de un microscopio pre-centrado

Lente frontal del objetivo o (ms probablemente) la lente frontal del


condensador est sucia

(se ve luz difusa alrededor del diafragma anular)

(con lentes limpias no hay luz difusa)

Otros problemas y soluciones


La imagen sigue siendo de mala calidad aunque los componentes estn bien alineados
(o se trata de un microscopio pre-centrado) y las lentes estn limpias

El diafragma anular puesto no corresponde al objetivo en uso

(objetivo 40x con diafragma anular para 4x)

(objetivo 40x con diafragma anular para 40x)

11

Otros problemas y soluciones


El campo de observacin est oscuro aunque la fuente de iluminacin est encendida

El diafragma iris est tan cerrado que la luz no llega hasta la ranura del
diafragma anular

(con el diafragma muy cerrado la luz no puede pasar)

(con el diafragma ms abierto)

Otros problemas y soluciones


El campo de observacin est oscuro aunque la fuente de iluminacin est encendida
y el diafragma iris est abierto (vale para todo tipo de microscopio)

En un microscopio trinocular el paso de luz est dirigido al tubo que


conecta con la cmara aunque la cmara no est puesta

(paso de luz hacia el tubo para la cmara)

(paso de luz hacia los oculares)

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Microscopa de contraste de
interferencia diferencial

Seminarios y Talleres de la asignatura Citologa e Histologa


(curso 2015-2016)

Luz polarizada
la luz polarizada no
puede pasar
extincin / oscuridad

Polarizador (90)

la luz polarizada girada


puede pasar
el objeto parece iluminado

el objeto anistropo
gira el plano de la
luz polarizada

Polarizador (0)
objeto anistropo

Amiloplastos en un microscopio de polarizacin


Tpicamente, un microscopio de polarizacin tiene
dos polarizadores como indicado en el esquema
anterior.
Los amiloplastos son objetos anistropos y, por lo
tanto, capaz de girar el plano de la luz polarizada.
El fondo de la imagen obtenida parece oscuro
porque la luz polarizada no puede pasar el segundo
polarizador si est girado 90 frente al primero.
Los amiloplastos giran el plano de la luz polarizada
que pasa por ellos, lo que provoca que esta luz
puede atravesar el segundo polarizador. Se ve una
imagen muy caracterstica en la que los amiloplastos
iluminados tienen un aspecto parecido al de la

Cruz de Malta

Sustancias anistropas (birrefringentes)


Anisotropa = Las propiedades fsicas de una sustancia dependen de la direccin
de observacin. Una de las consecuencias de la anisotropa en
objetos transparentes es la birrefringencia.
Calcita [cristal de Ca CO3]

La escritura se puede ver dos veces


birrefringencia

Sustancias anistropas (birrefringentes)


La estructura cristalina de la calcita es ordenada pero diferente en cada uno de los
dos ejes indicados, lo que proporciona propiedades fsicas diferentes segn la
direccin.

Birrefringencia
objeto anistropo
luz no polarizada

rayo ordinario
rayo
extraordinario
luz polarizada
Si un rayo de luz atraviesa un objeto anistropo transparente, se divide en dos rayos
el rayo ordinario y el rayo extraordinario
Ambos rayos de luz son polarizados y sus planos de vibracin se encuentran
perpendicular uno al otro (en un objeto anistropo existen solo dos posibles planos
de vibracin). Adems, el rayo extraordinario tiene un mayor ndice de refraccin que
el ordinario.

Microscopa de contraste de interferencia diferencial

luz polarizada
0
luz no polarizada

luz polarizada
45

luz polarizada
0
luz polarizada
135

muestra

0,2 m

polarizador
Condensador
Prisma de Wollaston

polarizador
Objetivo
Prisma de Nomarski

luz polarizada
90

luz polarizada 90
+ retraso de fase

punto de unificacin
+ interferencia

Microscopa de contraste de interferencia diferencial


El primer polarizador se utiliza para controlar mejor el plano de vibracin de la luz.
El prisma de Wollaston consiste en una sustancia anistropa que divide el rayo
inicial en dos rayos de luz polarizada con un plano de vibracin perpendicular uno
con respecto al otro.
El condensador enfoca ambos rayos pero de una manera que NO pasan
exactamente por el mismo punto de la muestra sino con una distancia de 0,2 m
entre si. Por este motivo, despus de pasar por la muestra los dos rayos tienen un
retraso de fase entre si, cuya magnitud depende de las diferencias de densidad
ptica que cada uno ha encontrado en su camino (por ejemplo, un rayo ha pasado
por una clula y el otro justo al lado).
El segundo prisma unifica los dos rayos y posibilita la interferencia entre ellos. El
prisma de Nomarski tiene la ventaja de que puede alargar el camino de uno de los
rayos manualmente de forma no escalada para que la interferencia destructiva sea
ms efectiva y el contraste resultante mejor (en esencia es el mismo principio del
anillo de fase en la microscopa de contraste de fases).
El segundo polarizador elimina toda la luz natural que haya podido entrar en el
microscopio de forma no deseada por la zona de la muestra.

Puntos importantes
Ambos rayos, el ordinario y el extraordinario, producen cada uno una imagen
completa en la microscopia de contraste de interferencia diferencial. Cada una de
estas imgenes es de tipo campo claro (pero con luz polarizada) y, por lo tanto,
en ninguna de ellas por separado se pueden ver los objetos transparentes por la
falta de contraste. En el punto de su unificacin (= en el segundo prisma)
interfieren ambas imgenes completas y el retraso de fase entre ellas se convierte
en una diferencia de amplitud (= imagen con contraste).

caracterstico: fondo claro; poder de


resolucin muy alto; imagen parece tener un
relieve del objeto, aunque este relieve NO
corresponde a las caractersticas reales de la
superficie del objeto es un relieve virtual
formado por las diferencias en la densidad
del objeto observado

Microscopa de fluorescencia

Seminarios y Talleres de la asignatura Citologa e Histologa


(curso 2015-2016)

Fluorescencia
Excitacin = Elevacin de un electrn a un nivel energtico superior
requiere energa (por ejemplo, una onda electromagntica)

Emisin

= Descenso de un electrn a un nivel energtico inferior


libera energa (por ejemplo, una onda electromagntica;
Fosforescencia = emisin retrasada)
Excitacin

Emisin

Fluorescencia
Stokes Shift = entre la longitud de onda de excitacin y de emisin
hay una diferencia
(parte de la energa recuperada se convierte en calor)

Fluorescencia
Fluorocromos = molculas que absorben luz de una determinada
longitud de onda y parte de ella la emiten con
una longitud de onda mayor

ENERGA

Fluorescena (verde)

Tetrametilrodamina (roja)

Fluorescencia
Para la microscopia de fluorescencia se necesitan sistemas de electrones
conjugados porque son fcilmente excitables con la baja energa de la luz
visible. Estos sistemas existen, por ejemplo, en compuestos orgnicos con
anillos aromticos (= estructuras cclicos).
Ejemplos de familias de fluorocromos tpicos:
FITC (del ingls fluorescein isothiocyanate) - isotiocianato de fluorescena
TMRM (del ingls tetramethylrhodamine methylester) ster de la
tetrametilrodamina
TMRM no es citotxico y se puede utilizar para el seguimiento de procesos
celulares a tiempo real (ingls live cell imaging).

De dnde vienen los fluorocromos en la


muestra?

Tipos de fluorescencia
Fluorescencia Primaria
Autofluorescencia la muestra
ya contiene fluorocromos
(solo tejidos y clulas vegetales)
Tejido vegetal con
fluorocromos naturales

Fluorescencia Secundaria
marcaje selectivo de estructuras
celulares con compuestos
qumicos que son fluorescentes y
que adems se unen a estructuras
determinadas (normalmente
orgnulos) por afinidad qumica

Marcaje de las
mitocondrias de una raz
con el compuesto
fluorescente DIOC

Tipos de fluorescencia
Inmunofluorescencia
Marcaje muy selectivo de protenas
concretas con anticuerpos a los que se
ha conjugado un fluorocromo
(es una forma especial de la inmunohistoqumica;
las clulas mueren en el proceso de marcaje)

Microtbulos marcados
en verde con un anticuerpo
conjugado al fluorocromo FITC

GFP (green fluorescent protein)


IFP (infra-red fluorescent protein)
Marcaje muy selectivo a nivel gentico
con la secuencia codificante de una
protena fluorescente
(la protena de inters se fusiona geneticamente
con GFP o IFP en la clula que despus expresa la
protena fusionada; permite la observacin vital!)

Expresin de microtbulos
fusionados con la protena verde
GFP (fusin del gen de GFP con
el gen de la alfa-tubulina en el
genoma de la clula)

Co-localizacin de protenas

protena marcada con un


anticuerpo con
fluorocromo
(emisin: luz roja)

protena marcada con un


anticuerpo con
fluorocromo
(emisin: luz verde)

prueba de la co-localizacin
de las dos protenas en el
mismo lugar celular
(solapando ambas imgenes
aparece el color amarillo)

Microscopa de fluorescencia
Visualizacin y Localizacin
de protenas que normalmente son invisibles con el microscopio
de campo claro
(para objetos que emitan luz la frmula del poder de resolucin no tiene validez!)

Identificacin
de protenas por el marcaje especfico
(en el caso de la inmunfluorescencia y del marcaje gentico con GFP: identificacin,
localizacin y prueba de existencia (= expresin) de una protena concreta en la
clula)

Microscopa de fluorescencia
Iluminacin
tipo transmisin

Iluminacin
tipo reflexin
(Epi-fluorescencia)

Objetivo

Plano de
foco
La iluminacin tipo
reflexin tiene la ventaja
de que la luz de excitacin
(la que no se quiere ver,
porque no aporta
Luz de excitacin
informacin sobre las
estructuras) no entra en el
objetivo

Microscopa de epifluorescencia

Espejo Dicroico
Fuente de
iluminacin

Objetivo

Fluorocromo

El espejo dicroico refleja luz de una determinada longitud de onda mientas deja
pasar luz de otras longitudes de onda (se utiliza aqu como un filtro para
bloquear la luz de excitacin y dejar pasar la luz de emisin del fluorocromo)

Out-of-focus light
Para eliminar la fluorescencia difusa/dispersa (out-of-focus light) se
puede aplicar un diafragma de campo
(lo que restringe la luz de excitacin a una zona pequea con la desventaja de reducir
mucho el campo de visin)

Out-of-focus
light
(es luz que emiten los fluorocromos
que se encuentran encima o abajo
del plano enfocado; por no estar
enfocados parecen borrosos)

Out-of-focus light
Aplicando un diafragma de campo solo se excitan los fluorocromos
en una zona que se ha elegido porque en en ella no hay fluorcromos
encima o abajo del plano de foco
(la imagen resultante es ms ntida pero tambin ms pequea)

Microscopa confocal
Detector

Exclusin de la fluorescencia dispersa


(out-of-focus light) del detector por el
orificio puntiforme (pinhole) del segundo
diafragma (diafragma arriba)

Fuente de iluminacin lser

Espejo
dicroico

(produce luz monocromtica)

La excitacin de la muestra de forma


puntual con la ayuda de un orificio
puntiforme (primer diafragma),
permite la coordinacin (= confocal)
del punto de foco de la muestra con
un segundo diafragma localizado
arriba

Plano del foco


de la muestra
Luz proveniente del foco
Out-of-focus light

Microscopa confocal

Qu problema nos trae la excitacin puntual de la muestra?

Microscopa confocal
Nunca existe una imagen completa de la muestra sino
slo la informacin de un nico punto
Para conseguir la informacin completa de la imagen la
excitacin puntual tiene que moverse sobre todos los puntos del
plano de foco (= escanear o barrer la muestra)

Microscopio confocal de barrido


(confocal laser scanning microscope, CLSM)

Microscopio confocal de barrido

Un segundo espejo
dicroico puede separar
luz de emisin de dos
fluorocromos distintos

Dos espejos de barrido


(scan mirror)
mueven el rayo de luz
sobre el plano de foco

Microscopa confocal

Aunque se escanea todo el plano de foco en ningn


momento se consigue la imagen completa sino slo
un acumulo de datos sobre los puntos escaneados
necesidad de un procesamiento electrnico de los
datos para recomponer la imagen (= ordenador)

10

Microscopa confocal
Fluorescencia
convencional

Fluorescencia
confocal
Embrin de Drosophila
en estado de gstrula
Teido: filamentos de
actina

Explicacin detallada: Alberts - Biologa molecular de la clula,


Cuarta Edicin, pgina 559, figura 9-19

Microscopa confocal
[Embrin de Drosophila
en estado de gstrula]

Esta muestra es ms gruesa que una clula del cultivo celular y, por
lo tanto, produce mucho ms out-of-focus light. La tcnica de la
microscopa confocal permite hacer un corte ptico muy fino, sin
cortar la muestra fsicamente.
En cualquier caso, un requisito esencial es que la muestra tiene que
ser transparente!
Como en toda la microscopa de fluorescencia solo se ve la luz
emitida por los fluorocromos, el fondo de la imagen siempre parece
oscuro. Los fluorocromos emiten luz de una determinada longitud de
onda (= color), que depende de las propiedades qumicas del
fluorocromo en uso.

11

Microscopa confocal 3D

El procesamiento digital de los datos abre la posibilidad de


recomponer no solo la imagen de un solo plano de foco sino de
varios planos creando as una imagen tridimensional de la muestra

Microscopa confocal 3D

Esta ampliacin de la microscopa confocal permite llevar acabo tareas difciles


como por ejemplo, crear un mapa de zonas determinadas en un rgano o tejido
utilizando anticuerpos contra protenas que son especficas para cada zona.
Limitacin de esta tcnica: el objeto de estudio tiene que ser transparente.

12

Cultivo Celular

Seminarios y Talleres de la asignatura Citologa e Histologa


(curso 2015-2016)

Cultivo de rganos
Es un cultivo tridimensional (cultivo 3D) de
un material biolgico en el que los diferentes
tejidos mantienen in vitro la misma
organizacin histolgica que tienen in vivo.
Este mtodo se utiliza sobre todo en la
ingeniera de tejidos (tissue engineering).
El aparataje para garantizar el bienestar de
las clulas es muy sofisticado bioreactor.
Tiene que mantener un flujo constante de
nutrientes y oxgeno en el interior del
rgano.

Vacanti mouse

Requiere el uso de un molde biocompatible y


biodegradable. Las clulas iniciales se
siembran dentro de este molde donde
crecen. Se diferencian con estmulos
especficos (p.ej., hormonas) controlados
por el ingeniero, por lo que tienen que ser
clulas no diferenciadas (= clulas madre).
Bioreactor para la ingeniera
de vlvulas cardiacas

Cultivo de Tejidos
Un fragmento de tejido (explante) es
colocado sobre una placa Petri a la cual se
adhiere y crece. El tamao mximo del tejido
est limitado por el alcance de la difusin
pasiva de gases y nutrientes a su interior
(< 1mm3).
El crecimiento celular slo ocurre en la
periferia. Existe migracin de clulas que
salen del explante.
Ventaja:
Co-cultivo de distintos tipos de clulas que
in vivo estn presentes en el tejido objeto de
estudio
Desventaja:
No puede realizarse un subcultivo, cada
experimento necesita un nuevo explante
(= ms trabajo + variabilidad experimental)
BMC Cardiovascular Disorders 2007, 7(1):13

Cultivo Celular
El cultivo celular es un cultivo
bidimensional (2D) de clulas
individuales del que se pueden hacer
subcultivos. Hay dos mtodos para
mantener las clulas en cultivo
dependiendo del tipo celular:

a)

a) en suspensin
clulas que no se adhieren al sustrato
(sobre todo de origen hematolgico)

b)
b) en monocapa
clulas que se adhieren al sustrato
(este tipo de clulas normalmente tiene
que adherirse para crecer y dividirse;
origen: tejidos slidos)

Cultivo Celular
Origen de las clulas
Proceden del tejido vivo

tomar muestra
de tejido

Ejemplos: sangre (linfocitos), rganos


discretos (cerebro, rin, hgado etc.) o
organismos enteros (embriones de
pollo)
Primer paso para obtener clulas de
tejidos slidos: la disgregacin
mecnica o enzimtica (tripsina,
colagenasa, dispasa) para generar
clulas individuales
romper la matriz extracelular

disgregracin

Las clulas no disgregadas son


eliminadas con un colador especial
(cell strainer; mallas de 40-100 m)

filtracin

Estados del Cultivo Celular


Cultivo
Primario

Cepa Celular

Lnea Celular Estable

Senescence
+
Cell Death

Culture Start

Cultivo Primario
El cultivo primario est formado por las clulas obtenidas directamente tras el paso
de la filtracin (sin subcultivos)
Caractersticas:
compuesto de varios tipos de clulas (las que estaban presentes en el tejido)
retiene las caractersticas metablicas y funcionales originales
NO preserva la estructura histolgica del tejido original
(diferencia con el cultivo de rganos)

las clulas tienen una capacidad de divisin y tiempo de vida limitada


(entran en senescencia o se mueren despus de varios ciclos de divisin por el continuo
acortamiento de los telmeros Lmite de Hayflick, demostrado 1961)

el cultivo primario es el cultivo celular ms parecido al estado nativo


(= tejido nativo disgregado) !
despus del primer subcultivo (pasaje), el cultivo primario deja de ser un
cultivo primario y se convierte en una cepa celular

Lnea Celular Estable


Una lnea celular estable es un cultivo celular constituido por clulas inmortales
- clulas cancergenas + clulas madre
- clulas normales transformadas

(= inmortalidad nativa)
(= inmortalidad artificial)

La transformacin implica un cambio en el genotipo que tiene como consecuencia


una modificacin en el fenotipo. Este cambio del genotipo se provoca a travs de
- la incorporacin de nuevo material gentico mediante un virus
(como SV40 y Epstein-Barr, entre otros; algunos viruses son capaces de provocar
cncer de esta manera y, por lo tanto, estn llamados viruses oncognicos, como,
por ejemplo, el virus del papiloma humano que puede provocar cncer de crvix)

- la transfeccin con telomerasa transcriptasa inversa (TERT)


- la inactivacin de los genes supresores tumorales
(mediante transfeccin con protenas como p53, Ras o el mutante de Myc T58A)

Lnea Celular Estable


En los posteriores subcultivos tiene lugar una seleccin de clulas, de forma que
aquellas que muestran un crecimiento ms rpido pronto ocuparn todo el espacio
hasta llegar a la confluencia. La proporcin de clulas cuyo crecimiento est
limitado por inhibicin por contacto ir disminuyendo progresivamente.

lnea celular cultivada hasta confluencia


(= las clulas ocupan prcticamente
100% de la superficie de la placa)

Lnea Celular Estable


Caractersticas:
tericamente ilimitados subcultivos
aumento en la velocidad de crecimiento
pierden con el tiempo caractersticas metablicas y funcionales originales
(capacidad de sintetizar determinados enzimas, secrecin de protenas, entre otros)
aparecen clulas con un nmero anormal de cromosomas - clulas aneuploides
(aumento en la variabilidad de este parmetro en la poblacin en cultivo)
alteraciones en la citomorfologa

en general las clulas se van desdiferenciando, perdiendo as sus


caractersticas originales !

Medio de Cultivo
Las clulas se mantienen en una solucin llamada
medio de cultivo que contiene:
fuentes de energa

glucosa 5-20 mM
glutamina 0,7-5 mM

fuentes de nitrgeno

aminocidos

vitaminas
sales inorgnicas
indicador de pH

rojo fenol color


pH 7,4 = rojo
(fresco)
pH < 7,4 = amarillo (acidificado debido a la excrecin de
metabolitos)

Ejemplos:
MEM:
DMEM:
RPMI1640:

Eagles minimum essential medium


Dulbeccos modified Eagles medium
Roswell Park Memorial Institute 1640 medium

Medio de Cultivo
Adems se necesita un suplemento para el medio de
cultivo llamado suero que aporta:
hormonas y factores de crecimiento
protenas con funciones especiales
(enzimas o protenas transportadoras, por ejemplo, albumina)

nutrientes y oligoelementos
modulacin de las propiedades fsico-qumicas del medio
El suero se aade a una concentracin final del 10% y puede ser de origen:
- natural

(clsico; caro, proviene de la sangre de animales y tiene mucha variabilidad en la


composicin)

- sinttico (moderno; contenido estandarizado)

Existen tambin medios especiales que no necesitan suero serum-free media


Suero sanguneo parte lquida de la sangre SIN factores de coagulacin
(se obtiene por centrifugacin de una muestra de sangre coagulada)
Plasma sanguneo parte lquida de la sangre CON factores de coagulacin
(se obtiene por centrifugacin de una muestra de sangre con anticoagulante, p.ej., EDTA)

Medio de Cultivo
Los microorganismos crecen ms rpidamente que las clulas animales y en
caso de una contaminacin pronto ocupan todo el cultivo celular. Los mtodos
de esterilizacin ms importantes utilizados en cultivo celular son:
1) Autoclavar - vapor de agua presurizado
(103 kPa = 121 C para 15 min; 200 kPa = 134 C para 3 min)

2) Filtracin estril - membrana con poros definidos


(tamao de los poros 0,22 m)

3) Radiacin ionizante - radiacin gamma


4) Esterilizacin seca - calor
(slo para vidrio y metal!
180 C durante 30 min, 170 C durante 60 min, 160 C durante 120 min)

Los componentes del medio de cultivo se esterilizan normalmente por


filtracin estril, porque es el nico mtodo que no cambia sus propiedades
fsico-qumicas

Medio de Cultivo
Tras la esterilizacin, para proteger al cultivo celular de una
contaminacin posterior por microorganismos, se aade uno o
varios suplementos adicionales al medio de cultivo:
antibitico proteccin contra bacterias
(penicilina, estreptomicina, gentamicina)

antimictico proteccin contra hongos, levaduras


(amfotericina B)

antibitico especial proteccin parcial contra micoplasma


(B-M Cyclin, ciprofloxacina)

el medio de cultivo completo y listo para utilizarlo lleva normalmente tres


componentes
1 medio de cultivo
2 suero
3 antibitico (a veces adems un antimictico)

Micoplasma
Micoplasma: son bacterias muy pequeas (~0,25 m) que viven como parsitos de
forma extra- e intracelular. Son actualmente la amenaza ms seria de los cultivos
celulares, porque
una contaminacin del cultivo no se puede detectar con el microscopio ptico debido
al pequeo tamao de los micoplasma (en su lugar la deteccin se lleva a cabo mediante PCR)
no tienen pared celular por lo que los antibiticos habituales no funcionan
la filtracin estril (0,22 m) no elimina los micoplasma porque se pueden deformar

Colonia de micoplasma en
una placa de agar especial,
magnificacin 100x.

Laboratorio de Cultivo Celular


El diseo del laboratorio y los aparatos que se utilizan estn determinados
por dos parmetros esenciales en el cultivo celular:
1) Mantenimiento de condiciones estriles
2) Nivel de bioseguridad necesario

El laboratorio de cultivo celular


es un espacio independiente
unidad cerrada y aislada de
otros laboratorios
slo para la manipulacin de
los cultivos celulares

Bioseguridad
American Biological Safety Organization
www.absa.org
Enlace importante con mucha informacin que incluye las
distintas definiciones de los niveles de bioseguridad que
existen en distintos pases/zonas y una base de datos
exhaustiva sobre el riesgo que presentan los diferentes
microorganismos
American Type Culture Collection
www.lgcstandards-atcc.org
Repositorio comercial de lneas celulares y microorganismos. Su pgina web contiene informacin completa
sobre prcticamente todas las lneas celulares estables,
como por ejemplo, nivel de bioseguridad, proveniencia,
protocolo del subcultivo y medios de cultivo, entre otros.

Niveles de Bioseguridad
Aunque distintas organizaciones y pases han desarrollado
sus propias definiciones de los niveles de bioseguridad, por
regla general, estas tienen los siguientes criterios en cuenta:
- gravedad de la enfermedad
- probabilidad del contagio a nivel individual + poblacional
- existencia de medios preventivos (p.ej., vacunas)
- existencia de tratamientos (p.ej., frmacos)

La siguiente lista se debe entender como una sntesis de las definiciones existentes
Nivel 1

sin enfermedad (ejemplo: E. coli)

Nivel 2

enfermedad moderada, poco contagiosa, profilaxis y/o tratamiento disponible


(ejemplo: Salmonella enterica)

Nivel 3

enfermedad grave o mortal, contagiosa, profilaxis y/o tratamiento disponible


(ejemplo: Yersinia pestis)

Nivel 4

enfermedad grave o mortal, contagiosa, profilaxis o tratamiento NO disponible


(ejemplo: virus del bola; de momento solo hay viruses en el nivel 4)

Ejemplos de lneas celulares


Por regla general, las lneas celulares estables que provienen de un tumor
tienen el nivel de bioseguridad 1, porque no provocan ninguna
enfermedad (por ejemplo, la lnea A549 cncer de pulmn).
Sin embargo, las clulas de algunos cnceres se han convertido en
tumorales porque el paciente se infect de forma natural con un virus
oncognico (por ejemplo, la lnea HeLa cncer de crvix; contiene el
virus del papiloma humana). El virus sigue presente en la lnea celular que
proviene de este cncer y, simplemente por este motivo, la lnea tiene el
nivel de bioseguridad 2.
Las clulas de las lneas celulares estables no tumorales normalmente
fueron inmortalizadas con un virus que tambin sigue presente en esta
lnea despus de la transformacin. Por este motivo, suelen ser de nivel de
bioseguridad 2 (por ejemplo, la lnea HEK293 inmortalizada con
adenovirus).
Una excepcin de esta regla son las clulas madre que no son tumorales
pero que no requieren una transformacin con un virus para formar una
lnea celular estable.

Cabinas de flujo laminar


Se utilizan para proporcionan una zona de trabajo estril en la cual se
puede llevar a cabo la manipulacin de las clulas cultivadas
1) Cabinas de flujo laminar horizontal
2) Cabinas de bioseguridad con flujo laminar vertical
objetivo principal: bioseguridad = proteccin del experimentador y del entorno; no es
slo proporcionar una zona de trabajo estril

clase I (cabina abierta no se usan en


cultivo celular porque no
proporcionan esterilidad en la
zona de trabajo)

aire no estril entra en la zona de


trabajo pero sale filtrado = estril

clase II (cabina semicerrada)

recirculacin del aire en el interior

clase III (cabina completamente cerrada)

para trabajar con organismos muy


patgenos; guantes completamente
cerrados llegan al interior; slo para
los niveles de bioseguridad 3

10

Cabinas de flujo laminar


1) Cabinas de flujo laminar horizontal
(no se usan para manipulacin de las clulas cultivadas, pero se pueden utilizar para completar
el medio de cultivo, para la filtracin estril o para la preparacin de cultivos primarios mediante
diseccin de animales)

objetos en la zona de trabajo provocan turbulencias del flujo de aire lo que


facilita la contaminacin no se puede cerrar para no inhibir el flujo laminar
aire de la zona de trabajo sale sin filtrar al exterior

front completely open

proteccin del material de trabajo pero no del tcnico

Cabinas de flujo laminar


2) Cabinas de bioseguridad con flujo laminar vertical
Clase II

(los ms utilizados para el cultivo celular)

objetos en la zona de trabajo casi no influyen el flujo laminar


aire de la zona de trabajo sale filtrado al exterior
el subtipo (A1, A2, B1, B2) define el nivel de recirculacin

front partially closed

proteccin del material de trabajo + del experimentador

parte frontal parcialmente cerrado


(cristal hasta la mitad de la altura)

11

Cabinas de flujo laminar


2) Cabinas de bioseguridad con flujo laminar vertical
Clase III
el principio es igual como el de la clase II, pero adicionalmente
la cabina est hermticamente cerrada
(y lleva una presin negativa con respecto al exterior para
evitar la salida de contaminantes en caso de una fuga)

tiene una cmara esterilizable con dos puertas para


acceder al interior sin conexin directa con el entorno
mxima proteccin del experimentador y del
exterior
cmara de dos puertas
para acceder al interior
(desinfectable)
entrada para los manos
(guantes cerrados)

parte frontal completamente cerrado

Incubadores de CO2
Los incubadores del cultivo celular son
estufas especiales para mantener una
temperatura de exactamente 37 C (para
clulas mamferas; clulas de insectos
necesitan 28 C y oxgeno en lugar de CO2)
Una bandeja con agua destilada en el fondo
del incubador mantiene una atmosfera
hmeda (humedad relativa = 100%) para
impedir la evaporacin del medio del cultivo.
El equilibrio del pH en la sangre de un mamfero se mantiene por el tampn
fisiolgico de bicarbonato. El sistema qumico es:
H+ + HCO3- H2CO3 H2O + CO2
Para evitar que el bicarbonato del medio de cultivo se pierda como dixido
de carbono y el medio se vuelva alcalino, la atmosfera del incubador lleva
un elevado nivel de CO2 (normalmente entre 5 y 10%) lo que desplaza el
equilibrio de la reaccin qumica haca el lado izquierdo. El nivel de CO2 en
la atmosfera del planeta es slo alrededor de 0,04% (400 ppm).

12

Centrfugas
Imprescindibles para realizar el subcultivo
Clulas adherentes
(al llegar a confluencia)
Las clulas adherentes se
tienen que despegar primero
con tripsina-EDTA estril

Clulas adherentes despegadas o


Clulas en suspensin
(al llegar a ~ 8x105 clulas/ml)
Centrifugacin
150-200 g, 5-10 min

Sedimento de clulas
Resuspensin en medio
de cultivo fresco, contaje,
dilucin y redistribucin

Subcultivo diluido

Hemocitmetro
Sistema cmara de Neubauer
Usado para el contaje manual de las clulas
Aadiendo azul de tripano se puede diferenciar
clulas vivas de clulas muertas
determinacin de la viabilidad.
La membrana plasmtica de las clulas muertas
es permeable permitiendo la entrada y
acumulacin del colorante en el interior. Las
clulas muertas se tien azul. Con la malla se
puede determinar la cantidad de clulas (en 0,1
l) y calcular la concentracin de clulas por ml

Sistemas automatizados
Contaje automatizado con
portaobjetos como fungibles
(rpido y fiable, pero caro)

13

Almacenamiento de Clulas
En nitrgeno lquido a -196 C
Si las clulas se congelan en el medio de cultivo, se destrozan
durante la congelacin por la formacin de cristales. Esto se evita
mediante:
1) la adicin de DMSO (dimetilsulfxido) a una concentracin final
del 5-10%
2) una reduccin lenta de la temperatura
(nevera congelador -20 C congelador -80 C nitrgeno)
A una temperatura de -196 C
prcticamente todas las
reacciones qumicas estn
paradas y, por lo tanto, las
clulas se pueden guardar
infinitamente sin perder su
viabilidad. Esto no es el caso
a temperaturas ms elevadas
(por ejemplo, ultracongelador
-80 C)

Recipientes de Cultivo
Botellas de fondo plano
(sobre todo para mantenimiento)

Placas de Petri
(sobre todo para mantenimiento)

Placas multipocillo
(para experimentos)

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Preparacin Histolgica

Seminarios y Talleres de la asignatura Citologa e Histologa


(curso 2015-2016)

Preparacin histolgica
Es el conjunto de procedimientos aplicados para preservar la
estructura y la organizacin de clulas y tejidos, a fin de obtener una
preparacin microscpica observable con un microscopio ptico

Preparacin histolgica

Etapas de la preparacin
Es importante tomar la muestra sin
provocar ninguna deformacin de las
estructuras

Desnaturalizacin de las protenas


(evita la autolisis por enzimas
hidrolticas)

biopsia de un individuo vivo


necropsia de un individuo muerto

Fijacin qumica a) inmersin (p.ej. formol =


formaldehdo 10% en agua;
volumen abundante del
fijador, 1:40!)
b) perfusin de un rgano
o animal entero

En caso de clulas, stas se dejan crecer


sobre superficies especiales (pequeas,
movibles)

Fijacin fsica

a) congelacin
b) calor seco
c) vapor de agua (con formol)

Etapas de la preparacin
Lquido miscible con agua y a la vez
con lquidos hidrofbicos

Cambio del etanol por un lquido


completamente hidrofbico

Etanol en graduacin ascendente

Xilol

La deshidratacin prepara la muestra para


la inclusin en parafina

El xilol es un solvente de la parafina y


otorga adems transparencia a la muestra

Etapas de la preparacin
La parafina penetra en el tejido y
desplaza el xilol

La parafina con la muestra incluida se


deja enfriar = solidificar

para hacerlo tiene que estar en


estado lquido

permite fijar el bloque al micrtomo

Despus la muestra se deposita en


pequeos recipientes y se deja solidificar

Se puede tambin pegar en un soporte (taco)

Etapas de la preparacin
Instrumento de precisin para obtener
cortes muy delgados (1-10 m) y
uniformes

Los cortes se depositan en la


superficie de un recipiente con agua

Tejidos fijados por congelacin se


seccionan con un micrtomo de
congelacin o un criostato que mantiene la
temperatura por debajo de -20 C

Se montan sobre un portaobjetos de


vidrio y se dejan secar

Tipos de micrtomos

Micrtomo de Mano o de Ranvier


(cortes con una navaja histolgica a mano, la pieza
se fija en el interior y se levanta con el tornillo micromtrico graduado de abajo)

Tipos de micrtomos

Micrtomo de Deslizamiento
cuchilla mvil, para inclusiones de parafina, movimiento horizontal y de avance,
obtencin de tiras de cortes seriados (= consecutivos)

Tipos de micrtomos

Micrtomo de Rotacin o Minot


cuchilla fija, para inclusiones de parafina,
movimiento vertical y de avance del bloque
de parafina, obtencin de tiras de cortes
seriados (= consecutivos)
corte habitual 1 - 10 m
corte semifino 0,5 - 2 m

Micrtomo de Congelacin
mantiene la muestra fra mediante la
expansin de un gas comprimido CO2
corte habitual

> 10 m

Interacciones de la luz con objetos


Cuando la luz atraviesa un objeto pueden ocurrir tres efectos:

1) El objeto disminuye la intensidad de la luz que le atraviesa


objeto de amplitud

objeto/sus estructuras son (parcialmente) opacas

2) El objeto provoca un retraso de la fase de la luz


objeto de fase

objeto/sus estructuras son transparentes

3) El objeto colorea la luz que le atraviesa


objeto de color

objeto/sus estructuras llevan un colorante


natural o estn teidas artificialmente

Interacciones de la luz con objetos


Objeto que disminuye / absorbe
una determinada longitud
de onda de la luz blanca

objeto de color / objeto teido


elimina una longitud de onda especfica
(= un color especfico) de la luz que le atraviesa

Interacciones de la luz con objetos


La luz blanca es el conjunto de todas las longitudes de
onda del espectro visible

La eliminacin de una longitud de onda especfica (= de un color)


nos deja ver el color complementario
luz blanca

absorcin de un color

representada aqu por los colores


rojo + verde + azul

= azul

objeto obtiene el
color complementario
= amarillo

Clases de tcnicas citolgicas e histolgicas


Observacin de

Clulas vivas
(observacin vital)

sin tincin

con tincin
(tincin vital)

Microscopa de
Colorantes vitales
- contraste de fases
- campo oscuro
- interferencia diferencial
(o campo claro
cerrando el diafragma de iris
= prdida de resolucin)

Clulas muertas

sin tincin

con tincin

(no se suele hacer)

Colorantes

(adems, visualizacin
con fluorocromos y
mediante otras tcnicas)

Clases de tcnicas citolgicas e histolgicas


Clulas vivas
(observacin vital)
Objetos:

- microorganismos (p.ej., bacterias, protozoos)


- cultivos celulares
- tejidos blandos

Origen:

- gota de agua (p.ej., de un estanque)


- placa de petri
- disociacin mecnica de tejidos blandos
(p.ej. raspado bucal, pincelamiento, aplastamiento squash)

las clulas que provienen de una disociacin mecnica se pueden mantener


vivas un cierto tiempo en un lquido fisiolgico
a) natural

- suero sanguneo
- lquido amnitico

b) artificial

- suero fisiolgico (NaCl 0,9% osmolaridad)


- solucin de Ringer (NaCl, CaCl, KCl, Na2CO3)

Clases de tcnicas citolgicas e histolgicas


Clulas vivas
(tincin vital)

Colorantes vitales:

Rojo Neutro

vacuolas

Verde Jano

mitocondrias

Azul de Metileno

ncleo

Los colorantes vitales tien estructuras especficas y dan contraste.


Se utilizan a concentraciones relativamente bajas (p. ej., 1 : 100000)
Sin embargo, despus de un tiempo matan a la clula.

Clases de tcnicas citolgicas e histolgicas


Clulas muertas
Fijacin:

Los fijadores qumicos pueden modificar las apariencias


colorantes de las estructuras celulares
accin mordiente de un fijador

Tipos de coloracin:
1) Coloracin ortocromtica:
la estructura teida del tejido tiene el mismo color que el
colorante (el caso habitual)
2) Coloracin metacromtica:
algunos colorantes (la mayora bsicos, p.ej. azul de toluidina)
tien ciertas estructuras con un color distinto al suyo propio e
incluso distintas estructuras de distintos tonos o colores

Clases de colorantes (no vitales)


Colorantes bsicos
(catinicos + )

llevan carga positiva


tien estructuras con carga negativa
(acdicos: fosfatos de cidos nucleicos, carboxilatos
de protenas, sulfatos de glucosaminoglucanos)

tien estructuras basfilas

Colorantes cidos
(aninicos - )

llevan carga negativa


tien estructuras con carga positiva
(bsicos: el citoplasma, grupos amino protonados
de protenas)

tien estructuras acidfilas

Colorantes neutros

no llevan carga
= insoluble en agua; soluble en etanol
(apolares: grasa)

estructuras lipoflicas

Ejemplos de colorantes (no vitales)


Colorantes bsicos

Hematoxilina Ncleo (azul-violceo)

Colorantes cidos

Eosina Citoplasma (rosa)

Colorantes neutros

Sudn III Grasa (rojo)

Colorantes (no vitales)


Adipocitos del tejido adiposo
Vacuolas (= gotas de grasa)
teidos con un derivado del
Sudn III (Red Oil O)

Colorantes neutros

Sudn III Grasa

10

Etapas de la preparacin
Eliminar la parafina con xilol e
intercambiar este lquido hidrofbico
por el solvente intermediario etanol

Permitir la penetracin de los


colorantes que la mayora estn en
solucin acuosa

Etapas de la preparacin
Coloracin sucesiva con hematoxilina + eosina
El uso de agua del grifo despus de la
tincin con hematoxilina es importante,
porque contiene las sales necesarias para
promover la formacin del color (adems
neutraliza el pH cido de la solucin)
El color cambia de
rojizo-marrn azul-violceo

11

Etapas de la preparacin
Preparacin de la muestra para el medio de montaje
Medio de montaje a) hidrosoluble

(contaminables, rendimiento ptico pobre; p.ej.


Aquatex, glicerina, goma arbiga)

b) no hidrosoluble (= los medios de montaje ms utilizados; p.ej


Blsamo de Canad, Euparal, D.P.X. Poliestireno)
la deshidratacin + aclaramiento del corte slo se lleva a cabo si el medio de
montaje NO es hidrosoluble !
es un paso necesario para permitir la impregnacin de la muestra que viene de un entorno
acuoso ( tincin) con una sustancia hidrofbica ( medio de montaje)

Etapas de la preparacin
Un medio de montaje debe:
- unir rpidamente y duraderamente el cubreobjetos con el portaobjetos
- ser qumicamente neutro
- perfectamente transparente
- no alterarse con el tiempo

- poseer un ndice de refraccin semejante al cristal !!!


= menos refraccin de la luz que proviene de la muestra al pasar por el cubreobjetos
= ms luz que proviene de la muestra entra en el objetivo
D.P.X. (N = 1,55), blsamo de Canad (N = 1,53)

12

Coloracin hematoxilina - eosina

Carcinoma del epitelio de la laringe

13

Microscopa electrnica

Seminarios y Talleres de la asignatura Citologa e Histologa


(curso 2014-2015)

Lmite de Resolucin
Ojo humano
0,25 mm

Microscopio ptico
0,2 m 2 mm
Aumentos: 10 2000x

Microscopio electrnico
100 pm 2 mm
Aumentos: 90 800.000x

[m] 10-10

10-9

1 nanmetro

10-8

10-7

10-6

1 micrmetro

10-5

10-4

10-3

10-2

1 milmetro

Comparacin entre un Microscopio.


ptico

Electrnico
Can de
electrones
(= ctodo
+ anodo)

Fuente de iluminacin
(bombilla)

Filamento de tungsteno
(ctodo)

Rayo de fotones ( onda electromagn.)

nodo
Rayo de electrones ( onda de materia)

Lente del condensador


(cristal)
Muestra

Lente del condensador


(campo magntico)
Muestra

Lentes de cristal del


objetivo

Lentes electromagnticos
del objetivo

Plano focal de la lente del


objetivo
Ocular

Plano focal de la lente del


objetivo
Lente del proyector

Retina del ojo

Pantalla visual
(de fluorescencia o pelcula fotogrfica)

Microscopio Electrnico
Requisitos especiales:
La emisin y aceleracin de los electrones en el can de electrones requiere
un voltaje alto entre el ctodo (-) y nodo (+) en el rango de kV hasta unos MV
(millones de voltios)
La aceleracin de los electrones a velocidades muy altas (> 108 m/s) es
necesario para que se comporten como una onda (de materia) con una longitud
de onda extremadamente pequea - segn la ecuacin de De Broglie
longitudes de ondas pequeas aumentan la resolucin del microscopio
Electrones son partculas (tienen una masa) y para evitar colisiones con otras
partculas o molculas de gas en el interior del microscopio electrnico, ste
se mantiene con un grado de vaco muy elevado. Este vaco evita 1) el
calentamiento del interior del microscopio y 2) que los electrones se desven
de su camino recto hacia abajo por dichos choques
imposibilidad de observar estructuras vivas !

Interaccin de los Electrones con la Muestra


Rayo de electrones incidentes
Electrones emitidos hacia arriba
microscopa electrnica de barrido

Ctodoluminescencia
(luz visible)

Electrones Auger
Bremsstrahlung

Electrones Secundarios
Electrones Reflectados

Rayos X
caractersticos

Calor
Electrones dispersados
elsticamente
(dispersin de Rayleigh)

Electrones que atraviesan la muestra


microscopa electrnica de transmisin

Electrones transmitidos
y dispersados inelsticamente
(dispersin de Raman)

Microscopa Electrnica de Transmisin


Toma de la muestra:

evitando deformaciones

Fijacin:

se tienen que entrecruzar las protenas (crosslinking)


para preservar las ultraestructuras celulares; no es una
simple desnaturalizacin como en la preparacin
histolgica clsica
(fijadores: glutaraldehdo + tetrxido de osmio)

Tincin:

la tincin se puede hacer antes de la microtoma


sobre todo si se planea hacer ltracortes extremadamente
finos porque stos se pueden romper fcilmente una
vez cortados; en estos casos la muestra tiene que ser
precortada antes de teirla
se utilizan sales de metales pesados porque son
sustancias electrodensas que dan contraste a las
estructuras celulares a las que tienen afinidad
(colorantes: acetato de uranio, citrato de plomo)

Microscopa Electrnica de Transmisin


Deshidratacin:

batera de alcoholes (70-100%)

Impregnacin + inclusin:

resina de epoxi lquida (hidrofbica)


polimeriza bloque de plstico

dos inclusiones para la microscopa electrnica de transmisin con la


muestra ya tratada con citrato de plomo

Ultramicrotoma

se pueden utilizar

Ultramicrotomo para hacer cortes de


un grosor de solo 0,02 - 0,08 m
(= 20-80 nm)

1) cuchilla de vidrio
desventaja: se tiene que preparar al
momento y solo aguanta pocos cortes

2) cuchilla de diamante
desventaja: se queda fcilmente sin filo si
se comete un error de manipulacin y es
muy cara (fabricada con reservorio puesto
> 2000,- ; servicio de afilar > 1000,-)

Cuchillas de vidrio

solo un borde de cada triangulo


est suficientemente afilado
para servir como cuchilla

Cuchillas de vidrio

reservorio de agua en que el corte ltrafino ser recogido inmediatamente


despus de su preparacin

Grosor del corte ltrafino

Cuando se miran laminas finas bajo el ngulo de


reflexin de interferencia aparecen diferentes
colores segn el grosor de la lamina.
Se puede estimar el
grosor del corte
ltrafino comparando
su color con una
tabla que indica el
grosor aproximado
que corresponde a
cada color
(Sjstrand F.S., 1967)

Montaje de los cortes ltrafinos


Los cortes se pescan con una rejilla
y despus sern montados en el
orificio de un brazo portamuestras
que se introduce en el microscopio
electrnico de transmisin a travs
de una compuerta

Microscopa Electrnica de Transmisin


Transmission electron microscopy TEM
Los electrones traspasan la muestra de manera parecida a como lo hacen las
ondas electromagnticas en el microscopio ptico de campo claro
- campo amplio de electrones produciendo una imagen completa
- las zonas ms electrodensas aparecen ms oscuras
- las imgenes no tienen color porque el color es una caracterstica de las
ondas electromagnticas y no est relacionado con electrones
- la muestra tiene que ser de un grosor extremadamente fino para permitir
el traspaso de los electrones (corte ltrafino 20-80 nm)
- se detectan mayoritariamente electrones primarios (los transmitidos y
los dispersados en un ngulo estrecho dispersin de Raman)
- no se puede hacer observaciones vitales
- posibilidad de una inmuno-microscopa electrnica
con anticuerpos marcados con oro

Microscopio Electrnico de Transmisin

Pantalla de un microscopio electrnico de


transmisin

Criofractura
cara E
cara P

La criofractura es una tcnica especial de la preparacin de la muestra para la


microscopa electrnica de transmisin. La muestra se congela a temperaturas
muy bajas (por ejemplo, nitrgeno lquido, -196 C) antes de romperla. El sitio
de la rotura se encuentra con frecuencia en medio de las bicapas lipdica, por
lo que esta tcnica se usa mucho para el estudio de las membranas.

Criofractura
Despus de la fractura se quita el agua remanente bajo vaco (etching) de la
muestra y la superficie se cubre con una pelcula muy fina de metal pesado
desde un ngulo (shadowing). Esta capa de metal servir como rplica de la
superficie que posteriormente se puede observar con el microscopio
electrnico de transmisin.

Superficie de una criofractura que


muestra la envoltura nuclear con
poros

Microscopio Electrnico de Barrido


Toma de la muestra:

evitando deformaciones

Fijacin:

una fijacin en el sentido estricto de la palabra


no es necesaria porque se observan estructuras
superficiales de la muestra que son ms
duraderas

Desecacin:

en el vaco el agua evapora extremadamente


rpido (de forma explosiva) por lo que la
muestra no puede retener ningn lquido

Impregnacin + inclusin:

no es necesaria porque no se corta la muestra

Sombreado (Coating):

recubrimiento de metal (p.ej., platino) lo que


a) proporciona mejor reflexin de los electrones
b) evita carga electrosttica puntual
c) evita calentamiento (termoconductor)

Microscopio Electrnico de Barrido


(Scanning electron microscopy SEM)

haz explorador

haz visualizador

Microscopio Electrnico de Barrido


Los electrones impactan en la superficie de la muestra de manera parecida a
como lo hacen las ondas electromagnticas en el microscopio ptico de
reflexin (lupa binocular).
- rayo fino de electrones escaneando punto por punto ( barrido) la muestra
para evitar una sobrecarga electrosttica con electrones que desviara el rayo
incidente de electrones
- por el mismo motivo la superficie de la muestra se cubre con un metal
pesado ( metalizado, conductor)
- El detector capta mayoritariamente seales de electrones secundarios y
en tambin en menor parte tambin de electrones primarios reflectados
- gran profundidad de campo
- muy alta resolucin
(porque los electrones secundarios se
generan en una zona muy restringida)
- fondo parece negro porque no
reflecta electrones

10

Microscopio Electrnico de Barrido Ambiental


(Environmental scanning electron microscope ESEM)

p0 = 13 hPa

La microscopa electrnica de barrido


ambiental es una tcnica especial de la
microscopa electrnica de barrido.
En la cmara en la que se encuentra la
muestra (abajo) hay una atmosfera de
baja presin. Una pequea cantidad de
este aire se escapa a la cmara stage 1
por el pequeo orificio que es
imprescindible para dar paso a los
electrones. Una bomba vaca
continuamente esta cmara, y evita as
que el aire pueda entrar en la cmara
stage 2. Como consecuencia, el
recorrido de los electrones por el
microscopio electrnico siguen siendo
en gran medida un recorrido por vaco.

(pambiental 1000 hPa)

Microscopio Electrnico de Barrido Ambiental


Los electrones chocan con las
molculas del aire que se encuentran
en la cmara stage 1, lo que induce la
desviacin de una parte de los
electrones en forma de falda (skirt).
Este efecto es an ms acusado en la
cmara con la muestra, aunque
equilibrando los distintos parmetros
se puede conseguir que al final
suficientes electrones alcancen la
superficie de la muestra.
ESEM

Algunos pocos organismos, como por


ejemplo los caros, toleran durante un
cierto tiempo la baja presin que hay en
la cmara de muestra.
posibilidad de una observacin vital
con este microscopio electrnico
especial

11

Imgenes del Microscopio Electrnico


Microscopio electrnico de transmisin

Microscopio electrnico de barrido

4
5
6

2
1

12

Estructuras Celulares
Imagen de un hepatocito captada con un microscopio electrnico
de transmisin (TEM)
1) Nuclolo
2) Cromatina
3) Heterocromatina
4) Envoltura nuclear
5) Mitocondria
6) Retculo endoplasmtico rugoso
7) Grnulo de glucgeno

13

Inmunocitoqumica

Seminarios y Talleres de la asignatura Citologa e Histologa


(curso 2015-2016)

Tcnicas inmunocitoqumicas
Definicin:
Visualizacin de un componente celular
(orgnulo, macromolcula, entre otros)
mediante una reaccin antgeno-anticuerpo

Estructura de un anticuerpo
Un anticuerpo tpico tiene dos lugares
idnticos de unin al antgeno
Lugares de reconocimiento y
unin al antgeno
(gran variabilidad para adaptarse)

Fab

Fab

la parte variable del anticuerpo


(distinta entre los diferentes anticuerpos del
mismo organismo por la necesidad de
reconocer distintos antgenos)

la parte constante del anticuerpo


Fc

(igual entre los diferentes anticuerpos en una


especie)

Antgeno y anticuerpo
Los antgenos tienen regiones especficas que
sirven como lugar de unin para el anticuerpo
(llamadas determinante antignico o eptopo).
= eptopo

Un nico antgeno puede poseer varios


determinantes antignicos que normalmente son
distintos (aunque tambin pueden ser iguales),
cada uno con sus caractersticas especficas.
Normalmente un anticuerpo se une a dos
determinantes antignicos idnticos que pueden
estar localizados en el mismo o en dos antgenos
diferentes (ver imgenes). La regin flexible (hinge
region) permite que la forma del anticuerpo se
puede adaptar a la distancia entre los dos
eptopos.

En cualquier caso, cada anticuerpo slo


reconoce un nico tipo de determinante
antignico (= un eptopo especfico).

Produccin de anticuerpos policlonales


Anticuerpos policlonales:

- husped: ratn pero sobre todo conejo, cabra, oveja, asno


- produccin de los anticuerpos en el animal
- anticuerpos que provienen de distintas clulas inmunolgicas
y, por este motivo, reconocen distintos eptopos
adjuvante compuesto que aumenta la reaccin inmunolgica = ms anticuerpos

Adjuvans +

Blood

Serum
Polyclonal
antibodies
Pellet of cellular
components
Ligand affinity
column purification
(chromatography)

Produccin de anticuerpos monoclonales


Anticuerpos monoclonales:

- husped: ratn
- produccin de los anticuerpos en cultivo celular
- un nico tipo de anticuerpo contra un nico eptopo

Tcnicas inmunocitoqumicas
Tcnica directa

Antgeno

Eptopo

Flurocromo

Antgeno = diana celular objeto de estudio (normalmente una protena)


Anticuerpo especfico = se agrega a la preparacin donde se une con el eptopo
Marcador unido al anticuerpo = permite la visualizacin del anticuerpo mediante algn
sistema ptico (ej., fluorocromo, peroxidasa, oro coloidal)

Desventaja: En la tcnica directa hubiera que marcar cada anticuerpo especfico


(que reconoce algn eptopo) con los distintos marcadores
son muchos marcajes diferentes = muy costoso

Tcnicas inmunocitoqumicas
Tcnica indirecta
Utilizando un anticuerpo contra un anticuerpo.
(un anticuerpo mismo se convierte en un antgeno)
Fab

Fab

Anticuerpo
primario
Fc

Anticuerpo
secundario

la cola / pie es caracterstica para la


especie de la cual proviene el anticuerpo
aqu sirve como eptopo para el
segundo anticuerpo

se marca solo el segundo anticuerpo


que puede reconocer muchos
anticuerpos primarios diferentes (si
provienen de la especie que reconoce)

Tcnicas inmunocitoqumicas
Tcnica indirecta - ejemplo
Fab

Fab

Fc

1. anticuerpo contra: protena xyz

(Especie de produccin: p. ej. conejo)


2. anticuerpo contra:

Fc (de conejo)

(Especie de produccin: p. ej. cabra)


Ventajas:
1) aumento de la sensibilidad, porque al anticuerpo primario se pueden unir varios
anticuerpos secundarios ms marcador por eptopo
2) Se puede cambiar el anticuerpo primario (no marcado = barato) y mantener el mismo
anticuerpo secundario (marcado = ms costoso) siempre si la especie de produccin del
anticuerpo primario no se cambia

Tcnicas inmunocitoqumicas
Tcnica indirecta

A parte del marcaje con fluorocromos el segundo anticuerpo puede estar


fusionado con otros tipos de marcadores.

Anticuerpos marcados con fluorocromos


Microscopa de inmunofluorescencia
(immune fluorescence microscopy)

Anticuerpos marcados con oro


Inmuno-microscopa electrnica
(immuno-electronic microscopy; inmunoEM)

Cito- e Histoqumica

Seminarios y Talleres de la asignatura Citologa e Histologa


(curso 2015-2016)

Cito- e Histoqumica

Las tcnicas cito- e histoqumicas proporcionan sobre la clula o el


tejido en estudio informacin qumica concreta y localizada.
No son coloraciones que utilizan un colorante, sino reacciones qumicas
cuyo producto final es coloreado:
identificar y localizar una molcula o su actividad en la clula o tejido.
Para interpretar correctamente los resultados hay que llevar controles
adecuados a cada estudio (control negativo y/o positivo).

Reaccin de Feulgen
Marcaje selectivo del ADN

Reactivo de Schiff

Carcinoma del epitelio de la laringe


La hidrlisis cida del ADN produce una despurinacin (elimina las purinas)
y genera un grupo aldehdo en el carbono 1 de la desoxirribosa.
Este aldehdo reacciona con el Reactivo de Schiff.

Reaccin de Feulgen

Eritrocitos de ave

(color rojo magenta ADN del ncleo)

Reactivo de Schiff
Esquema general de la reaccin

grupo
aldehdo

Leucofucsina
(Reactivo de Schiff)

Fucsina
(color prpura)

El Reactivo de Schiff reacciona con aldehdos formando una estructura de


color prpura, la fucsina.

Reaccin del periodic acid-Schiff


(PAS)

Reaccin del periodic acid-Schiff (PAS)


Marcaje de estructuras celulares que contienen glucgeno y polisacridos

OH
OH

El tratamiento con cido peridico (HIO4) hidroliza los grupos hidroxilo de


los glcidos generando grupos aldehdo. Estos aldehdos pueden reaccionar
con el Reactivo de Schiff. La reaccin completa se llama PAS por las
iniciales Periodic Acid Schiff y es tpica para la coloracin histolgica de
carbohidratos.

Reaccin del periodic acid-Schiff (PAS)


Intestino Delgado

Vellosidades

Clulas caliciformes
(son PAS positivas
porque contienen
mucopolisacridos)

Determinacin de actividad enzimtica


Actividad de la enzima fosfatasa cida

Determinacin de actividad enzimtica


La muestra se incuba con el sustrato de la enzima objeto de estudio (en
el ejemplo: glicerofosfato)
La enzima fosfatasa cida presente en los lisosomas acta sobre el
sustrato y lo hidroliza liberando glicerol y fosfato. Estos productos
quedan localizados en los lisosomas donde se combinan con iones de
plomo o calcio para formar un producto insoluble (fosfato de plomo o de
calcio)
El fosfato de plomo es incoloro, pero por microscopa electrnica se
puede visualizar porque es una sal densa para los electrones. Con sulfito
de amoniaco se convierte en sulfuro de plomo que se puede ver mediante
microscopa ptica de campo claro por su color pardo.