Está en la página 1de 44

4.

Preparacin de muestras para


microscopa ptica

4. Preparacin de muestras

Criterios en las tcnicas de preparacin

Tcnicas para luz transmitida

Tcnicas para luz reflejada

4. Preparacin de muestras

El objetivo de la preparacin de muestras para


microscopa ptica es
permitir que las estructuras de los materiales se
revelen con suficiente contraste de modo que las
caractersticas de inters sean descritas, grabadas
y caracterizadas en detalles visibles a una escala
menor que la agudeza visual del ojo humano.
La escala ltima de observacin estar limitada por
la resolucin del sistema de imagen del
microscopio.

4. Preparacin de muestras

Criterios en las tcnicas de preparacin

Asegurar que la muestra a observar es


representativa del material, objeto u organismo de
procedencia que se desea estudiar.
Hacer que las caractersticas de inters sean
accesibles al sistema de imagen del microscopio.
Cuando sea necesario, aumentar el contraste entre
los elementos estructurales de los materiales y el
fondo.

4. Preparacin de muestras

Criterios en las tcnicas de preparacin

Proporcionar las condiciones suficientes para la


estabilidad de las muestras, y suficiente significa
proteger
las
muestras
de
decaimiento,
degradacin, corrosin o contaminacin dentro de
la escala de tiempo de la observacin.
Ajustar la muestra a los requisitos pticos del
sistema de imagen del microscopio para proveer de
las condiciones ptimas de contraste y resolucin,
y evitar artefactos pticos que pudieran aparecer y
que oscureceran la imagen o incorporaran falsos
detalles.

4. Preparacin de muestras

Tcnicas de preparacin para luz transmitida

Las muestras biolgicas pueden ser examinadas


en muchos estados como combinacin de los
siguientes:

vivas o muertas

frescas o preservadas/fijadas

enteras o en secciones

teidas o sin teir

hidratadas o deshidratadas

opacas o aclaradas

4. Preparacin de muestras

Tcnicas de preparacin para luz transmitida

Las muestras lo suficientemente pequeas como


para ser observadas enteras pueden tambin ser
observadas vivas, obtenindose el contraste
mediante dispositivos pticos tales como contraste
de
fases
o
contraste
interferencial
u,
ocasionalmente, por medio de tintes vivos
(tinciones no txicas que tienen afinidad por ciertos
componentes celulares).

4. Preparacin de muestras

Tcnicas de preparacin para luz transmitida

Sin embargo, la mayora de los organismos, sus


rganos y tejidos, e incluso sus clulas, son
demasiado grandes para proporcionar informacin
de alta resolucin con los microscopios pticos
convencionales.
Por ello no pueden ser observados vivos sino que
hay que matarlos y entonces (generalmente) deben
ser deshidratados, incluidos, cortados, teidos y
montados antes de su examen al microscopio.

4. Preparacin de muestras

Tcnicas de preparacin para luz transmitida


Montajes temporales de muestras vivas enteras

Las muestras que son organismos completos o


partes de organismos vivientes requieren un
tratamiento especial, tanto para mantenerlos vivos
durante la observacin, como para asegurar que su
muerte no destruya informacin de inters.
Las muestras examinadas al microscopio mientras
estn vivas suelen ser pequeas: organismos
completos como bacterias, protozoos y pequeos
animales y plantas, o partes discretas de
organismos como clulas en cultivo, clulas
sanguneas, granos de polen, etc.

4. Preparacin de muestras

Tcnicas de preparacin para luz transmitida


Montajes temporales de muestras vivas enteras

Dependiendo de la duracin de la observacin y de


la naturaleza de la muestra, se debe prestar
atencin a la provisin de suficiente oxgeno, al
mantenimiento de la concentracin de otras
sustancias (por ejemplo sales y alimento), a la
eliminacin del CO2 y otros residuos, al control de
la temperatura, a la provisin de luz apropiada, a la
eliminacin
de
organismos
extraos
o
depredadores.

4. Preparacin de muestras

Tcnicas de preparacin para luz transmitida


Montajes temporales de muestras vivas enteras

Las muestras aqu sealadas estarn montadas,


normalmente, en el medio en que se dan
habitualmente o sern cultivadas, por eso las
tcnicas de preparacin se limitan a montarlas en
un portaobjetos, bajo un cubreobjetos, en una
pequea gota de medio.
Si la observacin va a ser prolongada puede ser
necesario retardar la evaporacin sellando los
bordes del cubreobjetos.

4. Preparacin de muestras

Tcnicas de preparacin para luz transmitida


Montajes temporales de muestras vivas enteras

4. Preparacin de muestras

Tcnicas de preparacin para luz transmitida


Montajes temporales de muestras vivas enteras

4. Preparacin de muestras

Tcnicas de preparacin para luz transmitida


Montajes temporales de muestras vivas enteras

4. Preparacin de muestras

Tcnicas de preparacin para luz transmitida


Montajes permanentes de muestras no vivas

Fijacin

Deshidratacin e inclusin

Corte

Tincin

Montaje

4. Preparacin de muestras

Tcnicas de preparacin para luz transmitida


Montajes permanentes de muestras no vivas

Fijacin:

Los organismos de los cuales se van a obtener


montajes permanentes deben estar necesariamente
muertos y se debe tener mucho cuidado en que el
sacrificio se produzca en condiciones humanitarias y
con la menor alteracin posible de la estructura.
Tan pronto como sea posible despus de la muerte
y, en algunos casos, simultneamente, los tejidos
deben ser fijados, un proceso que mata las clulas,
inactiva sus enzimas, y precipita y entrecruza las
molculas que estn en solucin o suspensin
dentro de las clulas.

4. Preparacin de muestras

Tcnicas de preparacin para luz transmitida


Montajes permanentes de muestras no vivas

Fijacin:

Todas estas acciones estabilizan la estructura frente


a daos en el procesado posterior.
La fijacin tambin debe actuar como preservativo
frente al ataque microbiano y puede mejorar la
afinidad de la muestra por ciertas tinciones.
La fijacin se lleva a cabo generalmente por
tratamiento
qumico
aunque
en
ciertas
circunstancias se puede usar la fijacin fsica por
calentamiento o por congelacin rpida.

4. Preparacin de muestras

Tcnicas de preparacin para luz transmitida


Montajes permanentes de muestras no vivas

Deshidratacin e inclusin:

A las clulas les falta rigidez y se les proporciona


artificialmente con el soporte adecuado antes del
corte, convencionalmente por inclusin.
Un medio de inclusin debe ser capaz de infiltrar el
tejido en medio lquido y entonces solidificarse por
enfriamiento o polimerizacin para dar el soporte
necesario a los pequeos detalles del interior de la
muestra.

4. Preparacin de muestras

Tcnicas de preparacin para luz transmitida


Montajes permanentes de muestras no vivas

Deshidratacin e inclusin:

El medio ms utilizado para la inclusin es la


parafina, de un grado que funde a unos 56 C.
Sin embargo, la parafina no es miscible con los
fluidos acuosos en los que la muestra se encuentra
y requiere que sta sea deshidratada, generalmente
en pasos a travs de concentraciones crecientes de
etanol hasta llegar al absoluto, 100%.

4. Preparacin de muestras

Tcnicas de preparacin para luz transmitida


Montajes permanentes de muestras no vivas

Deshidratacin e inclusin:

El etanol es un agente deshidratante muy bueno


pero no es miscible con la parafina fundida, as que
hay que reemplazar el etanol con un fluido de
transicin miscible con l y con la parafina: xileno,
tolueno o compuestos menos txicos.
Una vez reemplazado el etanol con este fluido, el
tejido se sumerge en parafina fundida un perodo de
tiempo y sta infiltra el tejido.
Finalmente el tejido se transfiere a parafina fresca y
se deja que sta solidifique.

4. Preparacin de muestras

Tcnicas de preparacin para luz transmitida


Montajes permanentes de muestras no vivas

Corte:

Puede ser posible cortar secciones a mano, sin


embargo, la mayora de las secciones se cortan con
la ayuda de un microtomo.

4. Preparacin de muestras

Tcnicas de preparacin para luz transmitida


Montajes permanentes de muestras no vivas

Corte:
Microtomos

4. Preparacin de muestras

Tcnicas de preparacin para luz transmitida


Montajes permanentes de muestras no vivas

Corte:

Con una buena tcnica se pueden obtener


secciones de unas 5 m e incluso menores en
algunos casos.
Durante el corte las secciones forman una fila unas
pegadas a otras que es cmoda de manejar y
montar.

4. Preparacin de muestras

Tcnicas de preparacin para luz transmitida

4. Preparacin de muestras

Tcnicas de preparacin para luz transmitida


Montajes permanentes de muestras no vivas

Corte:

Los cortes se colocan en un porta de microscopa


limpio, generalmente flotndolos en una gota de
disolucin diluida de albmina, se calienta en una
placa hasta que la parafina se reblandezca (sin
fundir) para eliminar las arrugas en las secciones y
se deja secar en un sitio clido.

4. Preparacin de muestras

Tcnicas de preparacin para luz transmitida


Montajes permanentes de muestras no vivas

Tincin:

A las secciones cortadas en parafina se les debe


eliminar sta por inmersin en el disolvente
apropiado, tradicionalmente xileno.
Esto se sigue de una sucesin en aumento de
concentracin de disoluciones acuosas de etanol
hasta que la muestra est completamente
hidratada, ya que la tincin se suele aplicar en
medio acuoso.

4. Preparacin de muestras

Tcnicas de preparacin para luz transmitida


Montajes permanentes de muestras no vivas

Tincin:

Una vez que el soporte de la parafina se ha


eliminado no se debe permitir que la muestra se
seque porque se causaran daos por tensin
superficial.
La tincin explota la afinidad qumica entre el tinte y
las sustancias presentes en la muestra.
El uso sucesivo o combinado de varios tintes,
incluyendo la hematoxilina o eosina, cada uno con
su afinidad especfica, da una coloracin tricolor o
ms compleja a los diversos componentes tisulares.

4. Preparacin de muestras

Tcnicas de preparacin para luz transmitida


Montajes permanentes de muestras no vivas

Tincin:

La hematoxilina es un tinte bsico (catinico)


que se une electrostticamente a sitios cidos
(aninicos) de los cidos nucleicos (DNA y
RNA).
La eosina es un tinte cido (aninico) que se une
a las protenas, las cuales se vuelven catinicas
cuando la tincin se lleva a cabo a pH 4-5.

4. Preparacin de muestras

Tcnicas de preparacin para luz transmitida


Montajes permanentes de muestras no vivas

Tincin:

En el microscopio, las estructuras ricas en


cidos nucleicos, como los ncleos celulares,
tienen el color azul de la hematoxilina, mientras
que las regiones ricas en protenas del
citoplasma muestran la tincin roja de la eosina.

4. Preparacin de muestras

Tcnicas de preparacin para luz transmitida


Montajes permanentes de muestras no vivas

Tincin:

4. Preparacin de muestras

Tcnicas de preparacin para luz transmitida


Montajes permanentes de muestras no vivas

Tincin:

4. Preparacin de muestras

Tcnicas de preparacin para luz transmitida


Montajes permanentes de muestras no vivas

Tincin:

La forma ms especfica de tincin se da en la


inmunocitoqumica donde los marcadores se
unen especficamente a molculas objetivo
dentro de la muestra por reacciones
inmunolgicas.
La tcnica requiere anticuerpos especficos de la
sustancia en estudio junto con una manera de
localizar el anticuerpo usando un marcador
fluorescente u otro marcador.

4. Preparacin de muestras

Tcnicas de preparacin para luz transmitida


Montajes permanentes de muestras no vivas

Montaje:

El paso final en la preparacin de una muestra


es montarla en una lmina de vidrio,
generalmente de 25 mm x 76 mm, el
portaobjetos.
El material de montaje utilizado, el montante,
puede ser blsamo de Canad, glicerina,
aceites, lquidos acuosos, etc.
Una vez colocada la muestra en el portaobjetos
y con el montante, se cubre con una lmina,
disco o placa de vidrio fino, el cubreobjetos.

4. Preparacin de muestras

Tcnicas de preparacin para luz transmitida


Montajes permanentes de muestras no vivas

Montaje:

4. Preparacin de muestras

Tcnicas de preparacin para luz transmitida


Montajes permanentes de muestras no vivas

Montaje:

El grosor del portaobjetos, el del cubreobjetos y


el ndice de refraccin del material de montaje y
su adecuacin a la muestra, son factores que se
deben tener en cuenta.
El grosor del cubre es convencionalmente 0,17
mm.
El montante debe ser inerte o actuar como
preservativo frente a la degradacin de la
muestra dentro de la escala de tiempo de la
observacin.

4. Preparacin de muestras

Tcnicas de preparacin para luz transmitida


Muestras no biolgicas

Los materiales no biolgicos en partculas (como


granos de minerales) no requieren preparacin
anterior al montaje.
En situaciones en las que se requiere mantener la
distribucin de los granos (arcillas o cermicas
porosas) la muestra original se debe impregnar con
resina y preparar una lmina delgada.
Las secciones finas de materiales blandos como
polmeros se pueden preparar usando un
microtomo.

4. Preparacin de muestras

Tcnicas de preparacin para luz transmitida


Muestras no biolgicas

Las secciones finas de materiales duros (minerales,


rocas, cermicas, cermicas impregnadas con
resina) se preparan segn la secuencia de pasos
siguiente:
1) Se corta una lmina de 1 mm de grosor o se
desprende un fragmento del material original.
2) Se monta la lmina en un porta usando Lakeside
u otro cemento.
3) Se pule un lado de la lmina.

4. Preparacin de muestras

Tcnicas de preparacin para luz transmitida


Muestras no biolgicas
4) Se monta la lmina boca abajo en otro porta y se
retira el primero.
5) Se pule la parte superior hasta el grosor
requerido.
6) Se pega el cubre en la superficie superior.

4. Preparacin de muestras

Tcnicas de preparacin para luz reflejada


Preparacin inicial y montaje:

Para facilitar el manejo, por un lado, y para


proporcionar una superficie de muestra suficientemente
grande, por el otro, las dimensiones de la muestra
deben ser del orden de 5 a 15 mm en la superficie
preparada y de 1 a 10 mm de grosor.
El corte de esta muestra a partir de una pieza ms
grande de roca o de metal, por ejemplo, se debe hacer
con mucho cuidado.
En muchos casos la orientacin de la superficie de la
muestra (por ejemplo en relacin con la roca origen o el
componente metlico) es importante y debe quedar
registrada.

4. Preparacin de muestras

Tcnicas de preparacin para luz reflejada


Preparacin inicial y montaje:

Para el corte de la muestra lo ms apropiado y lo que


da lugar a una menor deformacin en la superficie de
corte es un abrasivo en hmedo como una rueda de
metal o bakelita impregnada con almina, nitruro de
boro, carburo de silicio o diamante.

4. Preparacin de muestras

Tcnicas de preparacin para luz reflejada


Pulido:

El pulido se lleva a cabo a mano usando tiras de papel


abrasivo o utilizando discos abrasivos montados en
una rueda con sucesivos grados de grit cada vez ms
finos, normalmente carburo de silicio para los grados
ms gruesos, y - y -almina y diamante para los
pulidos ms finos.
El carburo de silicio se utiliza entre 58 y 15 m de grit.
En las etapas finales el -almina de 10 a 1 m y la almina de unos 0,3 m o bien el diamante de 6 a 1
m.

4. Preparacin de muestras

Tcnicas de preparacin para luz reflejada


Tratamiento superficial:

Para muchos materiales (como rocas o cermicas) no


es necesario ms tratamiento y las fases
constituyentes pueden estar suficientemente reveladas
por sus diferencias de color, birreflectancia o textura
superficial.
Para los metales y
tratamientos de etching.

aleaciones

se

requieren

En cualquier caso todos los materiales deben


examinarse en las condiciones de recin pulido para
comprobar que no existen artefactos y detectar
inclusiones gruesas o porosidad que puedan influir en
el proceso de etching.

4. Preparacin de muestras

Tcnicas de preparacin para luz reflejada


Tratamiento superficial:

El etching se puede definir como un ataque selectivo


de los granos o de las fronteras interfase y/o el ataque
selectivo de las propias fases.
Los atacantes son disoluciones acuosas o alcohlicas y
mezclas de sales, cidos y bases, etc. Cuanto ms
resistentes a la corrosin son los metales y las
aleaciones, naturalmente requerirn disoluciones ms
agresivas.

4. Preparacin de muestras

Tcnicas de preparacin para luz reflejada


Tratamiento superficial:

El proceso de etching consiste simplemente en


sumergir la muestra en el atacante, o por electrolisis
hacer de la muestra el nodo de una cuba electroltica.
Generalmente se requiere un proceso de pulido final
despus del etching.