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Diagnstico Virolgico PCR y

pruebas rpidas: Gripe A.


Carlos Artaza Alvarez
MIR 4 Hospital Universitario
Fundacin Alcorcn

Reaccin en Cadena de la
Polimerasa
(RCP)
INTRODUCCION:
Dcada de los 70: Grandes avances en
Biologa Molecular:

Enzimas de restriccin
Clonacin de genes en plsmidos y fagos
Tcnicas de hibridacin en filtro para ADN y ARN
Tcnicas de secuenciacin qumica y enzimtica
ADN

INTRODUCCION
1983: Kary Mullis desarrollo una nueva
tcnica que hizo posible la sntesis de
grandes cantidades de un fragmento de
ADN sin necesidad de clonarlo: PCR
(polymerase chain reaction).
Consigui copiar millones de veces, en un
par de horas, una secuencia predeterminada
dentro de una mezcla de ADN.

PCR: Definicin

Sntesis "in vitro" de secuencias especficas de


ADN.
La tcnica se basa en la repeticin de ciclos de
sntesis de DNA dirigida por oligonucletidos
para realizar la replicacin en forma
exponencial de secuencias diana de cidos
nucleicos (Amplificacin del DNA).

AMPLIFICACION EXPONENCIAL DNA

PCR: Definicin
Es una tcnica:

Altamente especifica
Muy sensible: en principio, para practicarla
bastara una sola molcula (genoma humano)
~6 picogramos.
Robusta, utiliza como sustrato al ADN de
muestras sin necesidad de ser purificada de su
fuente natural (tejidos embebidos en parafina,
lavados bronquiales, exudados de mucosas, etc)

PCR: Componentes de la
Reaccin
1.
-

Enzima (DNA polimerasa):


Capaces de sintetizar DNA o RNA in
Vitro.
Requieren un molde y sintetizan una molcula
complementaria al molde.
Capaces de actuar a altas temperaturas
empleadas en la reaccin.
Inicialmente: DNA polimerasa de E. Coli
inestabilidad trmica (necesario agregar en
cada ciclo)

PCR: Componentes de la
Reaccin

Actualmente Enzimas termoestables: Taq


(Thermus acuaticus) y la Vent (Thermococcus
litoralis) T optimas: 72C.
Taq:
Protena de una sola cadena polipeptdica.
Peso molecular de 95 kDa.
Fidelidad de replicacin depende de la [Mg+2] y de
los dNTPs y del balance de estos.
Tasa de incorporacin de nucletidos: 150
nucletidos /seg.

PCR: Componentes de la
Reaccin
2. DNA molde:
- La concentracin de DNA molde depende de la
fuente utilizada.
- Idealmente: 20 nanogramos a 1 microgramo de
DNA genmico de clulas eucariotas.
- No es necesario purificar el DNA molde.
- Eliminar los inhibidores de la polimerasa.
- Para muestras clnicas: extraccin con fenolcloroformo y posterior precipitacin de cidos
nucleicos con etanol o isopropanol.

PCR: Componentes de la
Reaccin
3. Cebadores o iniciadores (Primers):
-Oligonucletidos sintticos
-Componente mas sensible que determina el xito de
la PCR.
-Se deben seleccionar dos iniciadores que estn
localizados en los extremos de la regin de inters.
- Longitud: 18 a 30 nucletidos ( < especificidad).
- Contenido: G+C entre 40-75%.
- Concentracin: 0.1 a 0,5 uM.
- Deben carecer de estructura secundaria.

PCR: Componentes de la
Reaccin
- No deben ser complementarios entre si.
- Existen programas informticos para el diseo de
cebadores.
- El extremo 3 del nucletido iniciador se fija a un
soporte slido (gel de slice) y un sintetizador de
DNA aade paso a paso cada nucletido en una
serie de etapas.

Maquina de genes: Construye cadenas de


oligonucletidos utilizados durante la PCR.
(Oligo 1000M DNA Synthesizer)

PCR: Componentes de la
Reaccin
4. Dexosirribonuclesidos trifosfatados
(dNTPs):
- Son los ladrillos con los que se construye las nuevas
cadenas de DNA.
- Cuatro: dATP, dTTP, dCTP y dGTP.
- Concentracin equimolar de los 4 dNTPs
- Concentracin ptima: 20 y 200 uM.
- Bajas concentraciones: < ndice de incorporacin.
- Altas concentracines: < especificidad

PCR: Componentes de la
Reaccin
5. Otros componentes:
- Solucin amortiguadora:
Incluye: HCl, KCl, gelatina y MgCl2.
Mantiene el pH ptimo para que la enzima acte.

- Agua:

Solvente del resto de componentes


Al menos destilada, purificada por UV y ozono
Libre de DNAsas y RNAsas
Desionizada

- Magnesio: Funcin critica:

Los iones de magnesio


estimulan a la enzima Taq
Polimerasa para que
incorpore los dNTPs.
Bajas concentraciones:
Bajo rendimiento
Exceso Mg:
amplificaciones
inespecificas

RCP: Etapas.
1. Desnaturalizacin DNA

Incubacin DNA molde (92-98C, de 30-90 seg)


Separacin de cadenas complementarias por
ruptura de los puentes de hidrgeno.
Cadenas DNA blanco accesibles al apareamiento.
Etapa crtica, importante DNA molde se
desnaturalice completamente

Desnaturalizacin del DNA

T: 92-98C
30-90 seg

RCP: Etapas.
2. Alineamiento

Enfriamiento de la reaccin
Hibridacin de cadenas desnaturalizadas con
cebadores o iniciadores (Primer: DNA sinttico de
hebras sencilla)
Temperatura optima (T de fusin) depende de
los cebadores (generalmente 50 a 60 C)

Alineamiento
T: 50-60C

RCP: Etapas.
3. Reaccin de extensin:

Se efecta a una temperatura intermedia: 72C


Acta la DNA polimerasa extendiendo la longitud
de los cebadores.
Incorpora los nucletidos libres en direccin 5
3 complementando la cadena que acta como
molde.

Reaccin de extensin
T: 72 C

RCP: Etapas.

Estas tres etapas constituyen un ciclo trmico y se


realizan en forma automatizada en un
TERMOCICLADOR

RCP: Etapas.

Protocolo tpico 30 a 50 ciclos


Al completar ciclo Fragmentos recientes
sirven de molde.
En pocos ciclos Fragmento sintetizado
producto predominante (amplificacin).
Longitud del fragmento DNA distancia entre
los cebadores.

RCP: Etapas.

Evitar un nmero alto de ciclos : dan lugar a la


amplificacin de productos originados por
hibridaciones inespecficas.
La enzima sufre el efecto meseta: exponencial
Aritmtica estacionaria.
Cuando el efecto meseta se presenta la cantidad
de DNA sintetizada es suficiente para su
utilizacin.

Tasa de produccin de DNA por PCR

Contaminacin en PCR:

La Reaccin en Cadena de la Polimerasa es una


tcnica muy sensible, por lo que es de gran
importancia evitar contaminaciones
Existen una serie de normas que ayudan a evitar
las contaminaciones:

Lugar fsico exclusivo para realizar la PCR


Uso de instrumental exclusivo para la PCR
Utilizacin de reactivos y tubos estriles
Uso de guantes
Controles blanco

Anlisis del producto de una


RCP:

Despus de la amplificacin:
DNA puede colocarse en gel de agarosa
Realizar el corrimiento electrofortico,
Teirlo y observar en luz ultravioleta el producto de
la RCP.

Anlisis del producto de una


RCP:

El anlisis mas fino y la caracterizacin


metodologas adecuadas:
Anlisis electrofortico en geles poliacrilamida.
Digestiones con enzimas de restricciones
Hibridacin con detectores especficos (genes
clonados)
Secuenciacin nucleotdica.

PCR:DESVENTAJAS
La PCR supuso un gran avance y permiti
introducir la biologa molecular de forma
generalizada en los laboratorios asistenciales.

El hecho que complica y alarga


extraordinariamente el proceso es la visualizacin
del producto una vez amplificado, que debe
hacerse por hibridacin en solucin o en fase
slida (southern blot).

PCR:DESVENTAJAS
De esta manera se tarda entre 2 a 4 das en
poder informar un resultado.
Se necesita disponer de personal altamente
especializado.
Espacio suficiente para poder separar varias
reas de trabajo con la finalidad de evitar la
temible contaminacin por ADN sintetizado
con anterioridad.

PCR A TIEMPO REAL


(PCR-RT)
La mayora de los inconvenientes se han
solucionado con la introduccin de la PCR
realizada en tiempo real (PCR-RT).
Elimina cualquier proceso post-PCR puesto
que monitoriza la progresin de la
amplificacin en el momento en que ocurre.

PCR A TIEMPO REAL


(PCR-RT)
A diferencia de la PCR convencional que
mide la acumulacin ADN al final de un
nmero predeterminado de ciclos, con PCRRT esto se hace durante el proceso de
amplificacin usando fluorescencia.
El aumento de la fluorescencia es
proporcional a la cantidad de ADN
formada.

PCR A TIEMPO REAL


(PCR-RT)
El proceso se puede automatizar fcilmente
usando un sistema que realice la
amplificacin (termociclador) y que a su
vez sea capaz de leer fluorescencia.
Dado que la amplificacin y la deteccin
ocurren al mismo tiempo, el anlisis es ms
rpido que en la PCR en punto final.

PCR A TIEMPO REAL


(PCR-RT)
La incorporacin de fluorescencia al
proceso de PCR se puede hacer de muy
diversas maneras, pero las ms utilizadas
son:

Colorantes intercalados
Sondas marcadas.

PCR A TIEMPO REAL


(PCR-RT)
Las sondas marcadas: son secuencias de
oligonucletidos que reaccionan por
complementariedad de bases con un
pequeo fragmento de la secuencia a
amplificar.
Estas sondas estn marcadas con molculas
que emiten fluorescencia (fluorforos)
cuando se produce la amplificacin
especfica.

PCR A TIEMPO REAL


(PCR-RT)
Las sondas se colocan en la reaccin de
PCR junto con los otros reactivos y
solamente se detecta fluorescencia, si la
secuencia de inters est presente en la
muestra y hay amplificacin.

PCR A TIEMPO REAL


(PCR-RT)
Las sondas fluorescentes ms usadas son de
tres tipos:

sondas con actividad 5 nucleasa (TaqMan)


molecular beacons y
Sondas FRET.

Las tres se pueden aplicar en microbiologa


clnica, aunque las sondas FRET son las
ms complejas.

Sondas Taqman

PCR A TIEMPO REAL


(PCR-RT)
Agentes intercalantes de ADN: otro
formato ampliamente utilizado.
El mas empleado es el SYBR Green.

El SYBR Green no emite fluorescencia cuando


se encuentra en solucin.
En presencia de ADN doble cadena, el SYBR
Green se intercala entre las cadenas de ADN
emitiendo as una seal fluorescente.

PCR A TIEMPO REAL


(PCR-RT)

Este fluorocromo se agrega a la reaccin de


PCR junto con los otros reactivos.
Si en la reaccin de PCR hay amplificacin, el
SYBR Green se une al ADN de doble cadena
recin sintetizado en cada ciclo y va generando
un aumento en la seal de fluorescencia que es
proporcional a la cantidad de producto
generado durante la amplificacin.

Aplicaciones de la PCR a tiempo real


en la microbiologa clnica
No difieren de las de la PCR convencional.
1 . Diagnstico etiolgico.
2 . Control del tratamiento con antimicrobianos.
3 . Caracterizacin gentica de agentes
infecciosos. Genotipificacin; identificacin de
mutaciones determinantes de resistencias a
frmacos o de virulencia; epidemiologa
molecular

Aplicaciones de la PCR a tiempo real


en la microbiologa clnica
No obstante, gracias a sus indudables
ventajas y a la sencillez de su empleo, la
PCR a tiempo real ha ido reemplazando la
PCR clsica
Su aplicacin se extiende a un nmero cada
vez mayor de agentes infecciosos,
implementndose progresivamente en la
rutina asistencial.

PCR:DIAGNOSTICO DE LA
GRIPE A
El virus de la gripe A(H1N1) deriva de
diferentes linajes que han circulado en
cerdos en el ltimo tercio del siglo XX.
Se tratara de un ejemplo ms del papel que
se sabe que desempea este mamfero como
mediador en el reagrupamiento gentico del
virus de la gripe A que posteriormente
acaba afectando a humanos.

PCR:DIAGNOSTICO DE LA
GRIPE A
El anlisis filogentico de los diferentes
fragmentos genmicos del virus A(H1N1)
muestra un cudruple origen.
En una fase final parece haberse producido
una modificacin del virus porcino AH1N1
(linaje clsico porcino norteamericano,
linaje aviar norteamericano y linaje
humanoH3N2).

Obtencin, conservacin y
transporte de las muestras
1. Tipos de muestras:

Con mejor rendimiento diagnstico:


frotis de nasofaringe
lavado o aspirado nasofarngeo

Menor rendimiento diagnstico


frotis nasal
frotis farngeo

Muestras inadecuadas
moco
saliva

Obtencin, conservacin y
transporte de las muestras
2. Conservacin y transporte

Perodos no superiores a 48-72 horas:


refrigeradas a 4 C. El transporte tambin ser
refrigerado (acumuladores de fro).
Perodos superiores: congeladas,
preferiblemente a -70 C. Se recomienda
mantener la congelacin durante el transporte.

Obtencin, conservacin y
transporte de las muestras
3. Condiciones de bioseguridad

Para el transporte y la manipulacin de las


muestras, se deben seguir las recomendaciones
especficas de un nivel de bioseguridad 2.

PCR-TR : GRIPE A
Componente del virus que detecta:

cidos nucleicos, utiliza cebadores y sondas


especficos para detectar un fragmento del gen de la
hemaglutinina y de la protena M2 de A(H1N1)v.

Tipo de ensayo:

PCR a tiempo real.

Tiempo de realizacin:

3-4 horas.

Amplificacin de un RNA mediante transcripcin inversa del RNA a


cDNA y posterior PCR con la DNA polimerasa de Thermus
thermophilus.

PCR-TR : GRIPE A
Sensibilidad de la prueba:

No est suficientemente evaluada, y depende de


varios factores:
a) Del sistema de extraccin del material gentico del
virus a partir de la muestra
b) de la propia tcnica: no todas las tcnicas de PCR son
equivalentes
c) de la experiencia de cada laboratorio.
d) de la muestra a evaluar: tipo de paciente, situacin
epidmica, etc.

PCR-TR : GRIPE A
Especificidad de la prueba:

Igualmente, no est evaluada adecuadamente.


Depende del tipo de muestra y de la experiencia
de cada laboratorio.
En la actual situacin epidmica, y en un
laboratorio de Microbiologa experimentado,
puede asumirse que supera el 98%.

PCR-TR : GRIPE A
Ventajas:
a)
b)

Sensible y especfica.
Rpida, aunque esta depender:
a)Disponibilidad de equipos humanos organizados y
bien entrenados, y
b)Volumen de muestras a procesar.

c)

Algunas variantes tcnicas permitiran la


cuantificacin de la carga vrica.

PCR-TR : GRIPE A
Inconvenientes:
a)
b)

c)

Requiere equipamiento especfico.


Requiere de la existencia y disponibilidad de
microbilogos bien entrenados.
Detecta genoma viral, pero no informa si
exista viabilidad del virus, por lo que no se
recomienda para monitorizar tratamientos, ni
evaluar la respuesta clnica.

PRUEBAS RAPIDAS:DETECCION
VIRUS RESPIRATORIOS
Deteccin de antgenos virales:

Permite una rpida obtencin de resultados,


generalmente en unas pocas horas despus de la
recepcin de la muestra.
Resultados a menudo son difciles de
interpretar.
La especificidad depender de la experiencia
del personal que los realice.
La sensibilidad suele ser baja.

PRUEBAS RAPIDAS:DETECCION
VIRUS RESPIRATORIOS

Mtodos utilizados para la deteccin de los


antgenos virales directamente en la muestra
clnica:
Inmunofluorescencia
enzimoinmunoanlisis (EIA)

Antgenos virales utilizados: molculas que se


sitan en la superficie del virus,
la hemaglutinina y
la neuraminidasa,

PRUEBAS RAPIDAS:DETECCION
VIRUS RESPIRATORIOS

Tambin pueden encontrarse en la superficie de


las clulas infectadas.
Es posible emplear otras protenas menos
accesibles del virus como las nucleoprotenas,
que son menos variables.

PRUEBAS RAPIDAS:DETECCION
VIRUS RESPIRATORIOS
Se han comercializado tcnicas:

Inmuno-cromatografa capilar y
Enzimoinmunoanlisis de membrana

Posibilitan detectar virus gripales o sus


antgenos en pocos minutos y su lectura es
visual.

PRUEBAS RAPIDAS:DETECCION
VIRUS RESPIRATORIOS
Amplia implantacin en la asistencia
urgente y en el mbito peditrico
No obstante, su utilidad se ve limitada
debido a su coste y bajas sensibilidad y
especificidad.

Diferentes Pruebas de deteccin rpida de


antgenos disponibles para virus gripales

GRACIAS

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