Ao de la Consolidacin del Mar de Grau

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CALLAO

SEDE CAETE

TEMA: OBSERVACIN DE MICROORGANISMOS EN FRESCO Y

COLORACIN SIMPLE
FACULTAD
CURSO
DOCENTE

: INGENIERA AMBIENTAL Y DE RR. NN

: MICROBIOLOGA GENERAL
: Blgo. CARLOS TOME RAMOS

INTEGRANTES

CICLO

:V

FECHA

: 22/04/16

2016

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1. INTRODUCCIN
La observacin microscpica puede efectuarse mediante el examen
en fresco de una suspensin microbiana, lo que permite visualizar
microorganismos vivos y reconocer sus movimientos, apreciar sus
distintas formas, tamaos y agrupaciones, o bien, mediante un
extendido o frotis coloreado, lo que posibilita, segn la tcnica
utilizada, diferenciar microorganismos, observar su morfologa,
tamao y agrupacin o la observacin de ciertos elementos no
habituales, como flagelos, capsula o endosporas.

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2. OBJETIVOS:
Adquirir destreza en la preparacin de la muestra para la observacin
de clulas vivas.
Adquirir destreza en la preparacin de muestras coloreadas para la
observacin al microscopio.

3. MARCO TERICO:
3.1 MICROSCOPIO:
Las partes de un microscopio Los dos sistemas de lentes de un
microscopio ptico compuesto se denominan lente objetivo, la que est
ms cercana al espcimen, y lente ocular, que est en la pieza del
ocular del microscopio. Los microscopios modernos llevan la fuente de
luz incorporada. En la Figura 3.6 se puede observar el recorrido de la
luz desde la fuente luminosa, en la base del microscopio, hasta el ojo
del observador. La luz pasa frecuentemente a travs de un filtro azul
(para eliminar Iongitudes de onda largas) y a travs de otra serie de
lentes que constituyen el condensador. El condensador tiene como
funcin dirigir la luz sobre el espcimen, donde parte de la misma es
absorbida y parte difractada. La luz transmitida entra en la lente
objetivo, que forma una imagen en el tubo del microscopio.
Posteriormente la lente ocular aumenta la imagen y la proyecta en la
ltima lente de la serie la de nuestro propio ojo. El ojo forma una
imagen en la retina y el cerebro la percibe.
Un microscopio compuesto ordinario proporciona una iluminacin
de campo claro. Esto es debido a que el condensador dirige la luz
a travs del espcimen, y el fondo queda iluminado de forma brillante.
Los microscopios compuestos pueden ser modificados para ver un
espcimen mediante (1) contraste de fases, (2) campo oscuro, (3)
fluorescencia, o (4) por contraste diferencial de interferencia
(Nomarsky); todos estos mtodos se describirn ms tarde.

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Poder total de aumento Casi todos los microscopios compuestos

posee varias lentes objetivos, cada una con un poder de aumento
diferente. Normalmente, existe una lente de bajo poder (objetivo dbil
seco) que aumenta un objeto 10 veces (l0x), una de alto poder
(objetivo fuerte seco), que aumenta 40 veces (40x) y el objetivo de
inmersin, 100 veces (l00x). Casi todas las lentes del ocular
proporcionan un aumento adicional de 10 veces (l0x). Se puede
calcular el poder total de aumento de un microscopio multiplicando cl
aumento que proporcionan las dos lentes, objetivo y ocular, en uso.
Casi todos los microorganismos requieren, antes de ser examinados en
un microscopio ptico, una preparacin especial; esto es debido a que
poseen poco contraste natural. La preparacin y la tincin (tratamiento
con colorantes) de un espcimen son fundamentales si se desea
obtener buenas imgenes. Muchas dcadas de esfuerzos y errores han
conducido a mtodos generales de preparacin que resultan idneos. A
continuacin
describiremos
la
observacin
en
fresco
de
microorganismos vivos y varios tipos de tinciones.
Tabla
3.1.
Aumento Total
Microscopio
Microscopios
pticos
Debil seco
Fuerte seco
Aceite de inmersin

Lente
objet
ivo

Lente
ocular

Ampliaci
n total

10x

x 10x

l00x

40x

x 10x

400x

100x x 10x

1000x

Microscopios
electrnicos
Transmisin (MET)

~200000x

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Barrido (MEB)

El
El
luz
La

la

~10000x

camino de la luz en el
microscopio compuesto. La
luente de luz est en la base.
condensador enfoca el haz de
sobre el espcimen, donde
parte se absorbe, parte se
refracta, y parte se transmite.
luz transmitida penetra en la
lente objetivo, que aumenta la
imagen. El prisma hace que la
imagen se forme en el tubo del
microscopio, haciendo la visin
ms cmoda. La lente ocular
vuelve a aumentar la imagen y
enfoca en el ojo.
3.2
Preparaciones
fresco:

en

La forma ms simple de
preparar un espcimen
para
su
examen
microscpico
es
hacer
una preparacin
en
fresco. Existen
dos
tcnicas, una preparacin en fresco simple ("entre porta y cubre")
consiste en colocar una gota de lquido con los microorganismos sobre
un portaobjetos y a continuacin cubrirla con un cubreobjetos.
Una preparacin en gota pendiente se realiza colocando una gota del
material en un cubreobjetos y cubrindolo con un portaobjetos
(invertido) con una excavacin central (portaobjetos excavado).
Las preparaciones en fresco se utilizan para observar microorganismos
vivos. Por ejemplo, para la bsqueda de Trichomonas vaginalis en

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secreciones vaginales. Este protozoo de gran movilidad causa

inflamacin de la vagina y la uretra. Si en la preparacin se observan
clulas en forma de huso que se mueven mediante contracciones o
sacudidas cruzando el campo, probablemente se tratar de T.
vaginalis, pudindose efectuar el diagnstico.
Sin embargo, el inconveniente de la observacin en fresco es que no
permite aumentar el contraste de la preparacin. Por tanto, su uso, con
un microscopio ptico de campo claro, est bastante limitado.
Normalmente, para observar microorganismos vivos se utiliza alguno de
los otros microscopios pticos que hemos mencionado anteriormente.

El microscopio compuesto tiene tres lentes objetivos (tres sistemas de

lentes). Se muestra el mismo campo de Bacillus subtilis visto con el
objetivo dbil seco (100x), fuerte seco (400x), y con el de inmersin
(l000x). Los aumentos mayores revelan progresivamente ms detalle de
una porcin de campo menor.
Preparacin en gota pendiente. Esta preparacin se realiza colocando una
gota de la suspensin bacteriana en un cubreobjetos en el cual se ha hecho
previamente un crculo con vaselina o parafina (a). La vaselina acta como
sellador. (b) Sobre el cubreobjetos se coloca un portaobjetos con una

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excavacin central que queda adherido

gracias a la vaselina (c). Se invierte la
preparacin y se observa colocndola en la
platina
del
microscopio
(d).
Las
preparaciones en gota pendiente se utilizan
para observar microorganismos vivos.

3.3 Tinciones:
El microscopio de campo claro es ms til para la observacin de
especmenes teidos. Los colorantes son compuestos qumicos
utilizados para aumentar el contraste. Existen algunos,
llamados colorantes vitales, que pueden aadirse directamente a
una preparacin en fresco; por tanto, colorean clulas vivas. No
obstante, la mayora de los colorantes son solamente efectivos
despus de que los microorganismos hayan sido fijados, es decir,
se encuentren muertos y adheridos al portaobjetos. Para la fijacin
por calor, se realiza una fina extensin de una gota de muestra
lquida sobre un portaobjetos y se deja secar al aire; a
continuacin, se pasa la preparacin de Forma rpida sobre la
llama de un mechero. El calor de la llama mata las clulas
microbianas por desnaturalizacin de sus protenas. Las protenas
coaguladas unen las clulas al porta. Cuando se desea fijar
especimenes delicados se utiliza la fijacin qumica, va que es
menos lesiva que el calor. Para ello se aade una gota del fijador,
por ejemplo, cido smico, formaldehdo, o glutaraldehdo, sobre
la muestra lquida con los microorganismos.
La fijacin posee algunos inconvenientes. Por ejemplo, a menudo
distorsiona la apariencia real de las clulas, lo cual dificulta la
identificacin; adems, no permite la observacin del movmiento
de los microorganismos. Despus de la fijacin, se aade el

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colorante, que debe permanecer el tiempo suficiente en contacto

con el espcimen, para que pueda ser absorbido. A continuacin,
se retira el exceso de colorante, normalmente lavando con agua.
Tipos de colorantes Casi todos los colorantes son sales,
compuestos formados por iones cargados. Los colorantes bsicos
son aquellos en los cuales el agente que tie es el ion cargado
positivamente, mientras que en los cidos, el colorante es el ion
cargado negativamente. Los colorantes ms utilizados son los de
tipo bsico, va que la mayor parte de las clulas microbianas
Poseen cargas dbilmente negativas en su superficie, lo cual
facilita su unin. Entre los colorantes bsicos ms comunes se
encuentran la safranina, la fucsina bsica, el cristal violeta y el
azul de metileno. Los colorantes cidos se unen a las partes de las
clulas cargadas positivamente. Se utilizan para teir tejidos
animales infectados con microorganismos. Entre los ms
frecuentes estn la eosina, la fucsina cida y el rojo Congo.

TABLA 3.2 Tcnicas de tincin para bacterias

Tincin

Uso

Tcnicas

Tinciones
simples

Un colorante; proporciona
contraste para observar
mejor
un
organismo
completo

Se tie con un colorante

bsico (azul de metileno,
cristal violeta, o fucsina
bsica) durante unos 5
minutos.
Aclarar
brevemente con agua. Se
tien
casi
todas
las
bacterias; la mayora de
los tejidos no se tien.

Tinciones

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diferenciale
s
Tincin
Gram

de Dos o ms colorantes;
distingue entre bacterias
Gram positivas y Gram
negativas

Se cubre la preparacin de
bacterias
fijadas
con
cristal violeta y despus
con una solucin de iodo
(mordiente).
Todas
las
clulas quedan tenidas de
color violeta oscuro. Se
decolora con acetona al
95%.
Las clulas Gram positivas
permanecen tenidas, pero
las negativas pierden el
colorante. Se tie con
safranina (contraste). El
color violeta de las Gram
positivas se vuelve ms
oscuro
y
las
Gram
negativas se tien de
rosa.

Tincin de
cidoalcohol
resistencia
(ZiehlNeelsen)

Dos colorantes; distingue

entre las mico bacterias
(cido-alcohol
resistentes) y el resto de
las bacterias

Se tien las clulas con

fucsina
bsica
y
se
calienta a emisin de
vapores
durante
5
minutos.
Todas
las
bacterias se tien de rojo.
Se decolora brevemente
con
una
mezcla
de
alcohol-HCl. Las bacterias
resistentes
permanecen
teidas de rojo; todas las
dems se decoloran. Se
trata con el colorante de
contraste
azul
de
metileno. Las bacterias
cido-alcohol resistentes
continan tenidas de rojo,

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las otras se tien de azul.

Tinciones
especificas
Tincin de Tie selectivamente las Se cubre la preparacin
esporas de endosporas
con verde de malaquita y
Wirtzse calienta a emisin de
Cortitlin
vapores
durante
60
segundos. Se lava con
agua durante 30 segundos
y se tie con safranina.
Las endosporas retienen el
color verde; el resto de la
clula toma el color rosa.
Tincin de Permite
flagelos de flagelos
Leifson

Tincin
negativa

observar

los A las clulas previamente

fijadas, se le aade una
mezcla de cido tnico
(mordiente)
y
del
colorante rosanilina. El
mordiente engruesa los
flagelos y el colorante los
fine.

Revela la presencia de Se utiliza tinta china o

cpsulas
nigrosina para teir una
preparacin en fresco del
espcimen. Las partculas
de colorante no pueden
penetrar en la cpsula,
que se observa como una
regin clara alrededor de
la clula.

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4. PARTE EXPERIMENTAL:
4.1 MATERIALES:
Microscopio
Lminas portaobjetos
Lminas cubreobjetos
Azul de metileno
Goteros
Chicha de jora

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4.2 PROCEDIMIENTO:
1. Preparaciones en fresco y fijacin con un
mordiente.
A. OBSERVACIN DE MICROORGANISMOS EN AGUA ESTANCADA Y/O
FERMENTO.

En una lmina portaobjetos colocar una gota de la muestra.

Colocar una laminilla cubre objetos y observar con objetivo de
10X y 40X.
Dibujar los microorganismos que observa.
Aadir una gota de lugol en la preparacin, observar con
objetivo de 10X y 40X y dibujar el nuevo aspecto de los
microorganismos.
B.- OBSERVACIN DE LEVADURAS AL MICROSCOPIO.

Las levaduras son seres vivos, unicelulares que se reproducen

asexualmente mediante un proceso conocido como gemacin
que consiste en la formacin de brotes o yemas que luego se
desprenden de la clula original para formar un nuevo organismo
independiente. Es posible observar las levaduras al microscopio
y, en algunos casos, detectar los brotes que estn en proceso de
formacin.
Colocar en una lmina portaobjetos una gota de un
fermento (chicha) o de una suspensin acuosa de
levaduras.
Colocar una laminilla cubre objetos y observar con
objetivo de 10X y 40X.
Dibujar las levaduras.
Aadir una gota de lugol en la preparacin, observar
con objetivo de 10X y 40X y observar su nuevo aspecto.

2. Coloracin Simple:

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Consiste en la aplicacin de un colorante luego de fijada la

preparacin. Pueden emplearse los siguientes colorantes bsicos:
azul de metileno, cristal violeta o fucsina fenicada. Estos presentan
diferente afinidad por las bacterias y por ello los tiempos de
aplicacin sern distintos.

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