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Mtodos en Biologa Celular

Mtodos de transferencia de protenas a filtros


Mtodos de transferencia a filtros : 'dot blot', 'slot blot', 'western blot'
Introduccin : aplicacin directa vs. transferencia electrofortica.
Electroblotting
Tincin de protenas en el filtro
Introduccin
Tincin de protena total
Inmunotincin
Introduccin
Bloqueo
Elecccin del sistema de anticuerpos
Secundario / proten A / protena G
Sistemas de revelado
Enzimas
- Peroxidasa de
rbano
- Fosfatasa alcalina
Radioqumicos
Oro coloidal

Mtodos de transferencia a filtros


Introduccin : aplicacin directa vs. transferencia electrofortica
La transferencia de protenas o 'blotting' supone la inmovilizacin
de las protenas sobre membranas sintticas, seguido de la
deteccin empleando sistemas especialmente diseados para la
tincin de 'blots'. El mtodo ms potente es el denominado
'Western blot' en el que las protenas son separadas en primer
lugar mediante electroforesis en geles de poliacrilamida y
posteriormente se transfieren mediante la aplicacin de un
campo elctrico perpendicular al gel a una membrana. El
procedimiento es anlogo al desarrollado por el Prof. E. Southern
('Southern blotting') y por ello se le denomin 'Western'. Hay sin
embargo otros mtodos de transferir o aplicar protenas sobre
una membrana. El ms sencillo es aplicarlas directamente en
forma de una pequea gota de una solucin concentrada sobre
la membrana. La absorcin de la gota provoca la adhesin de la
protena a la membrana, quedando en forma de una mancha o
'dot' (es el caso del 'dot blot'. Existen dispositivos que facilitan la
aplicacin de las protenas directamente a la membrana,
aplicando una succin que facilita la penetracin de la solucin, y

reciben los nombres de 'dot blot' o 'slot blot' en funcin de que la


protena quede aplicada en forma de una gota circular o de una
lnea. En la imagen puedes ver dos de estos dispositivos.
Trabajar con las protenas fijadas sobre una membrana tiene ventajas sobre el
emplearlas dentro del propio gel :

son ms rpidas de teir y desteir.


no se produce tincin de los amfolitos en los geles de isoelectroenfoque.
se detectan cantidades menores de protenas pues se concentran en la
superficie y no se diluyen en todo el espesor del gel.
el 'blot' es un registo conveniente y cmodo de manipular del gel.
las membranas son mucho ms fciles de manipular que el propio gel

Todo procedimiento de 'blotting' consta de 5 etapas :

Inmobilizacin de protenas sobre la membrana ya sea mediante


transferencia (electrofortica, aspiracin, presin, ...) o mediante
aplicacin directa.
Saturacin de todos los lugares de unin de protenas de la membrana
no ocupados para evitar la unin no especfica de anticuerpos, que son
protenas.
Incubacin del 'blot' con anticuerpo primarios contra la/s protena/s de
inters.
Incubacin del 'blot' con anticuerpos secundarios, o reactivos que actan
de ligando del anticuerpo primario unidos a enzimas u otros marcadores.
Las bandas de protenas marcadas con enzimas se hacen visibles por
incubacin con los sustratos apropiados para formar productos
coloreados insolubles en el lugar donde se encuentran las bandas de
protena.

Hay tres mtodos para transferir protenas a las membranas :


1. Transferencia capilar
2. Transferencia por difusin
3. Transferencia electrofortica ('electroblotting')

En el caso de los geles de poliacrilamida el mtodo de eleccin es la


transferencia elestrofortica. La transferencia es mucho ms efectiva si se
realiza aplicando una diferencia de potencial entre el gel y la membrana.
- arribaElectroblotting

En este mtodo, descrito por Towbin, las protenas son transferidas


desde el gel a la membrana electroforticamente. La ventaja de
este proceso es su corta duracin (de 30 min a pocas horas), lo
que reduce notablemente el efecto de difusin de las bandas. El
procedimiento se inicia apilando sucesivamente sobre una esponja
plana papel de filtro empapado en tampn de transferencia, el gel,
la membrana en contacto directo con el gel, ms papel de filtro y
finalmente una esponja plana. Este conjunto se recoge entre dos
capas de plstico perforado y se introduce en un tanque en el que
se encuentra una solucin salina (tampn de transferencia) y dos
electrodos planos (diseados para conseguir un campo uniforme en
toda la superficie del gel). Se dispone de forma que el gel quede
hacia el nodo (-) y la membrana hacia el ctodo (+). La carga neta
de las protenas en el caso de los geles de SDS-PAGE es positiva
debida a la carga del SDS.
La electroforesis se realiza a 8-10 V/cm (de separacin entre electrodos), que
suele corresponder a 0.3 a 2. Amp de 1 a 4 h. La velocidad de transferencia es
inversamente proporcional al tamao de la protena.
El proceso provoca un fuerte calentamiento de la solucin por lo que se
recomienda refrigerar el sistema y recircular el tampn.
Una vez realizada la transferencia la membrana se puede analizar
inmediatamente o bien conservarla en frio (2 a 8C) durante meses.
Existen diferentes combinaciones de soluciones de transferencia y de
membranas para cada aplicacin. En la tabla siguiente se incluyen algunas de
las ms caractersticas.
Tabla : Condiciones de elestroblotting ms comunes.
Gel

Tampn de transferencia

Membrana
Nitrocelulosa

SDS-PAGE (Lammli)
O'Farrell 2D

25 mM Tris, 192 mM glycina,


20% v/v metanol, pH 8.3

Papel de intercambio
inico
PVDF

SDS-PAGE
O'Farrell 2D

Nitrocelulosa, Nylon, Papel


25 mM Tris, 192 mM glicina, pH de intercambio inico,
8.3
PVDF, papel diazomodificado

Native PAGE
25 mM fosfato sdico, pH 6.5
(protenas acdicas
15 mM borato sdico, pH 9.2
o bsicas)
IEF, Native-PAGE
(protenas bsicas), 0,7% cido actico
geles de urea cidos

papel diazo-modificado
papel diazo-modificado
Nitrocelulosa, Nylon, papel
diazo-modificad

El grosor del gel es un factor que influye notablemente en la transferencia,


siendo muy ineficiente a partir de geles de 2 mm de espesor, y tanto ms
eficiente cuanto ms fino es el gel, con un lmite debido a los problemas de
manipulacin en torno a los 0.4 mm.
La membrana que se emplea ms frecuentemente es la nitrocelulosa, aunque
cuando se requieren soportes ms robustos, por ejemplo cuando la membrana
ha de ser reutilizada diversas veces se recurre al Nylon. sin embargo las
membranas de Nylon se bloquean con ms difciultad que las de nitrocelulosa y
suelen presentar mayor 'background'. Las membranas de PVDF tienen gran
capacidad de unin a protenas y gran resistencia mecnica pero se
humedecen con ms dificultad.
Todas las membranas son hidrofbicas y requieren un tratamiento previo con
metanol antes de sumergirlas en soluciones acuosas.
Es importante incorporar en el gel a transferir un control de la transferencia que
habitualmente es el propio carril donde se han cargado los marcadores de peso
molecular que al transferirlos se tien sobre el filtro para ver si la transferencia
de toda la gama de pesos moleculares ha sido correcta.
Existen algunas variantes a la transferencia electrofortica descrita
previamente. El sistema ms extendido es el 'Semi-Dry blotting' en
el que los geles son sometidos a una intensidad de corriente
elevada entre dos electrodos planos entre los que se coloca una
pila formada por papel, el gel, la membrana y ms papel,
empapados en tampn de transferencia. El nico lquido que hay
es el que empapan los papeles. La ventaja de este sistema es su
rapidez, consiguiendo transferencias en pocos minutos.
- arriba Tincin de protenas en el filtro
Habitualmente se emplean tcnicas de tincin de protenas sobre el filtro como
control de la transferencia. Existen diferentes mtodos para teir todas las
protenas presentes en el filtro, pero los que ms inters despiertan son los
mtodos de tincin de protenas especficas a partir de mezclas complejas
separadas en geles y transferidos a filtros, son los mtodos de tincin
especficos, usualmente basados en mtodos inmunoqumicos.
Protena total
Colorantes
Los colorantes que permiten teir las protenas en los geles de poliacrilamida
no son utilizables en los filtros pues se unen inespecficamente a stos. Para
teir las protenas en los filtros se emplean : Ponceau S, Tintsa china o Negro
Amido.

Ponceau S se emplea en forma de solucin acuosa. La tincin es rpida pero


no es permanente y puede desaparecer en el procesamiento posterior. Como la
tincin desaparece es compatible con casi todos los procedimientos de
deteccin con anticuerpos.
El mtodo de tincin de filtros con tinta china es reproducible, sensible y
permanente, y no interfiere con los procedimientos de inmunodeteccin, pero
puede tapar la tincin colorimtrica del proceso inmunoqumico. La tincin se
basa en la adherencia preferente de las partculas coloidales de carbn de la
tinta sobre las protenas inmovilizadas. Ladestincin se hace en PBS.
El negro amido es menos sensible que la tinta china. Las bandas aparecen
negras sobre un fondo azul claro. Despus de la tincin se destie con una
solucin de metanol/cido actico. Este mtodo de tincin es incompatible con
la inmunodeteccin posterior.
- arriba Tincin mediante biotina-estreptavidina
Este mtodo de tincin se basa en la afinidad de la estreptavidina
por la biotina. Los grupos amino primarios y secundarios de las
protenas unidas a la nitrocelulosa se pueden biotinilar empleando
un derivado N-hidroxido succinimida de la biotina que contiene un
brazo espaciador hidrofbico. Un lavado posterior elimina el exceso
de biotina y despus se bloquea la membrana con una solucin de
leche en polvo. Las protenas biotiniladas pueden ser detectadas
empleando un complejo preformado de estreptavidina-enzima y el
sistema de deteccin de la actividad enzimtica.
- arriba Tincin mediante oro coloidal
Existen productos comerciales como AuroDye-R de Amersham que acta como
colorante para protenas sobre filtros. Se trata de una solucin coloidal
estabilizada de oro a pH 3. A este pH las partculas de oro estn cargadas
negativamente y se unen especficamente a las protenas. No se puede usar
sobre membranas de Nylon pues se une no especficamente a las cargas de la
membrana. El color obtenido es rojo oscuro. Existen sistemas de amplificacin
de seal.
Este mtodo tiene una sensibilidad similar al de la tincin con plata de los
geles.
- arriba Deteccin especfica de protenas en filtros
Introduccin

Una protena especfica puede ser identificada y visualizada en


un 'Western blot' empleando tcnicas de inmunodeteccin. Estas
tcnicas emplean la capacidad de reconocimiento de los
anticuerpos a sus antgenos. En 'Western blot' se emplea
comunmente el sistema de inmunodeteccin indirecta que se
representa en la figura. En este mtodo se emplea un anticuerpo
primario para localizar la protena de inters. Un segundo
anticuerpo, marcado con un enzima, y contra la especie en la
que se ha producido el primero, se emplea para localizar donde
se formaron los complejos antgeno-anticuerpo. Este anticuerpo
secundario se puede marcar de formas muy diversas con el fin
de producir una seal detectable (por ejemplo una seal sobre
una pelcula radiogrfica o una mancha de color en el filtro). En
ocasiones se emplean en lugar del anticuerpo secundario
protena A o protena G.
- arriba Bloqueo de la membrana
Una etapa comn a todos los procedimientos de inmunodeteccin es el
bloqueo, para prevenir la unin no especfica del sistema de deteccin a la
membrana, con el riesgo asociado de tener un elevado 'background' o falsos
positivos.
Se han descrito numerosas soluciones bloqueantes, y todas ellas son
efectivas. El factor esencial a tener en cuenta es elgegir un sitema de bloqueo
compatible con el sistema de deteccin empleado. Por ejemplo, las soluciones
de bloqueo que contienen leche desnatada contienen una gran cantidad de
carbohidratos complejos, y por ello deben descartarse cuando se van a
emplear anticuerpos que reconocen determinantes en carbohidratos, o por
ejemplo se ha de evitar el uso de suero completo si en la deteccin se emplea
protena A o protena G.
Las dos soluciones de bloqueo que son compatibles con casi cualquier sistema
de deteccin son las soluciones de leche desnatada y las soluciones de
albmina srica bovina (BSA). Tambin se recomienda el bloqueo en Tween-20
si hay demasiado 'background'. Sin embargo es conveniente usar con cuidado
los detergentes no inicos como Tween-20 pues pueden solubilizar las
protenas transferidas al filtro.
En la tabla siguiente se recogen algunas de las soluciones de bloqueo ms
comunmente empleadas :
Tabla : Soluciones de bloqueo ms comunes en 'Western blotting'
Agente
Caractersticas
bloqueante
5% de leche desnatada en PBS /TBS. Muy econmico. Con
Leche en polvo poco 'background'. Se deteriora con rapidez. Es posible que
tape algunos antgenos.

Econmico. 5% de leche desnatada en PBS/TBS - 01%


Tween-20. Con poco 'background'. Se deteriora con rapidez.
Es posible que tape algunos antgenos.
0.1% Tween-20, 0.02% azida sdica en PBS/TBS.
Tween-20
Econmico. Permite la tincin despus de la
inmunodeteccin. Puede quedar un 'background' residual.
3% BSA, 0,02% azida sdica en PBS. Bueno. Relativamente
BSA
econmico.
10% suero de caballo, 0,02% azida sdica en PBS. Sin
Suero de caballo 'background'. Moderadamente caro. Incompatible con algunos
anticuerpos anti-inmunoglobulinas.
Leche / Tween20

- arriba Eleccin del sistema de anticuerpos.


El tipo de anticuerpos empleado en la deteccin de las protenas transferidos a
filtro no es determinante. Existen tanto excelentes anticuerpos policlonales con
alta especificidad y sensibilidad como monoclonales. Sin embargo los
monoclonales se pueden obtener en mayor cantidad y mantienen siempre sus
propiedades de reconocimiento independientemente del lote.
Una vez elegido el anticuerpo a emplear se deben realizar controles en el
experimento, como por ejemplo la inclusin de un experimento completo
idntico con suero pre-inmune, y con el secundario empleado en la deteccin.
- arriba Secundarios / protena A/ protena G
Como anticuerpos secundarios se suelen emplear anticuerpos obtenidos
inoculando en la especie productoras inmunoglobulinas de la especie a
detectar (anticuerpos anti-especie). Tambin se emplean los fragmentos Fab2,
producidos mediante digestin con pepsina de los anticuerpos puros, y que, al
carecer de regin Fc no interfieren con algunos componentes de los tejidos que
pueden estar presentes en las muestras biolgicas complejas, reduciendo el
'background'.
Tanto la protena A como la protena G son protenas que se aislan de la pared
celular de bacterias y que tienen la capacidad de unirse a la regin Fc de los
anticuerpos. Ambas pueden ser marcadas con facilidad con enzimas y otros
marcadores. La protena G tiene una capacidad de reconocimiento ms amplia
que la protena A.
- arriba Eleccin del sistema de revelado
Existen tres grandes grupos de marcadores o sistemas de revelado empleados
en 'Western blotting' :

enzimas, que catalizan una reaccin en la que se forma un precipitado


coloreado, o en la que se emite luz.
radioqumicos, que emiten radiaciones ionizantes
oro coloidal, que acumulado localmente produce un color rojizo, y que
puede actuar como catalizador para la deposicin de plata, con lo que se
incrementa la seal.
- arriba Enzimas

Los dos enzimas ms empleados para marcar protena A o G o anticuerpos son


la peroxidasa de rbano y la fosfatasa alcalina.
Peroxidasa de rbano (HRP)
La peroxidasa de rbano (HRP) se emplea con gran frecuencia. Se dispone de
sustratos que forman un precipitado coloreado as como de sustratos
quimioluminiscentes.

sustratos colorimtricos. Se basan en la formacin de un producto


coloreado insoluble que precipita sobre la membrana en el lugar de
accin del enzima. Se han descrito tres sustratos para la HRP.
3,3' diaminobenzidina (DAB).
En presencia de perxido de oxgeno ls polimerizacin oxidativa
y el ciclado de la DAB por accin de la HRP produce la aparicin
de un precipitado marron. Se puede intensificar la reaccin
aadiendo iones de Cobalto o de Niquel, que provocan un
cambio de color del precipitado de marrn a gris-negro. La
reaccin es muy rpida y es fcil que se desarrolle en exceso
provocando un elevado 'background' en el filtro. DAB es una
molcula de accin carcinognica y es necesario tomar
precauciones para su manipulacin.
3,3',5,5' tetrametilbenzidina (TMB)
Es un sustrato alternativo para la DAB, ms sensible antes de la
amplificacin con metales. Se forma un precipitado azul. Sin
embargo su uso es reducido pues el precipitado es semisoluble
en agua y desaparece con facilidad en algunas condiciones.
Actualmente se dispone de nuevas formulaciones del sustrato
que producen productos ms estables.
4-cloro-1-naftol
En presencia de HRP y de perxido de hidrgeno el cloronaftol
produce un precipitado azul-negro. La reaccin es fcilmente

controlable, aunque es relativamente insensible cuando se


compara con DAB o TMB.
sustratos quimioluminiscentes. La reaccin
quimioluminiscente ocurre cuando la energa de una
reaccin qumica se emite en forma de luz. Se emplea la
peroxidasa de rbano (HRP) para catalizar la oxidacin del
luminol en presencia de perxido de hidrgeno.
Inmediatamente despus de la oxidacin el luminol se
encuentra en un estado excitado del que pasa a la situacin
basal, reducida, ms estable, emitiendo luz. La luz emitida
tiene una longitud de onda de 428 nm, con un mximo de
emisin entre 15 y 20 minutos despues de iniciada la
reaccin y una emisin que se puede prolongar de 2 a 3
horas. Si esta reaccin se produce sobre una membrana en
contacto con una pelcula de autorradiografa sta queda
impresionada. Este sistema tiene la ventaja de que permite
eliminar el sistema de anticuerpos secundarios ('striping') y
volver a analizar la membrana con otros anticuerpos
('reprobing').
- arriba Fosfatasa alcalina

La fosfatasa alcalina tiene una accin similar a la peroxidasa de rbano. Se han


descrito asimismo sustratos colorimtricos y sustratos quimioluminiscentes.
Los sustratos colorimtricos de la fosfatasa alcalina son :

bromocloroindolil fosfato / nitroblue tetrazolium (BCIP/NBT). Forma un


precipitado azl-prpura- Es el resultado de la desfosforilacin y
posterior oxidacin de BCIP a indigo, acoplada a la reaccin de NBT a
diformazon. La reaccin es progresiva lo que facilita el control de la
misma ajustando el tiempo de desarrollo.
Naftol-AS-MX fosfato / Fast red (NAMP/FR) y naftol-AS-BI-fosfato / Fast
Red TR (NABP/FR) Las dos parejas de productos conforman dos
sustratos que se transforman en un precipitado insoluble de color rojo.
Este sistema es menos sensible que el anterior (BCIP/NBT) pero el color
obtenido tiene un mejor contraste con la membrana.
AP mistly purple / AP liquid purple. Son productos comerciales
(Amersahm, composicin exacta no conocida) con propiedades de
sustrato especficas para la fosfatasa alcalina. Se forma un precipitado
intensamente prpura que no desaparece con el tiempo.

El sustrato quimioluminiscente de la fosfatasa alcalina es el 3(2'spiroadamantane)-4-methoxy-4-(3'phosporyloxy)-phenyl-1,2dioxetane. Despus de la desfosforilacin el producto se acumula


como un intermediario inestable que se descompone en adamantane

y methymetha-oxybenzoato que pasa de un estado inestable,


excitado, a otro estable, relajado, emitiendo luz.

En la figura adjunta se muestran filtros de 'western blot' que han sido


revelados con algunos de los sustratos colorimtricos antes citados
para la peroxidasa de rbano y la fosfatasa alcalina.
- arriba Sistemas radioqumicos de revelado
Para poder detectar las protenas mediante el uso de istopos radiactivos es
necesario que stas incorporen este tipo de istopos. Existen diferentes
estrategias para conseguirlo. La eleccin de una u otra depender del objetivo
perseguido. Veamos algunos ejemplos :

si el objetivo es detectar las protenas sintetizadas en un perodo de


tiempo en un sistema celular, el mtodo de eleccin es el denominado
marcaje metablico, que consiste en la adicin al medio de cultivo de las
clulas de aminocidos marcados (en general se emplean los
aminocidos azufrados cistena y metionina con el istopo S35, emisor
de radiacin beta dbil). Las clulas incorporarn este aminocido a
todas las protenas que sinteticen durante el perodo de exposicin al
trazador.

si el objetivo es detectar una protena en concreto, el mtodo


de eleccin ser inmunoqumico con un sistema de revelado
que emplee reactivos radiactivos : anticuerpos secundarios
unidos a I-125 o protena A o G -I125. El proceso de marcaje
de una protena con I-125 se basa en la reaccin de Bolton y
Hunter que tienes en la figura. De una manera similar se
pueden incorporar otros marcajes como el S35.

El revelado se realiza mediante exposicin de la membrana ante pelcula


autorradiogrfica. En este caso, a diferencia de la autorradiografa y
fluorografa de los geles de acrilamida no es necesario tratar la membrana con
fluorforos pues la totalidad del marcaje se localiza en la cara ms externa de
la membrana. Si se emplean las pantallas amplificadoras para incrementar la
seal.
La ventaja de disponer de copias duraderas (pelcula) del
experimento es adems de la conservacin, la posibilidad de realizar
densitometrados que permiten obtener valores cuantitativos de la
seal obtenida. Para ello es ideal el sistema de 'slot blot'. En la figura
se han recogido algunos ejemplos.
- arriba -

Tincin mediante oro coloidal


Es posible detectar las protenas fijadas sobre un filtro empleando
anticuerpos que directamente o indirectamente (anticuerpos
secundarios o protena A o G) estn unidos a oro coloidal.
Debido a las caractersticas del oro coloidal la interaccin
antgeno anticuerpo se observa como una seal rosacea de
intensidad proporcional a la cantidad de antgeno presente. La
seal es tnue y tiende a desaparecer. Por ello se han diseado
sistemas de intesificacin de seal que en general se basan en
la precipitacin de plata metlica en torno al oro coloidal. La
reaccin de amplificacin con plata se basa en la reduccin de
iones de plata a plata metlica por accin del oro, que acta
como catalizador. Se forma un precipitado marrn oscuro,
estable, que incrementa la sensibilidad 10 veces.
La tincin que se obtiene es permanente y casi sin 'background'.
El proceso de intensificacin de la seal del oro con plata es
progresivo y puede ser monitorizado hasta obtener la seal
deseada.

En las imgenes se muestra, en la primera, una


comparacin entre un filtro de 'western blot'
revelado con oro coloidal o amplificado
posteriormente con plata. El aumento de
sensibilidad es importante. En la segunda se
muestra el efecto del tamao de la partcula de oro
coloidal sobre la sensibilidad de la deteccin.

- arriba -

Material docente diseado y elaborado por Manuel Reina. ltima actualizacin :

. Comentarios : mreina@ub.edu