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DNA
En 1985, Jeffreys y cols, describan un mtodo de identificacin individual que
denominaron ADN fingerprinting o huella gentica que prometa ser la solucin
definitiva al anlisis de la diversidad humana desde la Medicina Legal, tanto en
Investigacin biolgica de la Paternidad como en Criminalstica.
A pesar de que se pens que el avance de estas tcnicas requera algn tiempo,
ya en Abril de ese ao se resolva un caso de inmigracin en U.K. por ese mtodo y muy
poco tiempo despus se admitira, tambin en un tribunal britnico, la Investigacin
Biolgica de la Paternidad basada en la prueba del ADN. La aplicacin por primera vez
de estos mtodos en procesos penales se produjo en Inglaterra en 1986, en un caso de
violacin en donde mediante esta tcnica se pudo liberar al principal sospechoso.
En U.S.A., la introduccin de esta tcnica no fue tan sencilla dando lugar a
numerosas controversias a favor y en contra. Sin embargo en 1992, el US Nacional
Research Council (NRC) confirmaba con rotundidad la validez de las tcnicas de
identificacin individual basadas en la prueba del ADN y estableca unas guas de
actuacin.
bases y la separacin de las dos hebras del ADN. Esta situacin es reversible, y
cuando cesan esas condiciones, se vuelve a establecer de nuevo la asociacin entre
las cadenas que se unen otra vez segn el principio de complementariedad entre sus
bases.
Otro hallazgo fundamental que ha permitido el desarrollo de las tcnicas de
Biologa Molecular fue el descubrimiento y uso de enzimas de restriccin. Estas
enzimas o endonucleasas de restriccin son verdaderas tijeras moleculares que se aslan
de las bacterias que stas utilizan como mecanismo de defensa ante la entrada de un
virus u otro ADN extrao. Actan reconociendo una secuencia especfica de bases y
rompen el ADN en esa secuencia o cerca de la misma, dando lugar a fragmentos del
cido nucleico de distinto tamao. Por ej. el lugar de reconocimiento de la enzima Eco
RI, es entre una guanina y una adenina y sera en una porcin de ADN:
5 G/AATTC 3
3 C TTAA/G5
/lugar de corte.
Todas estas limitaciones pueden ser superadas por medio del uso de la tcnica de
la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), que consiste en la amplificacin in vitro
de secuencias de ADN especficas.
As se puede llevar a cabo el estudio de polimorfismos ADN en manchas
diminutas o en vestigios biolgicos minsculos, puesto que la PCR permite realizar una
tipificacin completa a partir de un solo pelo, de una sola clula, de un nico
espermatozoide, de una gota de sangre seca, etc., y todo ello aunque el material
biolgico se encuentre parcialmente degradado.
La PCR permite tambin la automatizacin del procedimiento de anlisis
individual, generando con gran rapidez un elevado nmero de copias de la secuencia
especfica de ADN que es objeto de estudio.
Adems, ofrece la ventaja sobre los mtodos tradicionales de permitir la
determinacin y agrupacin allica en clases discretas, lo que facilita enormemente la
elaboracin de bases de datos, ya que la estandarizacin es inmediata y sobre todo
permite aplicar mtodos bioestadsticas y programas ya elaborados para marcadores
clsicos.
Una vez que el ADN es amplificado puede ser analizados por distintos mtodos
que releven los alelos presentes en los loci definidos, con la ventaja de que no es
necesario el uso de sondas marcadas radiactivamente, dado que se cuenta con millones
de copias de la zona ADN amplificada.
La PCR consiste en ciclos de temperatura repetidos en tres etapas por ciclo. La
primera etapa consiste en la desnaturalizacin del ADN a ms de 90C, con lo que se
consigue separar las dos cadenas de la doble hlice. Esto se sigue de una cada de la
temperatura, lo que permite el anillado de primers o fragmentos de ADN unicatenarios
(de aprox. 20 nucletidos de longitud) de secuencia complementaria a las regiones del
cido ribonucleico que flanquean la regin que se investiga. El paso final es una
reaccin de extensin a 72C, que es catalizada por una ADN polimerasa termoestable,
con lo que se generan copias iguales de las cadenas separadas de ADN diana. El
resultado neto por ciclo es que se dobla la cantidad de ADN diana, de tal manera que
tras repetidos ciclos el nmero de tales secuencias diana se ha podido incrementar hasta
un milln de veces.
Los sistemas de marcadores para anlisis mediante PCR i de utilidad en
Medicina Forense deben ser altamente polimrficos y han de tener un elevado grado de
heterocigosidad gentica. La secuencia estudiada debe ser fcilmente amplificable, del
mismo modo que la variacin allica debe ser reproducible. Antes de aplicar estos
marcadores en el diagnstico de la individualidad tambin es necesario e imprescindible
disponer de datos fiables acerca de la distribucin de sus frecuencias allicas en la
poblacin general. En definitiva antes de ser aceptados para la prctica forense el
conjunto de los polimorfismos analizables por PCR deben cumplir una serie de
requisitos y pasar sucesivos controles de validacin.
En los ltimos aos, el uso de polimorfismos STR o microsatlites se ha
impuesto por los motivos siguientes:
a)
Los STR polimrficos se encuentran tanto en las regiones gnicas como extragnicas
del genoma humano. Los STR localizados en regiones gnicas se presenta tanto en
intrones y en regiones flanqueantes como en regiones codificantes.
Asimismo, se han asignado a todos los genes mitocondriales sus funciones y sus
productos gnicos, incluyendo 13 protenas.
Las dos hebras del ADNmt tienen una distribucin asimtrica de guaninas y
citosinas, lo que genera una hebra pesada (H) y una ligera (L). Cada hebra es transcripta
por un promotor localizados en la regin control, la regin ms interesante desde el
punto de vista Forense, es la de replicacin de la cadena H, dado que es una regin
hipervariable y lo suficientemente pequea para poder ser utilizada en PCR.
Debido a su alta variabilidad, la regin control es la que normalmente se analiza,
tanto para estudios antropolgicos como para gentica forense. Mide aproximadamente
1.100 pb y forma parte del 10% del ADNmt no expresivo. Es una regin no codificante
y se subdivide en dos regiones de aproximadamente el mismo tamao (400pb), la regin
HVI y la HVII. La enorme variabilidad.
El ADN nuclear puede proporcionar mucha ms informacin que el ADNmt
debido a la cantidad de sistemas polimrficos que se pueden estudiar, ej. los
microsatlites (STR). Sin embargo en muchas ocasiones, su estudio se hace totalmente
imposible debido a la cantidad insuficiente de material para analizar o al grado de
degradacin de ste.
La utilizacin del ADNmt se debe restringir a aquellos casos que no se pueda
realizar un estudio a travs del ADN nuclear o en aquellos casos en los que el ADNmt
pudiera proporcionar informacin adicional.
En algunos casos como en muestras de pelo sin bulbo, un vestigio bastante
comn en la pericia forense, tan solo se puede llevar a cabo el anlisis del ADNmt. El
abordaje estadstico de los resultados del ADNmt es complejo y las estimas de
frecuencias tan solo se podrn llevar a cabo en el futuro con la obtencin de amplias
bases de datos.
En Gentica Forense el ADNmt ofrce importantes ventajas. Por un lado, la
amplificacin es mucho ms fcil debido a que existe un gran nmero de molculas de
ADNmt por clula, por lo que podemos obtener mayor de cantidad de producto de PCR
de muestras muy pequeas. Adems, debido a que es menos propenso a la degradacin
que el ADN nuclear, se evitan errores de la polimerasa durante la amplificacin
provocados por la degradacin del ADN original.
As pues, las muestras ms idneas para el abordaje a travs del ADNmt son
aquellas muestras biolgicas que, debido a su pequeo tamao o posible degradacin,
no puedan ser analizadas por medio de polimorfismos de ADN nuclear. La
identificacin de restos antiguos o restos cadavricos procedentes de grandes
catstrofes, como los accidentes areos (normalmente piezas dentarias o huesos), y la
identificacin de vestigios de criminalstica, como pelos sin bulbo o manchas biolgicas
de escaso tamao parcialmente degradadas, son las aplicaciones ms importantes que
este tipo de ADN tiene en el campo de la Gentica Forense.
MUESTRAS DE SANGRE.
Aunque la hemoglobina es un conocido inhibidor de la Taq-polimerasa no son
requeridos protocolos especiales. Bastan 3-5 ul de sangre fresco o manchas de unos 3
mm2, de donde se pueden obtener cmodamente 200 ng de ADN. Las muestras de
sangre liquida procedentes de cadveres, degradada o contaminada, pueden ocasionar
problemas si el secado es lento pues los fenmenos de putrefaccin han avanzado. Es
por ello que se prefiere la utilizacin de pequeas manchas las cuales por su diminuto
tamao han secado rpidamente evitndose el fenmeno putrefactivo.
MUESTRAS DE SEMEN.
El estudio de restos de semen como evidencia en casos de agresin sexual es,
junto con el de vestigios sanguneos, el tipo de anlisis mas solicitado en el laboratorio
de biologa forense. Antes de la aplicacin de las tcnicas con ADN, los estudios con
este material tenan grandes limitaciones, incluso con Ia posibilidad de mezclado con
fluidos de la victima que podran enmascarar resultados en la identificacin. de
proteinas, enzimas e incluso del, agrupamiento ABO.
Actualmente muchas de esas limitaciones se han superado aunque por supuesto
que la tecnologa tiene sus propias limitaciones. Una do sus mayores ventajas es que
ofrece la posibilidad de resolver las mezclas de semen con otros fluidos biolgicos
procedentes de la victima (fluidos vaginales, sangre o saliva), gracias a un mtodo de
extraccin conocido como "lisis diferencial", se basa en Ia resistencia de los
espermatozoides a la lisis con detergente y proteinasa K en ausencia de un agente
reductor. En un primer paso se produce la ruptura de las clulas epiteliales, pero no de
los espermatozoides, que pueden recuperarse por centrifugacin. En el sobrenadante
de esa primera digestin queda el ADN procedente de la victima. El precipitado
conteniendo los espermatozoides ntegros convenientemente tratado aportara el ADN
del agresor.
Esta tcnica no resuelve el problema cuando el agresor es un sujeto
azoospermico pues en este caso la cantidad de ADN que puede recuperarse es mucho
menor y proveniente solo de las clulas o leucocitos presentes en el semen del agresor,
aproximadamente la cantidad recuperable ser del orden del 6 % de la posible en un
sujeto esprmico.
Recientemente el estudio de evidencias en casos de agresin sexual, en
particular aquellas que se presentan en cantidades trazas, se ha beneficiado mucho de
la incorporacin en las bateras de tipificacin de microsatlites especficos del
cromosoma Y. Estos Y-STR incrementan notablemente el ndice de xito en la
identificacin del componente masculino en mezclas de fluidos biolgicos
hombre/mujer en los que la lisis diferencial es intil o en aquellas en las que sea de
alto riesgo su aplicacin.
MUESTRAS DE SALIVA
En los ltimos aos, debido al notable incremento de las tcnicas utilizadas, con
el consiguiente requerimiento de contar con menor cantidad de ADN, aumentando el
xito en muestras con cantidades trazas de material biolgico, tales como sellos, sobres,
colillas, mordazas, huellas de mordedura, manchas en ropa, etc. Cada vez se extiende
mas su utilizaci6n en casos de criminalstica o de estudios de paternidad.
Si se compara con la venopuntura, la toma de saliva con ayuda de un hisopo
resulta un mtodo no invasivo, ni doloroso, ni traumtico, de fcil recogida en recin
MUESTRA DE PELOS
En ocasiones, unos pelos son la nica evidencia que permite establecer una
conexin entre un agresor y la vctima o al menos con el lugar de los hechos. Cabellos
o vellos de cualquier origen corporal son recogidos en la escena del delito, sobre la
victima, en las prendas, etc. Pero como tambin es una muestra ubicua y, en el caso de
cabellos, el ritmo normal de cada en un sujeto normal es de 80 a 100 diarios y, aunque
la decisin de la importancia de una evidencia, habitualmente no es incumbencia del
laboratorio, seria muy importante no considerar en los estudios nada ms que aquellos
pelos que estn incuestionablemente relacionados con el delito.
El pelo es una muestra delicada, posiblemente la que presenta mayor ndice de
fracasos; una de las razones puede encontrarse en el elevado contenido en melaninas
solubles, potentes inhibidores de las ADN polimerasas y que se forman
espontneamente, por contacto con el aire, en los pelos oscuros y se ve favorecida
adems, por los tratamientos de decoraci6n con agua. Su anlisis es laborioso ya que se
requiere un exhaustivo anlisis morfol6gico, sobre todo si se trata de una muestra
abundante, para hacer un cribado previo que los clasifique y ordene por su semejanza o
sus diferencias.
Solo los pelos provisto de raz y vaina son tiles para el anlisis de ADN
nuclear, si no la presentan, deber estudiarse ADN mitocondrial. No hay que olvidar
que analizados uno a uno, o agrupados si es posible, los pelos son siempre muestra
nica que se destruye en el proceso de extracci6n. Solo se dispone de los nanogramos
de ADN que se hayan obtenido en el primer y definitivo anlisis. Los primeros en
realizar la individualizaci6n de un nico pelo humano, fueron Higuchi y cots. , las
races de los pelos arrancados, sobretodo si son recientes no ofrecen demasiados
problemas y pueden ser extrados con una tcnica especial con fenolcloroformo o con
un buffer especifico para pelos, adicionado de un detergente no inico como el
Laureth-10.
biolgica de la paternidad". Con la Direccin de Ma.Begoa Martinez Jarreta. Prof Tit. de Medicina
Legal y Forense, Directora del Laboratorio de Gentica Forense, Facultad de Medicina, Universidad de
Zaragoza y numerosos colaboradores.
La compilacin de los temas enunciados estimo que pueden resultar de utilidad para los
profesionales y peritos que trabajen en Criminalstica, sin que esto pueda tener pretensiones de manual
o de indicador de tcnicas.
By Dr. Carlos Alberto Palacios