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Prctica 13: AISLAMIENTO DE DNA PLASMIDICO.

INTRUDUCCIN:
El DNA en general es un biopolmero enorme
que existe en su forma superenrrollada al estar
in vivo. Un plsmido es generalmente una
pequea molcula de DNA circular cuyo nmero
de copias se controla de manera independiente
de los mecanismos reguladores que afectan la
replicacin de DNA cromosmico. Hablar de
DNA circular indica que no tiene extremos libres
para enlazar; los crculos pueden ser grandes o
pequeos y pueden estar formados por una sola
cadena o por 2 cadenas entrelazadas en una
doble hlice.
Una importante aplicacin del DNA plasmdico
es la formacin de DNA recombinante que se
usa en las reas de ingeniera gentica, para la
introduccin de genes ajenos a una especie en
el DNA de la misma. El plsmido se combina
con el DNA que se quiere agregar y se introduce
en la clula hospedadora, y se realiza un
proceso de seleccin mediante un antibitico al
cual la pieza de DNA es resistente; de este
modo las clulas con nueva pieza gnica se
replicarn preferentemente.
Uno de los mtodos de separacin ms usados
y efectivos que existen es la electroforesis, cuyo
fundamento es el uso de un campo elctrico
generado a travs de corriente directa. Un
campo elctrico es una magnitud vectorial
medible definida como la fuerza que puede
ejercer una carga a una distancia determinada.
En una electroforesis se produce una
separacin de sustancias por su distinta afinidad
con un soporte y la polarizabilidad de la
molcula que adquiere carga. Esto indica
tambin que una sustancia se separar de
acuerdo a su tamao (polarizabilidad).
OBJETIVO:
Aislar el DNA plasmdico pUC18 (mini-prep) y
utilizar una electroforesis en gel de agarosa del
plsmido obtenido y observar la forma obtenida.

RESULTADOS:
Nuestra muestra corresponde al nmero 7 de
izquierda a derecha:

Tomando en cuenta la descripcin del canal #7 y


comparando con otros carriles, el corrimiento
indica que se logr una separacin de DNA

plasmdico en su forma superenrrollada ya que:


el carril se observa negro entre la zona de
aplicacin y la mancha ms grande observada;
esta mancha adems est alejada del punto de
aplicacin el carril y ms alejada que otras
manchas como la del equipo 8 5. Se observa
tambin un ligero corrimiento del color despus
de la mancha que puede sugerir la presencia de
RNA en pequeas cantidades debido a la accin
de RNAsas. Se encuentra tambin una pequea
cantidad de DNA cromosmico (lnea en el
punto de aplicacin) y una muy pequea
fraccin de DNA plasmdico en su forma circular
relajada (lnea al inicio del pozo)

Interpretacin:
El pozo #7 muestra una clara mancha a una
distancia considerable del pozo, y tambin se
puede observar una lnea muy fina cerca del
punto de aplicacin. En el pozo se puede ver
adems otra lnea muy fina; el carril de
corrimiento se ve negro, sin un color blanco
difuminado sobre este, como puede apreciarse
Adems una lnea y una mancha en el punto
de aplicacin con un brillo intenso. Se observa
tambin una lnea casi mancha gruesa cerca del
punto de aplicacin.

Para el canal #8 tenemos tres resultados: DNA


plasmdico en sus formas circular relajada y
lineal, esta ltima en su mayora, y DNA
cromosmico pesado. Se aprecia tambin un en
otros carriles.
El pozo #8 muestra una mancha de brillo
considerable a una distancia intermedia del
pozo (relativa al corrimiento en otros carriles
como el #7, el #3, #4, etc.), y se puede observar
ligero barrido posterior a la mancha ms
plasmdico superenrrollado (en muy pequeas
cantidades) o a RNA. Intensa, que podra
corresponder al DNA
Alumnos:
Flores Hernndez Carlos I.
Garca Mrquez Reynaldo
3IM2

Seccin: 3

Prctica 13: AISLAMIENTO DE DNA PLASMIDICO.

de sulfatos, que consiste en cadenas repetidas


de unidades alternadas -1,3 D-galactosa y 1,4 3,6-anhidro-L-galactosa. La agaropectina,
fraccin no-gelificante, es un polisacrido
sulfatado (3% a 10% de sulfato) compuesto de
agarosa y porcentajes variados de ster sulfato,
cido D-glicurnico y pequeas cantidades de
cido pirvico. La proporcin de estos dos
polmeros vara de acuerdo con la especie del
alga, y en la agarosa representa, normalmente,
por lo menos dos tercios del agar-agar natural.

Electroforesis:
Algunos aspectos importantes:
Estructura de bromuro de etidio y
representacin de accin intercalante:

Agar:
En su estado natural, el agar-agar se presenta
como un carbohidrato estructural de la pared
celular de las algas agarofitas, donde existe en
la forma de sales de calcio o de una mixtura de
sales de calcio y magnesio. Es una mixtura
compleja de polisacridos compuesta por dos
fracciones principales: la agarosa, un polmero
neutro, y la agaropectina, un polmero con carga
sulfatado. La agarosa, fraccin gelificante, es
una molcula lineal neutra, esencialmente libre

La electroforesis es una tcnica para la


separacin de molculas segn la movilidad de
estas en un campo elctrico.1 La separacin
puede realizarse sobre la superficie hidratada de
un soporte slido (p. ej., electroforesis en papel
o en acetato de celulosa), o bien a travs de una
matriz porosa (electroforesis en gel), o bien en
disolucin (electroforesis libre). Dependiendo de
la tcnica que se use, la separacin obedece en
distinta medida a la carga elctrica de las
molculas y a su masa.La electroforesis se usa
en una gran mayora en la materia del ADN
recombinante ya que nos permite saber la carga
que poseen los polipptidos, y separar los
diferentes polipeptidos resultantes de las
variaciones del experimento del ADN
recombinante. La variante de uso ms comn
para el anlisis de mezclas de protenas o
de cidos nucleicos utiliza como soporte un gel,
habitualmente de agarosao de poliacrilamida.
Los cidos nucleicos ya disponen de una carga
elctrica negativa, que los dirigir al polo

positivo, mientras que las protenas se cargan al


unirse con sustancias como el SDS (detergente)
que incorpora cargas negativas de una manera
dependiente de la masa molecular de la
protena. Al poner la mezcla de molculas y
aplicar un campo elctrico, stas se movern y
debern ir pasando por la malla del gel (una red
tridimensional de fibras cruzadas), por lo que las
pequeas se movern mejor, ms rpidamente.
As, las ms pequeas avanzarn ms y las
ms grandes quedarn cerca del lugar de
partida.

Anlisis de la Tcnica:
Obtenido el crecimiento bacteriano
agregamos 100 de la solucion 1 (Tris EDTArNasa A) que es un regulador de pH (Tris) y
secuetra los cationes divalentes (EDTA)
resuspendiendo en vortex, en este momendto
se encuentran las bacterias aun vivas agregar
200 de la solucion 2 (SDS 1% NaOH .2N) que
nos ayuda a solubilizar las membranas
manteniendo la identidad de estas mientras que
neutraliza las cargas mezclandolo con cuidado
para no romper el DNA tambien logramos hacer
que las macromoleculas puedan precipitar
excepto el DNA,( las bacterias ya no
encontraran vivas despues de este paso), ahora
agregamos 150 de la solucion 3 (acetate de
potasio) que nos ayuda a que mediante su alta
fuerza ionica precipite macromoleculas
(proteinas,polisacaridos) depues cetrifugamos 5
minutos a 13000 rpm para poder hacer que el
precipitado contenga alas macromoleculas no
deseadas, ahora separamos el sobrenadante
que contiene el DNA a otro tubo eppendorf y
agregamos 500 de la solucion 4 (isopropanol)
y mezclamos suavemente, mediante la

Prctica 13: AISLAMIENTO DE DNA PLASMIDICO.


disminucion de la constante dielectrica hacemos
precipitar a nuestra macromolecula (DNA)
cetrifugar a 13000 rpm durante 5 min, ahora el
precipitado contiene nuestro DNA por lo que el
sobrenadante se desecha (teniendo fe de que
se encuentre ahi), secamos el tubo y
agregamos 5 de la solucion 5 ( Regulador tris
EDTA) que es un regulador y una vez teniendo
lista la electrophoresis en gel se toman de 5 a
10 del DNA obtenido y se mezcla con
colorante de carga se coloca en el pozo

correspondiente y se hace pasar un V= 80 volts


durante 30 minutos las cargas negativas de el
DNA se transportaran al polo positivo
revelamos con bromuro de etidio que es una
gente intercalante en el DNA por lo que este
muta y cambia las propiedades de este
hacienda que se pueda observar en el
transiluminador.

BIBLIOGRAFA:

Albert L. Lehninger Bioquimica Ediciones


Omega Octava reinmpresion 1984.
Van Holde,K.E.; Mathews, C.K.; Ahern, K.G.;
"Bioqumica"; Editorial Pearson, 3era Edicin;
Espaa 2010 Pgs: 806,807

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