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MANUAL PRCTICO DE MICROBIOLOGA - Tomo II: Microbiologa Ambiental II

Manacorda A. M., lvarez A. S., Pezzullo S. D. & Cuadros D. P.

Ao 2014

Captulo 5
ANTIMICROBIANOS
Objetivos
Verificar el grado de sensibilidad o la resistencia de los microorganismos frente a distintos
agentes antimicrobianos.
Reflexionar acerca de los riesgos que implica la posible dispersin de la resistencia a los
antimicrobianos en el ambiente.
Bunquer
Introduccin
Se conoce como antimicrobiano a toda sustancia qumica que impide el desarrollo de un
microorganismo o que provoca su muerte. Los agentes que destruyen o matan las bacterias se
denominan bactericidas, mientras que los agentes que inhiben el crecimiento bacteriano se denominan
bacteriostticos.
Los antimicrobianos pueden ser de tres tipos:
1. Desinfectantes: son usados para matar microorganismos sobre superficies de objetos o
sistemas inanimados, son demasiado txicas para aplicarla directamente a los tejidos.
Reducen el nmero de grmenes viables, pero no eliminan a los esporulados.
2. Antispticos: son aplicables a la piel o mucosas de humanos y animales, reducen y controlan la
presencia de grmenes potencialmente patgenos.
3. Antimicrobianos de uso clnico-teraputico: son sustancias capaces de controlar la presencia
de microorganismos patgenos que han invadido tejidos u organos profundos en humanos y
animales. Se los denomina tambin como antibitico, dentro de este grupo se pueden
considerar dos categoras:
a. Antibiticos: antimicrobianos de origen natural.
b. Quimioterpicos: antimicrobianos de origen sinttico.
Los antimicrobianos, a diferencia de los desinfectantes y antispticos, poseen toxicidad selectiva. Esto
indica que no afectan a las clulas del hospedador, sino solo a las clulas bacterianas que se desean
eliminar, debido a las diferencias existentes entre ellas.
Los antimicrobianos se pueden clasificar de acuerdo a sus mecanismos de accin, ellos son:
- Inhibicin de la sntesis de la pared celular
- Inhibicin de la sntesis proteica
- Inhibicin de la sntesis de cidos nucleicos
- Inhibicin de las vas metablicas
- Alteracin de la funcin de la membrana bacteriana
Segn el nmero de especies bacterianas sobre las cuales tiene efecto el antimicrobiano, se clasifican
en antibitico de amplio espectro o de espectro limitado. Los antimicrobianos de amplio espectro son
capaces de actuar sobre una gran cantidad de bacterias gram positivas y gram negativas, como las
cefalosporinas, aminoglucsidos y quinolonas. El grupo de las tetraciclinas (inhibidores de la sntesis
proteica) tienen la capacidad de actuar sobre bacterias gram positivas, gram negativas, las rickettsias,
clamidias, micoplasmas y espiroquetas.
En cambio, los antimicrobianos de espectro limitado actan slo sobre bacterias gram positivas o gram
negativas, sobre cocos o bacilos, sobre bacterias aerobias o anaerobias, etc. Por ejemplo, la penicilina
es activa frente a Streptococcus spp., Neisseria spp., Clostrodium spp. y cocos anaerobios. El
agregado de un grupo amino a la cadena lateral de la penicilina, dio lugar a la ampicilina y permiti
extender el espectro de accin a los bacilos gram negativos.

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La resistencia bacteriana a los antimicrobianos puede ser intrnseca o adquirida. La primera es una
caracterstica presente en todos los miembros de determinado gnero o especie. La inadecuada
utilizacin de antibiticos da como resultado la seleccin de patgenos con mltiples mecanismos
naturales de resistencia. La resistencia adquirida est presente slo en algunas cepas de una especie
o gnero y puede ser el resultado de la adquisicin de informacin gentica exgena, bsicamente
mediante mecanismos de recombinacin gentica bacteriana.
Es un hecho ampliamente documentado que la aparicin de resistencia a antibiticos se debe
primariamente a su uso excesivo y frecuentemente innecesario en humanos y animales. Los factores
de riesgo para la dispersin de la resistencia tanto en centros de salud como en la comunidad en
general incluyen: la sobrepoblacin, la falta de higiene y las prcticas deficientes en el control de las
infecciones.
La resistencia a antimicrobianos ha sido extensamente estudiada no slo desde el punto de vista
clnico sino desde el punto de vista de la gentica molecular. La informacin relacionada con tal
resistencia esta frecuentemente codificada en genes que son portados en plsmidos. Los plsmidos
son molculas circulares de ADN extracromosmico, que se pueden replicar en forma independiente
del cromosoma bacteriano y que son transmisibles entre bacterias, an no emparentadas entre s, por
medio del mecanismo de conjugacin. Esto hace que la informacin portada en los plsmidos se
disperse con bastante facilidad entre cepas patgenas y aquellas que no lo son. De este modo es
posible que bacterias presentes en suelo y agua que habitualmente no presentan resistencia a
antibiticos puedan adquirir esta capacidad y contribuir de este modo a la dispersin de la misma.
Los microorganismos resistentes son inmunes a los efectos de los antimicrobianos, de modo que los
tratamientos habituales se vuelven ineficaces y las infecciones aumentan su persistencia, como as
tambin las probabilidades de transmisin de una persona a otra. Este hecho representa un riesgo para
la salud pblica y una amenaza que involucra a nuevas especies bacterianas y a nuevos mecanismos
de resistencia.

Tcnicas para la realizacin de un antibiograma


Los antibiogramas, tambin denominados antibiticogramas, son pruebas de susceptibilidad in vitro
que estudian la sensibilidad de un microorganismo a la accin de los agentes antimicrobianos.
Procedimiento
1. Determinacin de las concentraciones inhibitorias mnimas (CIM): Mtodo de dilucin.
Consiste en una prueba cuantitativa que permite conocer la mnima concentracin de un antimicrobiano
necesaria para inhibir el desarrollo de una cepa microbiana despus de un perodo de 16 a 18 horas.
El medio de cultivo recomendado para estas pruebas es el caldo y agar Muller Hinton (MH).
El medio de cultivo Muller Hinton, tanto caldo como agar, es el que ms se asemeja al suero en
cuanto a pH, osmolaridad, concentracin de Na+, K+ y Cl-. Es considerado como el mejor medio
de cultivo para las pruebas de sensibilidad de rutina de microorganismos de rpido crecimiento sin
exigencias nutricionales especiales. El Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), ex
National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS), recomend su uso debido a que:
muestra una buena reproducibilidad de resultados obtenidos con distintos lotes, tiene bajo
contenido de inhibidores para sulfonamidas, trimetoprima y tetraciclinas, es adecuado para el
crecimiento de la mayora de las bacterias patgenas, existe una gran cantidad de datos
recopilados que avalan la calidad de los resultados de las pruebas de sensibilidad realizadas con
este medio.

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Muller Hinton caldo


Infusin de carne
Peptona cida de casena
Almidn
Agua destilada c.s.p
pH final: 7,3 0,2

300 ml
17,5 gr
1,5 gr
1000 ml

Muller Hinton agar


Infusin de carne
Peptona cida de casena
Almidn
Agar
Agua destilada c.s.p
pH final: 7,3 0,1

300 ml
17,5 gr
1,5 gr
15 gr
1000 ml

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El procedimiento a seguir es el siguiente (ver fig. 5.1):

Preparar una serie de tubos con caldo Muller Hinton con los cuales se prepararn las sucesivas
diluciones, con concentraciones crecientes del antibitico a evaluar. El volumen final requerido en
cada tubo es de 1 ml.
El antibitico de referencia pueden ser obtenido comercialmente. Se debe conocer la potencia
valorada (en porcentaje o g/mg) y la fecha de vencimiento. El almacenamiento de la droga debe
hacerse segn las recomendaciones del laboratorio productor.
Preparar el inculo. La preparacin de la suspensin bacteriana es crtica porque una variacin en
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su densidad puede alterar el punto final de la prueba. El inculo debe contener 5 x 10 UFC/ml,
equivalente al patrn 0,5 de la escala Mc Farland.
Usar un tubo que contenga la suspensin del microorganismo a probar, en caldo sin
antimicrobiano como control de inculo.
Dentro de los 15 minutos de preparado el inculo adicionar a cada tubo de dilucin de antibitico y
al tubo control del inculo, 1 ml de la suspensin bacteriana por debajo del menisco, para no
producir salpicaduras. Mezclar suavemente.
Se incuba a 35 C durante 16-20 horas.
Se controla la aparicin de turbidez, la cual es producto del desarrollo

Interpretacin de los resultados:


La CIM es la menor concentracin de antibitico que inhibe completamente el desarrollo bacteriano,
detectado por la falta de turbidez del caldo. Los tubos con menor concentracin de antibitico sern los
que permitirn el desarrollo de los microorganismos, y a medida que la concentracin aumente se ir
deteniendo ese crecimiento. Comenzando a observar desde la menor dilucin de antibitico, el primer
tubo que no presente desarrollo microbiano ser considerado el que tiene la menor concentracin de
antibitico que ha producido la inhibicin del crecimiento. A partir de determinar la concentracin que
inhibe el desarrollo de la cepa estudiada, se puede continuar el proceso para determinar la
concentracin de produce la muerte de los microorganismos.
Concentracin Letal Mnima (CLM)
La Concentracin Letal Mnima (CLM) que es aquella que no slo inhibe el desarrollo sino que tiene un
efecto letal sobre los microorganismos. Para ello se emplean los tubos que no presentaron crecimiento
visible en la determinacin de la CIM y se los subcultiva en placas con agar Muller Hinton sin
antibitico, incubando a 35 C durante 16-20 hs. La menor concentracin de la droga que no origine
crecimiento bacteriano en el subcultivo se interpreta como CLM (ver Fig. 1)

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Fig. 5.1: Evaluacin de la CIM y CLM de un antimicrobiano mediante el mtodo de dilucin

2. Determinacin de la sensibilidad a los antimicrobianos: Mtodo de difusin con disco.


Es una prueba de cuantitativa para evaluar la sensibilidad de una cepa bacteriana frente a la accin de
uno o varios antimicrobianos.
El mtodo se basa en la difusin del antimicrobiano incorporado en una cantidad preestablecida en un
soporte, el cual se ubica sobre un medio slido. En este medio slido (agar) se desarrolla el
microorganismo a evaluar. El soporte donde se coloca el antimicrobiano suele ser un disco de papel.
Estos soportes deben ser inertes y permitir vehiculizar el antimicrobiano sin producir alteraciones en el
mismo. Estos discos se pueden preparar o adquirir comercialmente.
El disco aplicado sobre el medio de cultivo slido genera un gradiente de concentracin decreciente a
medida que se aleja del centro. La interaccin del antimicrobiano con el crecimiento del
microorganismo puede dar como resultado zonas de inhibicin. La sensibilidad del microorganismo
estar indicada por el tamao de la zona de inhibicin del crecimiento alrededor del disco.
El tamao de la zona de inhibicin (halo) depender no solo de la sensibilidad del microorganismo y la
carga de sustancia en el disco, sino tambin del espesor de la capa de agar, su pH y composicin, de
la capacidad de difusin del antimicrobiano en ese medio, de la temperatura, del tamao y fase de
crecimiento del inculo. Para que los resultados sean confiables los procedimientos debern ser
controlados cuidadosamente.
El procedimiento a seguir es el siguiente (ver fig. 5.2):

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Preparar las placas de Petri con el medio de cultivo. Distribuir 30 ml de agar Muller Hinton en
placas de 100 mm de dimetro, el objetivo es alcanzar una altura del medio de cultivo de 4 mm.
Una inadecuada altura puede producir variaciones significativas en el dimetro de los halos de
inhibicin, provocando errores en la interpretacin de los resultados. Las placas pueden
conservarse por un perodo de hasta una semana, teniendo el cuidado de mantenerlas
refrigeradas (2 a 8 C) y selladas para evitar la deshidratacin.
Preparar el inculo bacteriano. A partir del cultivo puro preparar una suspensin en caldo Muller
Hinton con una turbidez equivalente al patrn 0,5 de la escala Mc Farland. La densidad del inculo
es uno de los factores ms importantes en la realizacin de la tcnica.
Sembrar las placas que contienen el agar Muller Hinton, dentro de los 15 minutos de la
preparacin de inculo. La transferencia se realiza con hisopo estril, el mismo se sumerge en el
inculo y luego se lo presiona contra las paredes del tubo para eliminar el exceso de lquido. Se
distribuye el inculo de manera homognea, hisopando la superficie en tres direcciones diferentes.
Se deja reposar la placa sembrada entre 3 - 5 minutos de modo que se absorba el exceso de
humedad de la superficie del agar.
Aplicar los discos de antimicrobianos sobre la superficie de las placas inoculadas con una pinza
estril, aplicndole una leve presin. Los discos deben ser retirados anteriormente del refrigerador
para que en el momento de ser aplicado tenga temperatura ambiente. En cada placa de 100 mm
de dimetro no deben aplicarse ms de 6 discos, los cuales deben estar ubicados a una distancia
de, por lo menos, 24 mm entre los centros de cada uno de ellos.
Incubar las placas, invertidas, a una temperatura de 35 2 C, durante 18-20 hs.
Observar y medir los dimetros de inhibicin (mm) y consultar los puntos de corte para determinar
la sensibilidad (ver tabla 5.1).

Interpretacin de los resultados:


Se deben observar los dimetros de los halos de inhibicin (ver fig 5.3). La lectura se realiza con regla
y debe ser sobre la base de la placa, para ello debe estar iluminada con luz reflejada. Las zonas de
inhibicin deben ser circulares y no observarse colonias aisladas, caso contrario deber repetirse el
ensayo.
A partir de esta lectura, de acuerdo a la medida de los dimetros de los halos se podr categorizar al
microorganismo como sensible, con sensibilidad intermedia o resistente al antimicrobiano. Para ello se
debern consultar las Tablas CLSI Puntos de corte para la interpretacin de las pruebas de
sensibilidad a los antimicrobianos por el mtodo de difusin especfica para el microorganismo que se
est evaluando.
Las categoras se asignan de acuerdo a la respuesta de la cepa bacteriana frente a cada
antimicrobiano, y se detallan a continuacin:
Sensible: el microorganismo inhibe su desarrollo por la presencia del antimicrobiano en la dosis
aplicada en el disco. Esto implica que una infeccin debida a este microorganismo puede ser
apropiadamente tratada con la dosis del antimicrobiano recomendada para ese
microorganismo.
Resistente: el microorganismo contina desarrollndose en presencia del antimicrobiano en la
dosis aplicada en el disco. Por lo tanto, este microorganismo no es inhibido por tal
concentracin de antimicrobiano, pudiendo sugerir un mecanismo de resistencia especfico,
como por ejemplo la produccin de -lactamasas.
Sensibilidad intermedia: estos microorganismos podran ser inhibidos por concentraciones
mayores, mientras que las dosis puedan elevarse.

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Fig. 5.2: Esquema para realizar la tcnica de antibiograma por el mtodo de difusin en disco.

Fig. 5.3: Antibiograma de una cepa perteneciente a la familia Enterobacteriaceae.

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Tabla 5.1: Puntos de corte para la interpretacin de las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos
por el mtodo de difusin correspondiente a Enterobacteriaceae (adaptado de CLSI Table 2 A
Enterobacteriaceae M2-Disk Diffusion January 2006)
Dimetro en mm
Antimicrobiano
Disco (carga g)
Resistente
Intermedio
Sensible
Penicilinas (inhibidor de la sntesis de la pared celular)
Ampicilina
10
13
14 -16
17
Piperacilina
100
17
18 - 20
21
Carbenicilina
100
19
20 - 22
23
Combinacin -lactmico/ inhibidor de -lactamasa (inhibidor de la sntesis de la pared celular)
Amoxicilina/clavulnico
20/10
13
14 - 17
18
Ampicilina/sulbactama
10/10
11
12 - 14
15
Piperacilina/taxobactama 100/10
17
18 - 20
21
Cefalosporinas de 1, 2, 3 y 4 generacin (inhibidor de la sntesis de la pared celular)
Cefazolina
30
14
15 - 17
18
Cefalotina
30
14
15 - 17
18
Cefepima
30
14
15 - 17
18
Cefoxitina
30
14
15 - 17
18
Cefotaxima
30
14
15 - 22
23
Ceptacidima
30
14
15 - 17
18
Carbapenemes (inhibidor de la sntesis de la pared celular)
Ertapenem
10
15
16 - 18
19
Imipenem
10
13
14 - 15
16
Meropenem
10
13
14 - 15
16
Monobactames (inhibidor de la sntesis de la pared celular)
Aztreonam
30
15
16 - 21
22
Aminoglucsidos (inhibidor de la sntesis proteica)
Gentamicina
10
12
13 - 14
15
Amicacina
30
14
15 - 16
17
Estreptomicina
10
11
12 - 14
15
Tetraciclinas (inhibidor de la sntesis proteica)
Tetraciclina
30
14
15 - 18
19
Anfenicoles (inhibidor de la sntesis proteica)
Cloranfenicol
30
12
13 - 17
18
Quinolonas (inhibidor de la sntesis de cidos nucleicos)
cido nalidxico
30
13
14 - 18
19
Inhibidores de la va del folato (inhibidor de vas metablicas)
Trimetoprima- sulfametoxazol
1,25/23,75
10
11 - 15
16
Sulfonamidas
250
12
13 - 16
17
Trimetoprima
5
10
11 - 15
16

Bibliografa

MANUAL PRCTICO DE MICROBIOLOGA - Tomo II: Microbiologa Ambiental II


Manacorda A. M., lvarez A. S., Pezzullo S. D. & Cuadros D. P.

Ao 2014

Administracin Nacional de Laboratorios e Institutos de Salud Dr. Carlos Malbran (ANLIS). 2007.
Redes Nacionales de Laboratorio. Ministerio de Salud. Secretara de Polticas, Regulacin y
Relaciones Sanitarias. Argentina.
Alonso A, Snchez P, Martnez J. 2001. Environmental selection of antibiotic resistance genes.
Minireview. Environmental Microbiology. 3 (1): 1-9.
Basualdo J. A., Coto C. E., de Torres R. A.; 1996. Microbiologa Biomdica. Editorial Atlantis.
Famiglietti A. 2008. Antimicrobianos (Mdulo 4). Segunda Edicin. Editorial Publicaciones
Latinoamericanas. Asociacin Argentina de Microbiologa, Colegio de Bioqumicos de la provincia de
Entre Ros y Facultad de Bioqumica y Ciencias Biolgicas de la Universidad Nacional del Litoral. pp.
128. Argentina.
Madigan M. T, Martinko G. M., Parker J. 2004. Brock, Biologa de los Microorganismos.10 ed. Editorial
Prentice Hall INC. Espaa.
Organizacin Mundial de la Salud (OMS), 2010. Boletn Informativo de la OMS. Renovar los esfuerzos
de contencin de la resistencia a los antimicrobianos. Krisantha Weerasuriya, John Stelling & Thomas
F O'Brien.