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MANUAL PRCTICO DE MICROBIOLOGA - Tomo II: Microbiologa Ambiental II

Manacorda A. M., lvarez A. S., Pezzullo S. D. & Cuadros D. P.

Ao 2013

Captulo 6
RECUENTO DE MICROORGANISMOS HETEROTROFOS TOTALES
EN SUELO
Objetivo
Determinar el tamao de la poblacin de diferentes tipos de suelo mediante la Tcnica
de Recuento del Nmero ms Probable (NMP).
Introduccin
El suelo representa uno de los hbitats microbianos ms significativos, tanto en trminos de
biomasa como de actividad microbiana. El suelo alberga gran riqueza de especies vegetales,
animales y microbianas. Los microorganismos del suelo son los que mantienen activo el ciclo
de los nutrientes de los compuestos qumicos ms importantes C, N, S, P que las plantas
requieren para su crecimiento. Entre los organismos del suelo se establecen interacciones que
contribuyen en las caractersticas propias del suelo.
La actividad microbiana del suelo refleja las reacciones bioqumicas que suceden dentro de
este complejo y heterogneo sistema. Los mismos tienen funciones claves en el equilibrio del
ecosistema.
Este ambiente alberga una gran cantidad de microorganismos que se nutren de los exudados
radiculares, ricos en aminocidos, cidos orgnicos y factores de crecimiento, como as
tambin favorece distintos tipos de interacciones biolgicas. Los microorganismos son
fundamentales en los procesos biolgicos y como promotores del crecimiento vegetal.
La distribucin de los microorganismos en el suelo siguen patrones de agregacin y es muy
dinmica. En ella influyen factores intrnsecos (relacionados con caractersticas de cada
microorganismo) y factores extrnsecos (aquellos que proceden del ambiente). Esto factores
que regulan la distribucin de los microorganismos desde el ambiente son: estructura del suelo,
disponibilidad de agua, el pH, la temperatura, el potencial redox y la disponibilidad de materia
orgnica.
La rizsfera es la regin del suelo cercano a las races de las plantas, y es considerado un
ambiente apropiado para el desarrollo de los microorganismos por la presencia exudados
radicales y humedad, como dos principales caractersticas. En la rizsfera ocurren importantes
interacciones microbianas que implican el intercambio o la competencia por nutrientes y hbitat.
Algunas son relaciones simbiticas, por ejemplo entre bacterias u hongos con las races de las
plantas (micorrizas, ndulos para la fijacin de nitrgeno) y otras son relaciones antagnicas,
como ser predacin (protozoos bacteria), amensalismo (produccin de antibiticos) y
parasitismo (hongos que atacan las races de las plantas).
La composicin de los microorganismos del suelo es muy diversa, encontrndose bacterias,
hongos, actinomicetos, protozoos y algas. La poblacin bacteriana hetertrofa aerobia est
compuesta principalmente por gneros gram positivos, siendo la mayora de los gneros
Clostridium, Bacillus, Arthobacter. La poblacin gram negativa generalmente est compuesta
por los gneros Pseudomonas, Flavobacterium, Rizobium, Azospirilum, entre otros. Los
actinomicetes caractersticos del suelo pertenecen al gnero Streptomices y Nocardia, tienen
funciones importantes en la descomposicin de materia orgnica y produccin de antibiticos.
Los hongos contribuyen en gran medida a la biomasa microbiana del suelo, en cuanto a tamao
de la poblacin, diversidad y funciones. Los gneros ms comunes son Penicillium, Aspergillus,
Fusarium, Cladosporium, Mucor, entre muchos otros.
Es importante, adems, tener en cuenta que cuando microorganismos indeseables penetran en
el suelo pueden cambiar sus propiedades, desequilibrando la distribucin y el orden de la
comunidad nativa. La presencia de microorganismos patgenos implica un riesgo para la salud,
por la posible transmisin de enfermedades por el contacto con dicho suelo

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El reconocimiento de esta diversidad de microorganismos en el suelo, y el estudio de sus


funciones contribuye al conocimiento global del ambiente, incluyendo su interaccin con la
atmsfera y ecosistemas acuticos, lo que reviste un pilar fundamental para lograr ecosistemas
sustentables.
Tcnica de Recuento del Nmero Ms Probable
Las tcnicas del Nmero Ms Probable (NMP) se basan en el concepto de que el nivel de
dilucin de la muestra original necesaria para obtener un resultado negativo en un medio de
cultivo particular est relacionado con el tamao de la poblacin en la misma. El nmero de
microorganismos obtenido est determinado por frmulas de probabilidad, un clculo de la
densidad media de microorganismos hetertrofos en la muestra.
En este caso el inters est puesto en los microorganismos con un metabolismo hetertrofo por
lo tanto el medio de cultivo particular a utilizar es el caldo Nutritivo. Por las caractersticas de
sus componentes es un medio usado para el cultivo de microorganismos poco exigentes en sus
requerimientos nutricionales.
caldo Nutritivo
Pluripeptona
Extracto de carne
Agua destilada c.s.p
pH final: 6,9 0,2

5 gr
3 gr
1000 ml

Procedimiento
Se pesa 1 g de la muestra de suelo a examinar y se diluye en un tubo de ensayo que contenga
-1
9 ml de agua destilada (A.D) estril. A dicho tubo se lo rotular 10 . Esto corresponde al
primer nivel de dilucin (1:10).
Se agita en el vrtex la primer dilucin y se toma 1 ml del sobrenadante con una pipeta estril,
-2
agregando dicho volumen a un segundo tubo con A.D estril. Este tubo ser rotulado como 10
(1:100), correspondiente al segundo nivel de dilucin.
Se procede realizando las diluciones sucesivas hasta obtener una dilucin 1:10.000.000.000,
-10
que ser la dilucin 10 .
De esta manera se espera que los primeros tubos tengan mayor concentracin microbiana y
que en los ltimos tienda a cero.
Una vez que se dispone de las diluciones de las muestras, estos 10 tubos conteniendo la
solucin del suelo, se procede a sembrar una alcuota de cada uno de ellos en caldo nutritivo
(fig 1). Se toma con una pipeta automtica 0,1 ml de cada dilucin, el procedimiento se realiza
por triplicado. En este caso se siembran tres tubos para cada dilucin aunque se pueden utilizar
tambin cinco rplicas de cada uno de ellos, lo que disminuye el desvo.
Los tubos sembrados se incuban durante 7 das a 20 C. Finalizado este tiempo se procede a
realizar el recuento.

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Fig. 1: Diluciones seriadas y siembra en caldo nutritivo por triplicado


Nota: debe tenerse en cuenta que la muestra utilizada siempre tiene cierto nivel de
humedad, por lo tanto los resultados obtenidos estn en relacin con un gramo de peso
hmedo y debern referirse a un gramo de peso seco. Para ello se toman 5 g de la muestra
sembrada, se lleva a estufa, a 100 C durante 48 hs., y se toma el nuevo peso de dicha
porcin. Con estos datos se calcula el porcentaje de humedad de la muestra de suelo para
luego corregir el nmero de bacterias hallado.

Clculo del Nmero mas Probable


Al cabo de una semana se leen los resultados, tomndose como positivos a aquellos tubos con
desarrollo (se ven turbios debido a la proliferacin de microorganismos).
Se toma nota, para cada dilucin, del nmero de tubos positivos (+) y se obtiene un nmero
caracterstico representado por tres cifras. El primer dgito del nmero caracterstico
corresponder al menor nivel de dilucin en el que todos los tubos sean positivos.
Una vez que se ha obtenido el nmero caracterstico, con el mismo se ingresa en la tabla y se
lee el nmero ms probable de microorganismos. En este caso, en el que el inculo de partida
es un gramo de suelo, se refiere el nmero final al peso seco de la muestra. Para ello se deber
calcular la humedad de la misma (ver Nota). Al nmero obtenido se lo multiplica por la inversa
de la dilucin (dilucin de donde se obtuvo el primer dgito del nmero caracterstico).
En la tabla de Mc Crady figuran todas las combinaciones posibles para las que se ha calculado,
mediante un mtodo estadstico, el nmero ms probable de microorganismos presentes en la
muestra.
Tabla de Mc Crady (para tres rplicas por dilucin)
Nmero
caracterstico
000
001
010

Nmero de
M.O.*
0,0
0,3
0,3

Nmero
caracterstico
201
202
210

Nmero de
M.O.*
1,4
2,0
1,5

Nmero
caracterstico
302
310
311

Nmero de
M.O.*
6,5
4,5
7,5

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011
020
100
101
102
110
111
120
121
130
200

0,6
0,6
0,4
0,7
1,1
0,7
1,1
1,1
1,5
1,6
0,9

211
212
220
221
222
223
230
231
232
300
301

2,0
3,0
2,0
3,0
3,5
4,0
3,0
3,5
4,0
2,5
4,0

Ao 2013

312
11,5
313
16,0
320
9,5
321
15,0
322
20,0
323
30,0
330
23,0
331
45,0
332
110,0
333
140,0
* M.O : microorganismos

En la siguiente tabla se indican, a modo de ejemplo, los resultados obtenidos para dos siembras
distintas con tres repeticiones para cada nivel de dilucin.
-1

Nivel de dilucin
Ejemplo 1

10
+++
(3)
+++
(3)

Ejemplo 2

-2

10
+++
(3)
++(2)

-3

10
+++
(3)
++(2)

-4

10
+++
(3)
--(0)

10
+-(1)
--(0)

-5

10
--(0)
--(0)

-6

10
--(0)
--(0)

-7

10
--(0)
--(0)

-8

10
--(0)
--(0)

-9

10
--(0)
--(0)

-10

-4

Ejemplo 1: nmero caracterstico 310 (para la dilucin 10 )


-1
Ejemplo 2: nmero caracterstico 322 (para la dilucin 10 )
Nmero caracterstico
310
322

Ejemplo 1
Ejemplo 2

N.M.P de microorganismos
4,5
20

A este nmero obtenido de la tabla debe multiplicrselo por la inversa de la menor dilucin en
la que se han hallado 3 (+), es decir que corresponde a la dilucin de la primer cifra del nmero
caracterstico.
4

Ejemplo 1: 4,5x10 bacterias/g de suelo hmedo


1
Ejemplo 2: 20x10 bacterias /g de suelo hmedo
Adems, como se seal anteriormente, a este valor se lo debe corregir en funcin del
porcentaje de humedad de la muestra.
Bibliografa
American Public Health Association (APHA), American Water Works Association & Water
Pollution Control Federation. 1989. Standard Methods for the examination of Water and
Wastewater. 17th ed. APHA, Washington, D.C.USA. Part 9000.