Procedimientos de muestreo para diagnóstico de enfermedades en animales acuáticos

LABD/NT1/diciembre 2012
PROGRAMA SANITARIO GENERAL

LABORATORIOS DE DIAGNSTICODE ENFERMEDADES
DE ANIMALES ACUTICOS
NORMA TCNICA
N1
Procedimientos para el muestreo de animales acuticos.
UNIDAD DE SALUD ANIMAL

SERVICIO NACIONAL DE PESCA Y ACUICULTURA
CHILE
1
NDICE
I.
II.
III.
IV.
V.
OBJETIVOS
ALCANCE
DEFINICIONES.
PERSONAL .
MATERIALES
4
4
5
5
6
1.
2.
3.
VI.
VII.
1.
Materiales de diseccin
Materiales para transporte y mantencin de las muestras ..
Materiales para identificacin de las muestras
BIOSEGURIDAD
PROCEDIMIENTOS DE MUESTREO
MUESTREO
PARA EL PROGRAMA SANITARIO ESPECFICO DE
VIGILANCIA ACTIVA PARA ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN PECES
DE CULTIVO (PSEV) .
6
6
7
7
8
Personal
Seleccin de peces .
Extraccin de rganos ..
Nmero de muestras a extraer ..
Contramuestras .
Conservacin y traslado de muestras
Muestras para cultivo celular
Muestras para anlisis de RT-PCR .
MUESTREO PARA EL PROGRAMA SANITARIO ESPECIFICO DE
VIGILANCIA ACTIVA PARA ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN
MOLUSCOS (PVM)
8
8
9
10
10
10
10
12
Personal
Seleccin de ejemplares.
Nmero de muestras a extraer ..
Contramuestras ..
Conservacin y traslado de muestras al laboratorio
MUESTREO PARA EL PROGRAMA GENERAL DE MANEJO SANITARIO DE
LA REPRODUCCIN (PSGR)
14
14
14
14
15
3.1
3.2
3.2.1
3.2.2
3.2.2.1
3.2.2.2
3.3
3.4
3.5
4.
Personal ..
Extraccin de muestras .
Muestreo con sacrificio
Muestreo sin sacrificio .
Biopsia de branquias
Fluidos celmico, seminal o sangre .
Muestras a extraer .
Contramuestras
Conservacin y traslado de muestras al laboratorio .
MUESTREO PARA EL PROGRAMA ESPECFICO DE VIGILANCIA Y
CONTROL DE LA ANEMIA INFECCIOSA DEL SALMN (PSEVC ISA)
16
16
16
17
17
17
18
18
19
20
4.1
4.2
Personal ..
Seleccin de peces .
1.1
1.2
1.3
1.4
1.5
1.6
1.6.1
1.6.2
2.
2.1
2.2
2.3
2.4
2.5
3.
13
16
20
20
4.3
4.4
4.5
4.6
5.
Extraccin de rganos .
Nmero de muestras a extraer y frecuencia de muestreos .
Contramuestras
PROGRAMA SANITARIO ESPECIFICO DE VIGILANCIA Y CONTROL DE
PISCIRICKETTSIOSIS (PSEVC-PISCIRICKETTSIOSIS)
20
21
22
22
23
4.1
4.2
4.3
4.4
4.5
4.6
Personal ..
Seleccin de peces .
Extraccin de rganos .
Nmero de muestras a extraer y frecuencia de muestreos .
Contramuestras
23
23
24
24
24
25
VIII.
BIBLIOGRAFA
27
I.
OBJETIVOS
Establecer procedimientos estandarizados para ser aplicados en la extraccin,
manipulacin y obtencin de animales acuticos, rganos o fluidos de peces que
sern utilizados como muestras para el diagnstico de enfermedades de alto
riesgo EAR, incluyendo las medidas de bioseguridad del lugar en el que se realice
el muestreo y del personal, necesarias para obtener una muestra apropiada para
anlisis.
II.
ALCANCE
Las condiciones tcnicas y procedimientos estandarizados que se establecen en la
presente norma tcnica, sern aplicables a los muestreos que se realicen en
centros de cultivo de animales acuticos para el diagnstico de enfermedades
exigidos en los programas sanitarios generales y especficos, establecidos en
conformidad con el D.S. N 319, de 2001, del Ministerio de Economa, Fomento y
Reconstruccin, actualmente Ministerio de Economa, Fomento y Turismo, esto es,
Programa Sanitario Especfico de Vigilancia de Enfermedades de Alto Riesgo
(PSEV), Programa Sanitarios Especfico de Vigilancia Activa para Enfermedades
de Alto Riesgo en Moluscos (PVM), Programa Sanitario General de Manejo de la
Reproduccin (PSGR), Programa Sanitario Especfico de Vigilancia y Control de
ISA (PSEVC ISA). Programa Sanitario de Vigilancia y Control de Piscirickettsioisis
(PSEVC Piscirickettsiosis), y dems que se dicten. Asimismo, establece las
condiciones y el procedimiento para el envo y traslado de estas muestras a los
laboratorios de diagnstico registrados por el Servicio.
El procedimiento de muestreo que se describe deber ser aplicado tanto por los
funcionarios del Servicio Nacional de Pesca en muestreos oficiales como por los
certificadores de la condicin sanitaria, personal de los laboratorios de diagnstico
registrados y de los centros de cultivo, cuando la normativa as lo considere.
III. DEFINICIONES
a)
Certificador de la condicin sanitaria: mdico veterinario incorporado en el

registro establecido en conformidad con el articulo 122 letra K de la Ley General de
Pesca y Acuicultura, acreditado para certificar la condicin sanitaria de las
especies hidrobiolgicas en el marco del Reglamento y los Programas Sanitarios
Generales y Especficos.
b)
Reglamento o RESA: Reglamento de Medidas de Proteccin, Control y

Erradicacin de Enfermedades de Alto Riesgo para las Especies Hidrobiolgicas,
aprobado por el D.S. N 319, de 2001, del Ministerio de Economa, Fomento y
Reconstruccin, hoy Ministerio de Economa, Fomento y Turismo.
c)
Reproductores: peces que han alcanzado su madurez sexual, sea que provengan
del mar para desove, fueron desovados en temporadas anteriores y permanecieron
en agua dulce o han estado siempre en agua dulce.
d)
Unidad Epidemiolgica, unidad o UE: designa un grupo de ejemplares en una

piscicultura, con una localizacin definida, que tienen en comn el mismo riesgo
de exposicin a un agente patgeno. Ello puede deberse a que comparten el
mismo medio acutico o a que las prcticas de gestin hacen probable que un
agente patgeno de un grupo de animales se transmita rpidamente a otros.
e)
Servicio o Sernapesca: Servicio Nacional de Pesca.
IV.
PERSONAL
El laboratorio de diagnstico ser responsable de que el personal que realice los
muestreos cumpla con los requisitos profesionales o capacitacin exigidos por el
Servicio en los procedimientos especficos que ms adelante se indican, segn el
programa sanitario al que corresponda el muestro a realizar.
Para efectuar un muestreo, el personal deber contar con indumentaria adecuada,

la que considerar, a lo menos, delantal limpio o desechable, botas limpias y
desinfectadas y guantes desechables de primer uso. Tal indumentaria deber ser
proporcionada por la empresa de cultivo; si as no fuere, se utilizar indumentaria
propia que cumpla las condiciones antes indicadas.
V.
MATERIALES
El muestreador deber contar con los materiales necesarios para la extraccin de
las muestras, conforme las exigencias especficas indicadas en los procedimientos
de muestreo para los diferentes programas incluidos en este documento. Entre
ellos se incluyen:
1.
Materiales para diseccin:
Pinzas anatmicas y quirrgicas estriles.

Tijeras romas y con punta estriles.
Mangos de bistur estriles.
Hojas de bistur desechables.
Bolsas de basura para retiro de material orgnico e inorgnico.
Bolsas plsticas.
Alcohol 70 u otro que no afecte la condicin de las muestras.
Pipetas plsticas desechables.
Papel absorbente desechable.
Depsito con agua limpia.
Aspersores con desinfectante (viricida).
Mechero.
2.
Materiales para el transporte y mantencin de muestras:
Tubos con preservante de RNA/DNA.

Tubos con medio de transporte.
Hielera o caja de polietileno expandido.
Hielo o Gelpack (previamente congelados y desinfectados).

Gradillas para tubos o lminas de polietileno expandido.
Cinta adhesiva.
Termgrafo o dispositivo para registro de temperatura.
Bolsas plsticas.
3.
Materiales para identificacin de las muestras:
Plumn de tinta indeleble lpiz grafito.

Cinta adhesiva de papel.
Baja lenguas desechable.
VI. BIOSEGURIDAD
Al momento de realizar un muestreo, el personal responsable deber respetar
todos los filtros sanitarios dispuestos por los centros de cultivo y exigir el
cumplimiento de todas las medidas de bioseguridad entre una y otra jaula o unidad
epidemiolgica, tales como desinfeccin de quies, lances, buzos, quechas, entre
otros.
Si en el centro de cultivo se solicita como medida de bioseguridad que en la toma
de muestras no se utilicen materiales externos al centro (bolsas, hielera, etc.), se
deber acceder a tal peticin, siempre y cuando ste proporcione los materiales
adecuados.
Los muestreadores que realicen procedimientos en un centro positivo a una
enfermedad infecciosa para la cual se haya establecido un programa especfico de
control, no podrn realizar muestreos en otros centros de cultivo con especies
susceptibles a esta, sino una vez que haya transcurrido un periodo mnimo de 24
hrs.
VII. PROCEDIMIENTOS DE MUESTREO

1.
MUESTREO PARA EL PSEV

Los procedimientos de muestreo que se describen en este numeral se aplicarn a
seleccin de peces y extraccin de rganos para el diagnstico de las
Enfermedades de Alto Riesgo (EAR) Lista 1, establecidas en la resolucin vigente
emitida por la Subsecretara de Pesca.
1.1. Personal
El muestreo para el PSEV ser realizado por certificadores de la condicin
sanitaria.
1.2. Seleccin de peces
En la seleccin de peces a muestrear se considerar proporcionalmente todas las
unidades epidemiolgicas o las jaulas, segn corresponda, las especies y los
grupos de peces de la misma generacin.
Si existe ms de una fuente de agua para la produccin, la muestra deber incluir
peces que representen a todas las fuentes.
De preferencia se deber seleccionar ejemplares enfermos y completar con
ejemplares sanos. Para estos efectos, los ejemplares deformes no se considerarn
enfermos.
Los criterios de proporcionalidad antes indicados podrn ser modificados si en la
inspeccin se sospecha de la presencia de una EAR de la lista 1. En tal caso, se
dejar un registro de las razones que motivaron tal decisin, incluyendo esta
informacin en el informe sanitario correspondiente.
1.3. Extraccin de rganos

Preferentemente se deben enviar peces vivos o enteros; si no es posible, las
muestras de rganos o tejidos sern extradas conforme las siguientes
especificaciones, siendo obligatorio durante todo el proceso el uso de guantes.
En primer lugar, se deber depositar el pescado sobre un papel absorbente
desechable, limpio, seco y antideslizante. A continuacin, utilizando un bistur, se
realizar un corte en la zona lateral, paralela a la lnea media ventral desde
craneal a caudal, y luego, un segundo corte desde las branquias hacia la lnea
media ventral.
Una vez expuestos los rganos por remocin de la pared lateral, se extraern
trozos de 5 mm3 de los rganos blanco, esto es, rin, bazo, corazn. La muestra
de encfalo ser extrada tras cortar la cabeza al nivel del borde posterior del
oprculo y apretar lateralmente.
Entre muestras de distintas unidades epidemiolgicas o jaulas se deber cambiar
todo el material desechable (papel absorbente, guantes, hoja de bistur, etc.) y
limpiar y desinfectar la superficie y el material reutilizable (pinzas, mango de
bistur, etc.).
Tratndose de alevines y alevines con saco, el pez se enviar completo sin saco
vitelino. En el evento que stos se depositen en preservante, se deber abrir la
cavidad abdominal y cortar oprculos.
A los peces muestreados que tengan una talla entre 4 a 6 centmetros se les
deber extraer como muestra de anlisis todas las vsceras, incluyendo rin,
bazo, encfalo y corazn.
Finalmente, los restos de peces que queden de la toma de muestra, se
adicionarn al tratamiento de mortalidad del centro o se dispondrn como
desecho biolgico en el laboratorio.
1.4. Nmero de muestras a extraer

Se deber extraer el nmero de muestras establecido en el PSVE, considerando el
tipo de centro, la cantidad de peces en cultivo y los diferentes estados, cuando
corresponda.
Las muestras podrn conformar pooles para anlisis considerando un mximo de 5
peces por pool, provenientes de una misma unidad epidemiolgica o jaula.
1.5. Contramuestras
Simultneamente a la extraccin de las muestras de tejido para anlisis, deber
extraerse una contramuestra, la que deber ser conservada debidamente rotulada
a 20C por cada pool analizado, y se mantendr hasta que se haya obtenido
resultado negativo del ltimo subcultivo. Mientras exista un resultado sospechoso o
positivo la contramuestra deber mantenerse debidamente congelada.
Alternativamente, la contramuestra podr ser separada una vez que las muestras
hayan sido trasladadas al laboratorio de diagnstico en que se realizarn los
anlisis. En el caso de las determinaciones que se realicen mediante tcnicas
moleculares, se podr conservar como contramuestra homogeneizado de los
rganos de los peces que constituyen la muestra.
La contramuestra slo podr ser utilizada por Sernapesca o por el laboratorio con
autorizacin expresa del Servicio.
1.6.
Conservacin y traslado de las muestras al laboratorio
1.6.1. Muestras para cultivo celular

En los casos en que el tiempo que medie entre la toma de muestra y el inicio de los
anlisis no supere las 24 horas, las muestras podrn ser mantenidas en
condiciones de refrigeracin (4-10C
0.5C) en contenedores adecuados que
cuenten con un sistema de registro de temperatura, que permita garantizar la
mantencin de la cadena de fro.
10
Cuando el tiempo que medie entre la toma de muestra y el inicio de los anlisis
supere las 24 horas, considerando un tiempo mximo de 72 horas, ya sea en el
mismo centro de cultivo o bien en un lugar especialmente habilitado por el
laboratorio para ello, se extraern, con instrumental de diseccin estril, parte de
los rganos de los peces que debern ser examinados y se introducirn en
contenedores estriles con medio de cultivo celular o con solucin salina
equilibrada de Hanks (HBSS) adicionada con antibiticos, en proporcin 1:5.
Las concentraciones adecuadas de antibiticos son: gentamicina (100 g/ml) o
penicilina (800 UI/ml) y estreptomicina (800 g/ml). Tambin puede incorporarse al
medio de transporte los compuestos antifngicos Mycostatin o Fungizona a una
concentracin final de 400 UI/ml. Para estabilizar los virus, si el tiempo de
transporte supera las 12 hrs, se puede aadir suero o albmina (5-10%).
Las muestras debern ser mantenidas en condiciones de refrigeracin (4-10C
0.5C) en contenedores adecuados que cuenten un sistema de registro de
temperatura, que permita garantizar la mantencin de la cadena de fro.
Las muestras deben ser enviadas al laboratorio de anlisis de forma tal de
asegurar su identificacin y dispuestas en un doble contenedor (muestras en
bolsas y stas dentro de cajas de polietileno expandido) con material refrigerante
(gel pack).
Los contenedores deben ser debidamente sellados para evitar su alteracin o
manipulacin. Adems, a su llegada al laboratorio debern ser minuciosamente
revisados, especialmente en lo referente a la temperatura interior, que no deber
exceder los 10C. Asimismo, se deber verificar la existencia de bloques
refrigerantes (gel pack) o hielo an congelados total o parcialmente.
1.6.2. Muestra para anlisis RT-PCR

En los casos en que el tiempo que medie entre la toma de muestra y el inicio de
los anlisis no supere las 24 horas, las muestras debern ser mantenidas en
11

0,5 C o inferior) en contenedores
adecuados que cuenten con un sistema de registro de temperatura, que permita
garantizar la mantencin de la cadena de fro.
Por su parte, cuando el tiempo que medie entre la toma de muestra y el inicio de
los anlisis supere las 24 horas, ya sea en el laboratorio, centro de cultivo o bien
en un lugar especialmente habilitado por el laboratorio para ello, se extraern los
rganos, con instrumental de diseccin, y se introducirn en recipientes con
preservante de RNA comercial o etanol PA en una proporcin 1:10. En los casos
en que se utilice etanol como preservante de RNA, las muestras debern se
mantenidas en condiciones de refrigeracin (4 10 C
0,5 C o inferior) en
contenedores adecuados que cuenten con un sistema de registro de temperatura,
que permita garantizar la mantencin de la cadena de fro hasta la llegada al
laboratorio.
Las muestras debern ser enviadas de forma tal de asegurar su identificacin y
dispuestas en un doble contenedor (muestras en bolsas y stas dentro de cajas
de polietileno expandido). Los contenedores debern ser debidamente sellados
para evitar su alteracin o manipulacin, lo que deber ser minuciosamente
chequeado a la llegada al laboratorio.
En el caso de las determinaciones que se realicen mediante tcnicas moleculares,
se podr conservar como contramuestra homogeneizado de los rganos de los
peces que constituyen la muestra.
2.
MUESTREO PARA EL PVM

Los procedimientos de muestreo que se describen en este numeral se aplicarn a
seleccin de moluscos para el diagnstico de las Enfermedades de Alto Riesgo
(EAR) Lista 1, establecidas en la resolucin vigente emitida por la Subsecretara
de Pesca.
12
2.1. Personal
El muestreo para el PVM ser realizado por certificadores de la condicin sanitaria.
2.2. Seleccin de ejemplares
En la seleccin de individuos a muestrear se considerar proporcionalmente todas
las unidades epidemiolgicas o estructuras y especies, segn corresponda. Si
existe ms de una fuente de agua para la produccin, la muestra deber incluir
ejemplares que representen a todas las fuentes.
En el muestreo se privilegiar la obtencin de ejemplares que presenten
anormalidades tales como crecimiento anormal y alta mortalidad.
Los criterios de proporcionalidad antes indicados podrn ser modificados si en la
inspeccin se sospecha de la presencia de una EAR de la lista 1. En tal caso, se
dejar un registro de las razones que motivaron tal decisin, incluyendo esta
informacin en el informe sanitario correspondiente.
2.3. Nmero de muestras a extraer

Se deber extraer el nmero de muestras establecido en el PVM, considerando el
tipo de centro, la cantidad de ejemplares en cultivo y los diferentes estados,
cuando corresponda.
Cuando la tcnica diagnstica lo permita, las muestras podrn conformar pooles
para anlisis, con un mximo de 5 ejemplares por pool, provenientes de una
misma unidad epidemiolgica o estructura.
2.4. Contramuestras
Simultneamente a la extraccin de las muestras, deber extraerse una
contramuestra, la que deber ser conservada debidamente rotulada. Mientras
13
exista un resultado sospechoso o positivo la contramuestra deber mantenerse

debidamente conservada.
La contramuestra podr ser separada una vez que las muestras hayan sido
trasladadas al laboratorio de diagnstico en que se realizarn los anlisis. En el
caso de las determinaciones que se realicen mediante tcnicas moleculares, se
podr conservar como contramuestra homogeneizado de los rganos de los
ejemplares que constituyen la muestra.
2.5.
Conservacin y traslado de las muestras al laboratorio

Los ejemplares muestreados deben ser enviados vivos y mantenidos hasta su
llegada al laboratorio en condiciones que garanticen su integridad y trazabilidad.
En caso que las muestras que no pueden ser entregadas en vivas al laboratorio de
diagnstico, debido a las etapas avanzadas de la enfermedad, largas distancias o
conexiones lentas de transporte, entre otros, debern fijarse en el lugar de
muestreo en los caso que el diagnstico de las enfermedades a analizar incluya,
por ejemplo, histologa o posterior examen de microscopa electrnica.
Para otras tcnicas que requieran tejidos frescos, tales como frotis fresco,
bacteriologa, micologa o cultivo, las muestras podrn ser enviadas refrigeradas
siempre que no se supere el plazo de 24 hrs. En caso de diagnstico por PCR, las
muestras podrn ser enviadas congeladas, fijadas o en preservante de material
gentico.
Las muestras de los moluscos debern ser empacadas de forma adecuada a fin de
mantenerlos vivos, y debern ser enviadas tan pronto como sea posible despus
de su extraccin del agua a fin de reducir el almacenamiento de aire y la posible
mortalidad durante el transporte, especialmente en caso de ejemplares moribundos
o enfermos.
Con todo, los procedimientos relacionados con la obtencin, manipulacin,
conservacin y traslado de las muestras al laboratorio de diagnstico, debern
14
realizarse en conformidad con lo establecido en el punto 2.4.0 del Manual de

Pruebas Diagnsticas para Animales Acuticos, de la Organizacin Mundial de
Sanidad Animal (OIE).
3.
MUESTREO PARA EL PSGR

Los procedimientos de muestreo para este programa consideran la extraccin de
muestras de tejidos, rganos o fluidos para el control individual de reproductores
salmnidos al momento del desove, deteccin de los agentes causales de la
Necrosis Pancretica Infecciosa (IPN), Renibacteriosis (BKD) y Anemia Infecciosa
del Salmn (ISA).
3.1. Personal
El muestreo para el chequeo individual de reproductores podr ser realizado por
profesionales o tcnicos egresados de carreras de ciencias biolgicas, los que
debern haber sido sometidos a un programa de capacitacin especfico, por parte
del laboratorio en el que se desempeen. El laboratorio deber mantener debido
registro de las capacitaciones realizadas.
3.2. Extraccin de muestras
3.2.1. Muestreo con sacrificio
Luego del desove, se deber realizar una incisin longitudinal al reproductor, a
nivel de la lnea media ventral. A continuacin, se proceder a exponer los
rganos a muestrear, indicados en el numeral 2.3.
15
3.2.2.
Muestreo sin sacrificio
3.2.2.1. Biopsia de branquias

En el caso de aquellos reproductores que sean sometidos a varios desoves en la
temporada, la muestra para diagnstico ISA podr ser obtenida mediante biopsia
de branquia.
Este muestreo y anlisis deber efectuarse en cada desove. Al trmino de la vida
productiva de los reproductores deber realizarse el diagnstico a partir de
rganos.
Los individuos debern ser previamente anestesiados y la extraccin de la muestra
deber realizarse de forma tal, que asegure el mnimo sangrado de los peces.
Luego de la biopsia, los reproductores debern ser introducidos individualmente en
una solucin desinfectante, por el tiempo y a la dosis suficiente que garantice la
eliminacin de potenciales patgenos que hayan contaminado externamente al
pez, producto del sangrado. Solo una vez que ste haya cesado completamente
podrn ser devueltos a sus estanques. Los laboratorios debern contar con
antecedentes tcnicos que avalen la seguridad y efectividad del producto utilizado
y el tiempo de desinfeccin.
3.2.2.2. Fluidos celmico, seminal o sangre
En el caso de aquellos reproductores que sean sometidos a varios desoves en la
temporada, las muestras para diagnstico BKD e IPN podrn ser fluido celmico,
fluido seminal o sangre.
Las muestras de fluidos seminal y celmico podr ser obtenidas manualmente
(stripping o masaje) o mediante una cnula. Por su parte, la obtencin de la
muestra de sangre se realizar por puncin de la vena caudal, previa anestesia
de los peces.
16
3.3. Muestras a extraer

Los rganos blanco de los que se deben extraer las muestras de tejidos se
detallan en la siguiente tabla.
Tabla N 1: rganos y tejidos a muestrear para el PSGR
Tipo de
muestreo
Con sacrificio
Sin sacrificio
ISA
Corazn,
rin y
branquia
Branquia
IPN
BKD
Rin
Rin
Fluidos
seminal o
celmico.
Sangre.
Fluidos
seminal o
celmico.
Sangre.
Se extraern trozos de rganos de 5 mm3; en el caso del rin para anlisis de

IFAT ELISA se extraer aproximadamente 1 gramo de tejido del rgano,
incluyendo la parte anterior, media y posterior.
Las muestras podrn conformar pooles para anlisis considerando un mximo de
3 reproductores por pool.
Cuando se realicen anlisis de tipo molecular para el diagnstico de los tres
patgenos, podr realizarse una sola extraccin, considerando muestras que
incluyan rin, corazn y branquias.
3.4. Contramuestras
Simultneamente a la extraccin de las muestras de rganos o tejidos para
anlisis, se deber extraer una contramuestra equivalente, la que deber ser
posteriormente almacenada en el laboratorio, a una temperatura de al menos
20C, por un periodo no inferior a 15 das.
17
anlisis. En el caso de las determinaciones que se realicen mediante tcnicas
moleculares, se podr conservar como contramuestra homogeneizado de los
rganos de los peces que constituyen la muestra.
3.5. Conservacin y traslado de las muestras al laboratorio
Al momento de su extraccin, las muestras debern ser identificadas de manera
que se mantenga su trazabilidad desde el reproductor en el centro de cultivo,
hasta la obtencin del resultado en el laboratorio.
En los casos en que el tiempo del traslado de las muestras desde el lugar de
muestreo hasta el laboratorio para el inicio de los anlisis no supere las 24 hrs.,
las muestras debern ser mantenidas en condiciones de refrigeracin (4-10C
0,5 C) en contenedores adecuados que cuenten con un sistema de registro de
temperatura, que permita garantizar la mantencin de la cadena de fro.
En los casos que el tiempo de traslado supere las 24 hrs., las muestras para
anlisis molecular debern ser introducidas en tubos con un preservante de ARN
o etanol PA, en una relacin de 1:10 entre tejido y preservante. En caso de utilizar
etanol, las muestras debern se mantenidas en condiciones de refrigeracin (4
10 C 0,5 C o inferior).
Para el anlisis de BKD por tcnica de IFAT, se deber realizar el frotis en
terreno.
18
4.
MUESTREO PARA EL PSEVC ISA
4.1 Personal
El muestreo para el PEVC ISA ser realizado por certificadores de la condicin
sanitaria.
Previo a la seleccin de los ejemplares de la muestra, se deber recopilar
antecedentes productivos y sanitarios necesarios para la planificacin del
muestreo y la eleccin de las jaulas o unidades epidemiolgicas a muestrear.
Se deben tomar en cuenta, entre otros, el tipo de centro (engorda, esmoltificacin
o piscicultura), las especies cultivadas en l, los porcentajes de mortalidad por
unidad epidemiolgica o jaula de cultivo en las ltimas semanas.
Se privilegiar la extraccin de peces orillados, moribundos, desorientados o
mortalidad fresca del da (de menos de 12 horas) que no haya sido tratada con
desinfectante o inactivador. Si el nmero final de ejemplares no se completa con
peces en tales condiciones, se deber completar la muestra con peces elegidos al
azar.
Los peces extrados deben ser dispuestos en bolsas plsticas debidamente
cerradas y rotuladas, con la respectiva identificacin de jaula o unidad
epidemiolgica en forma clara y permanente, asegurando la trazabilidad de las
muestras hasta el momento de la extraccin de rganos.
El procedimiento de extraccin de rganos se realizar de acuerdo a lo descrito
en el numeral 1.3 precedente.
19
Los rganos blanco para el diagnstico de ISAv, corresponden a corazn, rin y

branquia.
Tratndose de alevines y alevines con saco, se deber enviar el pez completo (sin
saco vitelino). En el evento que stos se depositen en preservante, se deber
abrir la cavidad abdominal y cortar los oprculos.
En los casos en que los peces muestreados tengan una talla entre 4 a 6
centmetros se debern extraer todas las vsceras, rin y branquias.
Los restos de peces que queden de la toma de muestra, se deben adicionar al
tratamiento de mortalidad del centro o disponer como desecho biolgico en el
laboratorio.
4.4. Nmero de muestras a extraer y frecuencia de muestreos

Se deber extraer el nmero de muestras establecido en el PSEVC ISA,
considerando el tipo de centro, la cantidad de ejemplares en cultivo y los
diferentes estados, cuando corresponda.
En el caso de muestreo y anlisis como respaldo para traslados de Salmn del
Atlntico, ya sea por cosecha o eliminacin, se realizar el muestreo de 30 peces
del grupo, conforme lo dispuesto en el Programa de Vigilancia y Control de ISA.
En las pisciculturas de reproduccin de ciclo cerrado, es decir, aqullas que no
ingresan material biolgico y no tengan en antecedentes de positividad al virus ISA
en los dos ltimos aos, ya sea en los anlisis de vigilancia o chequeo individual
de reproductores, se considerar la extraccin de, al menos, 15 peces para fines
de vigilancia. Este muestreo se realizar con frecuencia semestral independiente
de la especie en cultivo.
Las muestras podrn conformar pooles para su anlisis, considerando un mximo
de 3 peces por pool, conformado por peces de la misma unidad epidemiolgica.
20
4.5. Contramuestras
Simultneamente a la extraccin de las muestras rganos o tejidos, se deber
extraer una contramuestra equivalente, la que deber ser almacenada en el
laboratorio, a una temperatura de al menos 20C, por un periodo no inferior a 15
das a menos que el Servicio disponga lo contrario.
anlisis. Se podr conservar como contramuestra homogeneizado de los rganos
de los peces que constituyen la muestra.
los anlisis no supere las 24 horas, las muestras debern se mantenidas en
supere las 24 horas, ya sea en el laboratorio, centro de cultivo o bien en un lugar
especialmente habilitado por el laboratorio para ello, se extraern los rganos, con
instrumental de diseccin, y se introducirn en recipientes con preservante de
RNA comercial o etanol PA en una proporcin 1:10. En los casos en que se utilice
etanol para anlisis como preservante de RNA, las muestras debern se
mantenidas en condiciones de refrigeracin (410 C
0,5 C o inferior) en
contenedores adecuados que cuenten con un sistema de registro de temperatura,
que permita garantizar la mantencin de la cadena de fro hasta la llegada al
laboratorio
21
Las muestras deben ser enviadas de forma tal de asegurar su identificacin y

5.
MUESTREO PARA EL PSEVC PISCIRICKETTSIOSIS
5.1. Personal
El muestreo para el PSEVC PISCIRICKETTSIOSIS podr ser realizado por
mdicos veterinarios de las empresas de cultivo o por certificadores de la condicin
sanitaria, segn se establece en la resolucin correspondiente.
Previo a la seleccin de los ejemplares de la muestra, se deber recopilar
antecedentes productivos y sanitarios necesarios para la planificacin del
muestreo y la eleccin de las jaulas o unidades epidemiolgicas a muestrear.
Se deben tomar en cuenta, entre otros, el tipo de centro (engorda,
esmoltificacin), las especies cultivadas en l, los porcentajes de mortalidad por
unidad epidemiolgica o jaula de cultivo en las ltimas semanas.
Se privilegiar la extraccin de peces orillados, moribundos, desorientados o
mortalidad fresca del da (de menos de 12 horas) que no haya sido tratada con
desinfectante o inactivador. Si el nmero final de ejemplares no se completa con
peces en tales condiciones, se deber completar la muestra con peces elegidos al
azar.
Los peces extrados deben ser dispuestos en bolsas plsticas debidamente
cerradas y rotuladas, con la respectiva identificacin de jaula o unidad
22
epidemiolgica en forma clara y permanente, asegurando la trazabilidad de las

muestras hasta el momento de la extraccin de rganos.
El procedimiento de extraccin de rganos se realizar de acuerdo a lo descrito
en el numeral 1.3 precedente.
Los rganos blanco para el diagnstico de Piscirickettsiosis corresponden a
cerebro, hgado y msculo, este ltimo en caso que existan lesiones a ese nivel.
Se debe extraer por pez un trozo de los rganos blanco de 0,5 cm x 0,5 cm
aproximadamente y depositarlos en un tubo estril que contenga el preservante
de material gentico o medio de transporte, segn corresponda.
Los restos de peces que queden de la toma de muestra, se deben adicionar al
tratamiento de mortalidad del centro o disponer como desecho biolgico en el
laboratorio.
5.4. Nmero de muestras a extraer y frecuencia de muestreos

Se deber extraer el nmero de muestras establecido en el PSEVC
PISCIRICKETTSIOSIS, considerando el tipo de centro, la cantidad de ejemplares
en cultivo y los diferentes estadios, cuando corresponda.
Las muestras podrn conformar pooles para su anlisis, considerando un mximo
de 3 peces por pool, incluyendo peces de la misma unidad de cultivo.
4.5. Contramuestras
Simultneamente a la extraccin de las muestras rganos o tejidos, se deber
extraer una contramuestra equivalente, la que deber ser almacenada en el
23
laboratorio, a una temperatura de al menos 20C, por un periodo no inferior a 15

das a menos que el Servicio disponga lo contrario.
anlisis. Se podr conservar como contramuestra homogeneizado de los rganos
de los peces que constituyen la muestra.
los anlisis no supere las 24 horas, las muestras debern se mantenidas en
supere las 24 horas, ya sea en el laboratorio, centro de cultivo o bien en un lugar
especialmente habilitado por el laboratorio para ello, se extraern los rganos, con
instrumental de diseccin, y se introducirn en recipientes con preservante de
material gentico comercial o etanol PA en una proporcin 1:10, en el caso de los
anlisis moleculares. Si se utiliza etanol para anlisis como preservante de
material gentico, las muestras debern se mantenidas en condiciones de
refrigeracin (410C 0,5C o inferior) en contenedores adecuados que cuenten
con un sistema de registro de temperatura, que permita garantizar la mantencin
de la cadena de fro hasta la llegada al laboratorio
Para el caso que se realice anlisis de inmunofluorescencia indirecta, IFAT, los
frotis podrn ser realizados en terreno, a partir de los rganos blanco. Las
muestras deben ser enviadas de forma tal de asegurar su identificacin y
24

25
VIII.
BIBLIOGRAFA
1.
Manual de Pruebas de Diagnstico para los Animales Acuticos de la

OIE, Edicin 2011.
26

Procedimientos de muestreo para diagnóstico de enfermedades en animales acuáticos

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Procedimientos de muestreo para diagnóstico de enfermedades en animales acuáticos

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LABD/NT1/diciembre 2012

PROGRAMA SANITARIO GENERAL

Procedimientos para el muestreo de animales acuticos.

UNIDAD DE SALUD ANIMAL

Certificador de la condicin sanitaria: mdico veterinario incorporado en el

Reglamento o RESA: Reglamento de Medidas de Proteccin, Control y

Unidad Epidemiolgica, unidad o UE: designa un grupo de ejemplares en una

Servicio o Sernapesca: Servicio Nacional de Pesca.

Para efectuar un muestreo, el personal deber contar con indumentaria adecuada,

Materiales para diseccin:

Pinzas anatmicas y quirrgicas estriles.

Materiales para el transporte y mantencin de muestras:

Tubos con preservante de RNA/DNA.

Hielo o Gelpack (previamente congelados y desinfectados).

Materiales para identificacin de las muestras:

Plumn de tinta indeleble lpiz grafito.

VII. PROCEDIMIENTOS DE MUESTREO

MUESTREO PARA EL PSEV

1.3. Extraccin de rganos

1.4. Nmero de muestras a extraer

Conservacin y traslado de las muestras al laboratorio

1.6.1. Muestras para cultivo celular

1.6.2. Muestra para anlisis RT-PCR

condiciones de refrigeracin (4-10C

MUESTREO PARA EL PVM

2.3. Nmero de muestras a extraer

exista un resultado sospechoso o positivo la contramuestra deber mantenerse

Conservacin y traslado de las muestras al laboratorio

realizarse en conformidad con lo establecido en el punto 2.4.0 del Manual de

MUESTREO PARA EL PSGR

Muestreo sin sacrificio

3.2.2.1. Biopsia de branquias

3.3. Muestras a extraer

Se extraern trozos de rganos de 5 mm3; en el caso del rin para anlisis de

MUESTREO PARA EL PSEVC ISA

Los rganos blanco para el diagnstico de ISAv, corresponden a corazn, rin y

4.4. Nmero de muestras a extraer y frecuencia de muestreos

Las muestras deben ser enviadas de forma tal de asegurar su identificacin y

MUESTREO PARA EL PSEVC PISCIRICKETTSIOSIS

epidemiolgica en forma clara y permanente, asegurando la trazabilidad de las

5.4. Nmero de muestras a extraer y frecuencia de muestreos

laboratorio, a una temperatura de al menos 20C, por un periodo no inferior a 15

de polietileno expandido). Los contenedores debern ser debidamente sellados

Manual de Pruebas de Diagnstico para los Animales Acuticos de la

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