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Prcticas de Qumica

CROMATOGRAFA EN COLUMNA. SEPARACIN DE COLORANTES


1. Objetivos
Manejo de tcnicas de separacin. Introduccin a las sofisticadas tcnicas de cromatografa lquida de alta
resolucin (HPLC) y cromatografa de gases (GC).
Objetivo operativo: Separacin de los componentes de una mezcla de colorantes.

2. Fundamento terico
La cromatografa en columna es la tcnica de separacin e
identificacin de sustancias qumicas, por la diferente retencin que experimentan los componentes de una mezcla, al
ser ms o menos adsorbidos por los componentes de una
fase fija situada en una columna, cuando son arrastrados por
un fluido (fase mvil). Si la fase mvil es lquida hablamos de
cromatografa lquida y si es gas ser cromatografa de gases.
El adsorbente, suele ser gel de slice o almina, pero pueden
ser otros.
Intervienen los fenmenos de adsorcin y disolucin, por consiguiente es fundamental tener en cuenta la polaridad, tanto
de las sustancias a arrastrar como del disolvente, si queremos
tener una buena separacin.
El disolvente al descender arrastra las sustancias a distinta
velocidad segn la mayor o menor retencin que experimenten, y salen de la columna a distinto tiempo.
La tcnica, en forma generalizada, comprende:
* Preparacin del disolvente.
* Preparacin de la columna.
* Desarrollo del cromatograma.
* Estudio del tiempo de retencin.
* Revelado de las sustancias separadas, si no son visibles.
El tiempo de retencin es una parmetro til porque es constante cuando se reproduce el experimento en
todas las condiciones, se pone en tablas y sirve para identificar compuestos; es fundamental en Cromatografa Lquida de Alta Resolucin (HPLC) y en Cromatografa de Gases.

3. Material y reactivos
- Bureta como columna
- Embudo
- Erlenmeyer (3)
- Soporte y pinzas
- Gel de slice 60, 63-200 micras RE cd. 174275
- Azul de Metileno Alcalino DC cd. 251171.1209
- Fucsina Bsica Fenicada solucin segn Ziehl DC cd. 251333
- Fluorescena: preparar una solucin acuosa al 1% de Fluorescena Sdica (C.I. 45350) PA cd. 122389
- 1-Propanol (Reag. USP, Ph. Eur.) PA-ACS cd. 131885
- Acetona DIDACTIC cd. 231007
- Etilo Acetato (Reag. Ph. Eur.) PA-ACS-ISO cd. 131318
- Etanol absoluto DIDACTIC cd. 231086
- Agua Desionizada DIDACTIC cd. 232236

Prcticas de Qumica
4. Procedimiento experimental
Preparacin de la columna:
Se toma una bureta o una pipeta como columna, se sujeta en el soporte con las pinzas.
Se engrasa la llave y se mantiene en posicin de cerrado. Se introduce hasta el fondo un pequeo trozo de
algodn ayudndose con la varilla de vidrio, se agregan 3 ml de Etilo Acetato (Reag. Ph. Eur.) PA-ACS-ISO
y se presiona suavemente el algodn para que quede bien colocado y sin burbujas, se prepara una suspensin de 15 g de Gel de Slice 60, 63-200 micras RE en 50 60 ml de Etanol absoluto DIDACTIC y se agita
durante 5 minutos para eliminar las burbujas.
A travs del embudo se vierte la suspensin en la columna golpeando ligeramente con los dedos para que
el empacado sea uniforme.
Se abre la llave para eliminar el exceso de disolvente teniendo cuidado de no dejar secar la Gel de Slice.
Se podra haber empaquetado en seco, pero teniendo cuidado de que no queden espacios vacos, y luego
pasarle disolvente, por ej. Etanol.
Preparacin del eluyente (disolvente de arrastre)
El eluyente empleado es agua/1-propanol/acetona (1:1:1), se preparan unos 100 ml y se lava la columna
con el disolvente.
Preparacin de la mezcla a separar
Es una mezcla de fluorescena, fucsina bsica y azul de metileno. Se toman 0,5 ml de cada uno de ellos y
se mezclan en un tubo de ensayo.
Desarrollo o elucin
Cuando el eluyente haya descendido 0,5 cm de la parte superior del relleno, se aaden dos gotas de la
mezcla a eluir. Se pone una pequea bolita de algodn en la parte superior de la columna y a continuacin
se aade eluyente, manteniendo el nivel varios cm por encima del relleno. Al desarrollarse la cromatografa,
se separan las fracciones, que se recogen en distintos matraces, contando el tiempo que tarda cada componente en salir (tiempo de retencin).
Si algn componente no sale puede arrastrarse, aadiendo al eluyente cido actico diluido.
Hacer dibujos donde figuren claramente coloreadas las separaciones de colorantes, con esquemas de las
distancias recorridas cada intervalo de tiempo (20-25 minutos) y los tiempos de retencin para una cierta
longitud de columna (10 cm).

5. Cuestiones
a) La cromatografa en columna, sus caractersticas y aplicaciones. Cromatografia de adsorcin. Cromatografa de particin.
b) Eluyentes y soportes para cromatografa en columna.
c) Factores que influyen en una separacin por cromatografa en columna.

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