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Anticuerpos monoclonales producidos por hibridomas

Cuando se realiza una inmunización con el objeto de producir anticuerpos frente a un antígeno, se produce una gran variabilidad de inmunoglobulinas que poseen función de anticuerpo frente a los diferentes epítopos del antígeno. Esta producción de inmunoglobulinas es de tipo policlonal debido a que son muchos y muy diversos clonos linfocitarios los que se activan y diferencian para la producción de anticuerpos (Figura 10). Este fenómeno es de gran utilidad biológica por cuanto ofrecen una amplia barrera de protección del organismo al formarse una gran variabilidad de anticuerpos. Sin embargo, los antisueros así obtenidos, aunque se han utilizado ampliamente y han sido de gran interés en el conocimiento de la biología y la bioquímica de las inmunoglobulinas (inmunoprecipitaciones e inmunoblotting), ofrecen serias dificultades para su uso, por ejemplo, en la identificación de sustancias u otros fines análogos, debido a la gran heterogeneidad estructural y funcional que poseen. Este problema se ha obviado desde que Georges Kholer y Cesar Milstein en 1975 (Figura 11) consiguieron la producción de anticuerpos

monoespecíficos, conocidos monoclonales (AcMo).

como

anticuerpos

Con ello se abrió un amplio campo en la Inmunología y la Biología Molecular en general puesto que estos anticuerpos son de una gran utilidad por cuanto tienen la capacidad de reaccionar frente a un solo epítopo del antígeno y son entre si homogéneos.

Fundamentos de la producción de anticuerpos monoclonales El método seguido para la producción de estos anticuerpos consiste en la unión (fusión) de una célula B productora de anticuerpos, con una célula de gran capacidad de crecimiento (células de mieloma) con lo cual se forma un híbrido ( hibridoma) que posee la información genética necesaria para la síntesis del anticuerpo deseado, que le es aportada por la célula B, y una activa capacidad de síntesis proteica al tiempo que puede multiplicarse tanto in vivo como in vitro indefinidamente, propiedades estas últimas que son aportadas por la célula mielomatosa (Figura 12). De esta manera, se pueden producir

innumerables tipos de hibridomas de acuerdo con el tipo de anticuerpo que interesa. Al ser cada uno de los anticuerpos así producidos homogéneos, ofrecen patrones de reacción de gran especificidad con los antígenos utilizados en la inmunización. Kholer y Milstein para la puesta a punto de esta técnica escogieron eritrocitos de oveja como inmunógenos, ya que el anticuerpo contra tales células se detectaba fácilmente mediante la técnica de placas hemolíticas de

Jerne. Esta técnica se basa en la detección de la formación de anticuerpos frente a glóbulos rojos de carnero, comprobando la capacidad lítica de los glóbulos frente al complemento.

segregaban inmunoglobulinas de ambos progenitores. Algunas segregaban anticuerpos contra los eritrocitos. Habían logrado por tanto, aislar clones que segregaban una sola especie molecular de anticuerpo y que, además, podían mantenerse en cultivo. Por primera vez se habían desarrollado cultivos continuos de células híbridas que segregaban un anticuerpo monoclonal de especificidad predefinida. Una vez seleccionado el hibridoma adecuado, éste puede conservarse largo tiempo congelado. En cualquier momento el clon puede hacerse crecer para la producción de anticuerpos por inyección a ratones o siembra en cultivo. Generalmente el clon se inyecta intraperitonealmente generándose ascitis extraordinariamente ricas en anticuerpos, de donde son fácilmente purificables. Cuando el clon se ha cultivado in vitro el anticuerpo se recolecta a partir del sobrenadante del cultivo.

Así, mezclando células de mieloma de ratón con células de bazo procedentes de ratones inmunizados con glóbulos rojos de carnero en presencia de un agente promotor de la fusión celular, identificaron con éxito las células híbridas en un medio selectivo y observaron que Tecnología de la obtención de AcMo Generalmente se comienza por inmunizar a ratones de la cepa BALB/C con el antígeno frente al cual se desea obtener el anticuerpo. El protocolo de inmunización suele ajustarse a tres dosis del material antigénico que se administran intraperitonealmente, con intervalos de unas dos semanas. Aproximadamente a los veinte días de la primera dosis, se comprueba la presencia de anticuerpos dirigidos frente al antígeno en el suero del ratón. Comprobada la presencia de anticuerpos se procede al aislamiento de las células B productoras de los mismos del bazo de los animales, en condiciones de esterilidad. Las células así obtenidas serán utilizadas para su fusión con células mielomatosas, generalmente del tipo NSI. La línea mielomatosa NSI procede de un mieloma inducido en la cepa BALB/C que ha perdido la capacidad de secretar inmunoglobulinas, por lo que no interferirá en la producción de anticuerpos con los hibridomas que se obtengan. Mientras los linfocitos B,

sensibilizados frente al antígeno correspondiente aportan al híbrido los genes que codifican las cadenas ligeras y pesadas de las inmunoglobulinas, la línea mielomatosa dota al híbrido de la capacidad de crecimiento ilimitado propia de las células tumorales y, por tanto, de la posibilidad de desarrollarse tanto in vitro como in vivo. Esta línea mielomatosa se ha hecho resistente a la 8- azaguanina porque carece de la enzima HGPRT (hipoxantin-guanidin-fosforibosiltransferasa). La síntesis de su DNA la tiene que realizar a través de la vía de novo que obtiene nucleótidos a partir de aminoácidos y azúcares. La aminopterina bloquea la síntesis de novo de nucleótidos, por lo que las células de la línea NSI no sobrevivirán en presencia de este fármaco. Esta característica permitirá eliminar las células NSI que no se han podido fusionar en el medio rico en aminopterina. Las células NSI no fusionadas morirán, mientras que los híbridos

podrán seguir creciendo porque poseen la enzima HGPRT, aportada por los esplenocitos. La fusión celular entre los esplenocitos del ratón inmunizado y la línea mielomatosa NSI se realiza en el medio de cultivo adecuado que contiene, además de los nutrientes necesarios para un cultivo celular, polietilén glicol (PEG) que es un detergente capaz de disolver parte de la membrana celular permitiendo así la formación de células que contienen dos núcleos (fusión celular). Posteriormente se procede a la selección de los híbridos que se inicia a partir de las 24 horas después de la fusión. Para ello se añade medio de cultivo con HAT (mezcla de hipoxantina aminopterina y timidina), a cada uno de los pocillos de las placas en donde se encontraban las células en cultivo. Hacia la tercera semana, se retira la aminopterina de los Utilidad de los anticuerpos monoclonales Un anticuerpo monoclonal es un reactivo biológico homogéneo en su actividad, en contraste con los antisueros convencionales que son una mezcla variable de inmunoglobulinas. El uso más generalizado de los AcMo se centra:

cultivos añadiéndose medio HT (hipoxantinatimidina) y, por último, durante la cuarta semana las células se mantienen sólo en medio de cultivo. Terminado este proceso se estudian los sobrenadantes de los híbridos para determinar si producen anticuerpos. Los hibridomas productores de anticuerpos se expanden y si siguen siendo positivos se clonan cuando se estabilizan en cultivo. La clonación tiene como objetivo aislar el hibridoma productor del anticuerpo deseado y que todas las células que lo constituyen procedan de la misma célula progenitora, dado que los hibridomas productores de anticuerpos se encuentran mezclados en cultivo con otros hibridomas que, o bien no son productores o sintetizan anticuerpos que no interesan.

subpoblaciones celulares, sino también su fraccionamiento y aislamiento. En este sentido cabe destacar el empleo de equipos conocidos como clasificadores de células activados por fluorescencia" (FACS, Fluorescence Activated Cell Sorter)

• En trasplantes de órganos y enfermedades
autoinmunes en donde los AcMo dirigidos contra los linfocitos T se utilizan frecuentemente en casos de amenaza de rechazo agudo.

• En oncología para la localización de células
tumorales y/o su destrucción. Para ello los anticuerpos específicos frente a antígenos tumorales tales como el antígeno carcinoembrionario pueden ser marcados con sustancias radioactivas, como por ejemplo In111 o Tc99, y así localizar su situación en el organismo mediante una gammacamara especial cuando son administrados a individuos afectos de tumores. También los AcMo pueden ser utilizados en la destrucción de células tumorales en oncología, para lo cual los anticuerpos son marcados con drogas citostáticas y citotóxicas.

• En la caracterización y cuantificación de
sustancias de interés biológico que se encuentran en cantidades muy pequeñas, tales como hormonas, enzimas, interferones, etc (Tabla 1).

• En la identificación de antígenos presentes en
las membranas celulares, tales como las moléculas CD3, CD4, CD8 y otras muchas. Esto ha permitido no solamente la cuantificación de

En esta panorámica general de la utilización de los anticuerpos monoclonales, asistimos hoy a una impresionante dispersión hacia otros muchos campos, lo cual permite vislumbrar esperanzadores horizontes a partir de una técnica que en principio surgió simplemente de la pretensión de desvelar la organización y expresión genética de las inmunoglobulinas, lo que acabo constituyendo un verdadero hito en la historia de la medicina y las ciencias biológicas.

conlleva y en tanto que pueden producirse industrialmente. Se expone un esquema del procedimiento seguido para la producción de AcMo para su posterior utilización tanto en el laboratorio como en la clínica como medio terapéutico y diagnostico (Figura 13). Sin embargo, sería deseable que, para su aplicación terapéutica, los anticuerpos procedieran de linfocitos humanos y no de ratón o rata. Contrariamente a lo que se esperaba en un comienzo, la utilización de linfocitos humanos ha resultado difícil, en tanto que los intentos de inmortalizar hibridomas humanos mediante su fusión con células mielómicas de ratón o rata, han sido, hasta la fecha, decepcionantes. El problema reside en que, cuando se fusionan células humanas con células animales, hay una rápida pérdida preferencial de los cromosomas humanos en las células híbridas interespecies resultantes. En la actualidad se comienza a producir AcMo humanos empleando linfocitos B a los que se transforma en tumorales mediante su infección con el virus de Epstein Barr, obteniéndose así linfocitos B productores de AcMo que pueden ser clonados y, por consiguiente, anticuerpos monoclonales homogéneos en su composición y especificidad.

Así pues, paulatinamente, los anticuerpos monoclonales van sustituyendo a los antisueros convencionales en base a las ventajas que su uso AcMo quiméricos humanizados Como se ha comentado con anterioridad, uno de los problemas del uso de AcMo en medicina es que al ser en su mayoría de origen murino, cuando son administrados a individuos, éstos producen anticuerpos frente a los mismos que disminuyen su eficacia o bien pueden presentar problemas de tipo alérgico cuando se usan reiteradamente. Para evitar este problema se están ya obteniendo mediante técnicas de ingeniería genética

anticuerpos humanizados de tipo quimérico. Estos anticuerpos se preparan mediante la creación de una molécula híbrida en la que se mantienen las partes del anticuerpo monoclonal de ratón que le confieren la especificidad (regiones V, D y J), y sustituir la región constante del anticuerpo de ratón por una región igualmente constante del mismo isotipo pero de procedencia humana.

anticuerpo humanizado, y que este posea una adecuada glicosilación. De acuerdo con esto, es posible eliminar de un anticuerpo de ratón (al menos parcialmente) sus regiones más inmunógenas, de manera que no sea reconocido como extraño por la persona que es inyectada el organismo humano (Figura 14). Un paso más adelante en la humanización de los anticuerpos monoclonales producidos en ratón ha sido ya dado mediante la realización de los llamados anticuerpos hiperquiméricos. En este caso se rediseña la parte variable del Para ello, es necesario disponer previamente del cDNA que codifica la inmunoglobulina de ratón de nuestro interés. Las regiones del DNA de ratón que contienen la especificidad del anticuerpo han de ser unidos a otro cDNA de humano que codifica para la región constante de una inmunoglobulina del mismo isotipo. Una vez que se han ligado las diferentes regiones de DNA de ratón y humano, esta construcción ha de ser subclonada en un vector apropiado y transfectada a una célula B a fin de que ésta produzca el anticuerpo, de manera que los aminoácidos correspondientes a la secuencia del anticuerpo de ratón que codifican las partes hipervariables para el sitio de unión se introducen en el constructor que codificará la parte variable dentro del marco de la región variable de un anticuerpo humano. Es decir, el anticuerpo humano va a servir únicamente como vehículo o vector de las regiones de determinantes complementarios (CDR) murinas, que son en realidad las responsables de la unión específica del anticuerpo con el antígeno.