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MATERIA: BIOTECNOLOGA
REPORTE DE PRACTICA N 3
CARACTERIZACION DE CEPA MICROBIANA
GRADO Y GRUPO: 6D
FECHA DE INICIO DE LA PRCTICA: 14 /03/13
FECHA DE TRMINO DE LA PRCTICA: 14 /03/13
CINTALAPA DE FIGUEROA, CHIAPAS A 21 DE MARZO DE 2012
REPORTE DE PRACTICA N 3
CARACTERIZACION DE CEPA MICROBIANA
OBJETIVOS
INTRODUCCIN
La caracterizacin de cepas microbianas es un proceso por el cual debemos determinar a qu especie
pertenece una determinada cepa bacteriana, mediante la comparacin de una serie de caractersticas
que pueden ser puestas en evidencia en el laboratorio y que han sido estudiadas para la gran mayora
de las especies importantes desde el punto de vista de la patologa infecciosa humana. Cuanto ms
semejanza haya entre las caractersticas obtenidas en el laboratorio y las que habitualmente presenta
una determinada especie, mayor ser la probabilidad de que esa cepa problema pertenezca a dicha
especie .Las caractersticas utilizadas en la identificacin de cada grupo de microorganismos
dependen de las posibilidades de cada laboratorio, fundamentalmente econmicas y de cualificacin
del personal, as como de la epidemiologa especfica de la zona.
MARCO TERICO
Se entiende por identificacin microbiana al conjunto de tcnicas y procedimientos que se aplican para
establecer la identidad de un microorganismo. Estas tcnicas se utilizan en diferentes reas, por
ejemplo:
En el rea clnica donde es de capital importancia conocer cul es el agente causal de la infeccin
que presenta un paciente, de manera de poder tratarlo con agentes teraputicos.
En la industria farmacutica, cosmtica y de alimentos donde las normas de control de calidad
exigen la ausencia de ciertos microorganismos.
En investigacin bsica donde se asla un determinado microorganismo que debe identificarse para
comprobar si se trata de un microorganismo conocido o de uno nuevo para poder clasificarlo.
(Prescott, 1999).
Mtodos basados en criterios morfolgicos
Los rasgos morfolgicos (estructurales) han ayudado a los taxonomistas por muchos aos a clasificar
organismos. Los organismos superiores tienen rasgos anatmicos tan diferentes que pueden ser
fcilmente utilizados en su clasificacin, pero con respecto a los microorganismos, stos lucen bajo el
microscopio tan similares que se dificulta su clasificacin. Es decir, que estos microorganismos que se
ven tan parecidos bajo un microscopio, pueden diferir en propiedades bioqumicas, fisiolgicas y/o
serolgicas. Sin embargo, aun cuando la morfologa celular dice poco sobre las relaciones
filogenticas, sigue siendo til para la identificacin bacteriana. Por ejemplo: la presencia de
endosporas y su localizacin resulta de mucha utilidad en la identificacin de bacilos esporulados.
que posteriormente el mdico, con base al reporte, indique el tratamiento adecuado, o para que los
epidemilogos puedan localizar la fuente de la infeccin. Existen flujo gramas, como el que se
describe a continuacin para la identificacin bacteriana, mediante pruebas bioqumicas de
microorganismos.
El tiempo necesario para la identificacin de bacterias puede reducirse considerablemente con el uso
de sistemas miniaturizados basados en pruebas bioqumicas. Estas herramientas que permiten
reducir el tiempo del reporte, en primer lugar fueron elaborados para bacterias de importancia mdica,
tales como las enterobacterias. Estos sistemas han sido diseados para realizar varias pruebas
bioqumicas simultneamente y permitir la identificacin en un tiempo ms corto. Cada uno de los
ensayos, consta de tubos miniaturizados que contienen el medio de cultivo que se hidratan al
inocularlos con la suspensin bacteriana pura. Las pruebas se clasifican en grupos; a cada uno de
resultados positivos de los ensayos de se le asigna un determinado valor numrico, obtenindose un
cdigo que corresponder a un determinado gnero o especie en un texto de la base de datos.
Con fines de control microbiolgico, la USP indica cuales son las pruebas bioqumicas mnimas que
se requieren para la identificacin de los microorganismos objetables, pero no descarta que se
utilicen sistemas miniaturizados donde se realizan un nmero mayor de pruebas bioqumicas.
Existen muchas casas comerciales que producen sistemas miniaturizados para diferentes tipos de
microorganismos adems de las enterobacterias. Cada casa fabricante tiene su propia presentacin,
clculos, manuales, etc. Una limitacin de este tipo de mtodo de identificacin es la aparicin de
cepas mutantes y la adquisicin de plasmidos que pueden dar origen a cepas con caractersticas
diferentes. Este tipo de mtodo de identificacin tambin ha sido desarrollado para la identificacin de
levaduras y de otros hongos.(Mahn, 2000).
pruebas
de la infeccin es
batera
de
lipopolisacarido de
a la Salmonella
etc.).
calienta para que las cadena s complementarias se separen. Posteriormente se aade la sonda, y se
deja transcurrir un periodo para que tenga lugar la hibridacin si existe la cadena complementaria. La
unin de la sonda a la secuencia complementaria se detecta mediante la seal radiactiva que emite la
sonda o mediante mtodos enzimticos.
MATERIALES
4 Porta objetos.
4 Cubreobjetos.
1 Asa de platino.
1 Mechero de bunsen.
1 Gotero.
1 Cristalizador.
1 Puente para tincin.
EQUIPOS
Balanza analtica.
Microscopio.
Cmara digital para
microscopio.
REACTIVOS
Alcoholacetona.
Safranina.
Aceite de
inmersin.
Violeta de
cristal.
Lugol.
MUESTRAS
Muestra de estudio
aislada de estircol
de ganado vacuno.
METODOLOGA
Extraclase considerando un equipo de trabajo
Preparacin de soluciones.
Solucin de Lugol.
En un matraz de 50 ml, disolver 0.333 de yoduro de potasio en 20 ml de agua destilada y enseguida
agregar lentamente 0.166 gr. De yodo, mezclar completamente y aforar con agua destilada.
Solucin decolorante alcohol-acetona.
Colocar en una probeta de 50 ml, 30 ml de alcohol etlico y 20 ml de acetona, mezclar perfectamente.
Solucin safranina.
En un matraz aforado de 50 ml colocar 5 ml de alcohol etlico y disolver 0.125 gr. de safranina. Aforar
con agua destilada.
Solucin crista violeta.
Este colorante se prepara en dos partes.
a. Solucin a: en un vaso de precipitado de 50 ml. colocar 10 ml. de alcohol etlico y disolver 1gr
de cristal violeta.
Solucin b: en otro vaso se disuelven 0.4 gr de oxalato de amonio en 40 ml. de agua destilada.
b. Mezclar cuidadosamente las soluciones a y b.
c. Guardar la mezcla en un frasco mbar en obscuridad durante 24 horas.
Nota: Todo este procedimiento requiere de la total asepsia posible para contrarrestar todo tipo de
contaminacin en los colorantes y as poder tener un buen resultado.
Sesin de laboratorio
a) Preparaciones frescas.
1. A partir de cultivos en medios solidos: colocar una gota de agua sobre el portaobjetos con
ayuda del asa. Cargar el asa (estril) con una pequea cantidad de bacterias de una colonia y
re suspenderlas en la gota de agua.
2. Observar bacterias vivas al microscopio con el objetivo de inmersin (con una gota de aceite de
inmersin), observar motilidad, etc.
b) Tincin de Gram.
Preparaciones de extensiones de cultivos bacterianos para tinciones.
A partir de cultivo en medio liquido o en medio slido, se procede como en el caso de la
preparacin en fresco:
Extender las suspensiones con el asa hasta conseguir una capa fina.
Secar la preparacin acercndola a la llama del mechero, evitando que se caliente
demasiado, para no afectar a la estructura y forma normal de los microorganismos
(comprobar con el dorso de la mano que no est muy caliente).
Una vez seca la preparacin se procede a la fijacin de la muestra. Haciendo pasar la
preparacin 3-4 veces por la llama del mechero (la llama debe de tocar la parte inferior del
porta objetos).
Una vez seca y fijada la preparacin, se procede a su tincin Gram y posterior observacin.
Procedimiento de tincin de Gram.
RESULTADOS
Los resultados que se obtuvieron una vez realizado las observaciones de los frotis en fresco y con la
tincin de Gram se reportan en las siguientes tablas, adjuntando algunas imgenes. En ellas se
encuentran tambin las caractersticas microscpicas observadas en los diferentes objetivos del
microscopio.
Tincin en fresco
Tincin de Gram
Medio de Cultivo
Aumento total (objetivo)
Forma
Solido
4x
Puntos microscpicos
no muy apreciables
dispersos en todo el
frotis.
Tamao
Micrmetros
Solido
4x
Puntos microscpicos
no muy apreciables
dispersos en todo el
frotis
presentan
pequeas zonas de
coloracin violeta y
azul.
Micrmetros
Muestra obtenida de
aislamiento de cultivo de
estudio. (Estircol de
vacuno).
Tincin en fresco
Tincin de Gram
Solido
10x
Se tiene una mejor
apreciacin,
de
pequeos puntos en
grupos.
Solido
10x
Se tiene una mejor
apreciacin,
de
pequeos puntos en
grupos.
Pero
la
coloracin permite un
Muestra obtenida de
aislamiento de cultivo de
estudio (Estircol
de
vacuno).
Medio de Cultivo
Aumento total (objetivo)
Forma
Tamao
Micrmetros
mejor enfoque.
Micrmetros
Tincin en fresco
Tincin de Gram
Medio de Cultivo
Aumento total (objetivo)
Forma
Solido
40x
Tienen
formas
de
grnulos. Se logran ver
figuras ovoides que
forman
pequeas
cadenas.
Tamao
micrmetros
Solido
40x
Tienen
formas
de
grnulos. Se logran
ver figuras ovoides
que forman pequeas
cadenas similares a la
morfologa
de
un
estreptococo.
La
tincin
de
gran
produce
una
coloracin rosa y azul.
Micrmetros
Muestra obtenida de
aislamiento de cultivo de
estudio (Estircol de
vacuno).
Tincin en fresco
Tincin de Gram
Muestra obtenida de
aislamiento de cultivo de
estudio (Estircol de
vacuno).
Medio de Cultivo
Aumento total (objetivo)
Forma
Solido
60x
El aumento permite ver
ms de cerca la forma
de las cadenas de
cocos, algunas de estas
cadenas son ms cortas
y otras mas largas.
Tamao
Micrmetros
Solido
60x
La tincin permite ver la
coloracin rosa-violeta
de las cadenas de
cocos, algunas de estas
cadenas son ms cortas
y otras ms largas, pero
se
encuentran
mas
dispersas.
Micrmetros
Tincin en fresco
Tincin de Gram
Muestra obtenida de
aislamiento de cultivo
de estudio (Estircol de
vacuno).
Medio de Cultivo
Aumento total (objetivo)
Forma
Solido
Solido
100x
100x
El objetivo en conjunto El objetivo permite ver
con
el
aceite
de con claridad la forma de
inmersin permite ver los
estreptococos
con claridad la forma de coloreadas
azul,
cadenas de clulas pequeas coloraciones
redondeadas,
esta en
color
rosa
y
forma concuerda con la pequeas esferas en
forma
de
un color amarillo.
estreptococo.
Tamao
Micrmetros
Micrmetros
Una vez analizada las tablas se determina que se present una mejor observacin en los ltimos
objetivos. Es evidente que la vista en los diferentes objetivos nos proporciona el dato del tamao en el
que se encuentra los microorganismos que observamos.
DISCUSIONES
En prcticas anteriores de aislaron las cepas bacterianas de la muestra de estircol de ganado
vacuno, esto con la finalidad de encontrar microorganismos que son capaces de hidrolizar las
molculas de almidn, esto debido a la produccin de una enzima llamada amilasa. En esta prctica
se encarga de identificar qu tipo de microorganismo es el que se encuentra presente en dichas
muestras de estircol. La caracterizacin se llev acabo por medio de mtodos de identificacin
basados en el criterio morfolgico y en tincin diferencial (tincin de Gram) ambos por medio de la
observacin al microscopio.
Como resultado de obtuvieron que la muestra de estudio vista en los diferentes objetivos del
microscopio (4x, 10x, 40x, 60x y 100x), resulto que en las primeras observaciones con los objetivos
4x, 10x, 40x de la tabla 1.1, 1.2 y 1.3 no haba una observacin clara, a comparacin de los objetivos
60x y 100x. De la tabla 1. 4 y 1.5. Las formas que se presenciaron en la observacin microscpica por
medio de los frotis en fresco y con la tincin de Gram, fueron de grnulos o agrupaciones de cadenas
formadas por clulas redondeadas, que comparndolo en la morfologa bacteriana del cuadro 1(ver
anexos), se pueden deducir, la apariencia de microorganismos del gnero estreptococos, este tipo de
microorganismos tiene tamao de 0.4 a 14 m. Adems de que en la coloracin azul presente en los
frotis con tincin de Gram, corresponde a este tipo de microorganismos Gram positivos segn a la
bibliografa que cita Madigan M.T. et al. (2004).
Estos resultados concuerdan con el resultado del informe de Rodrguez et al. (2008). Uno de los
microorganismo que pueden degradar el almidn y que se encuentran en el estmago de los
rumiantes pertenece al gnero estreptococos, llamado Streptococus bovis, este es una bacteria
amiolitica, que al igual que las bacterias hemiceluloliticas y celuloliticas son responsables de hidrolizar
o degradar las macromolculas que componen los sustratos presentes en los alimentos, como
celulosa, hemicelulosa, almidn, grasas y aceites, y pectina. El producto final de la fermentacin de
los carbohidratos lo son mayormente cidos grasos voltiles (AGVS, i.e. actico, propinico y butrico)
los cuales representan la principal fuente de energa para el rumiante. Despus de su produccin en el
rumen los AGVS son absorbidos a travs de la pared ruminal y transportados al hgado, rgano
donde se metabolizan o son distribuidos a los diferentes tejidos del cuerpo (ej. tejido adiposo, tejido
muscular, glndula mamaria).
La presencia de microorganismos en el complejo retculo-rumen le permite al pequeo rumiante
utilizar nutrientes presentes en los alimentos que no pueden ser degradados por enzimas producidas
por mamferos.
CONCLUSIONES
VCTOR MANUEL ROQUE VELZQUEZ
Los herbvoros convierten los productos vegetales en alimentos. La eficiencia de conversin depende,
en parte, de la eficiencia de digestin de las fibras vegetales en el rumen. La digestin de la pared
celular vegetal en los rumiantes depende, a su vez, de la colonizacin y digestin de la misma dentro
del complejo ecosistema microbiano del rumen.
La diversidad de microorganismos del rumen es importante porque la presencia de especies distintas
aporta un conjunto de enzimas, as como reacciones bioqumicas precisas para una conversin
mxima del alimento consumido, los microorganismos ms comunes de tipo amilolticas que se
encuentran en el rumen de los bovinos son: streptococus bovis, Succinomonas amilolytica y
Bacteroides amylophylus, las cuales degradan grandes cadenas de almidn.
En la prctica se aislaron cepas que se encontraban en las heces de bovinos, teniendo en cuenta los
parmetros morfolgicos, el crecimiento en los medios modificados con almidn y con base a la
prueba de lugol (solo se seleccionaron aquellas que no presentaron modificaciones oscuras al
aplicarse a los cultivo en placas), tambin se tomaron en cuenta la marcada similitud fisiolgica y
bioqumica existente entre algunos de las cepas aisladas, entre ellas. Se seleccionaron las cepas para
su respectiva identificacin, dentro de las cepas obtenidas figuran microorganismos de tipo bacilos y
cocos, tanto Gram Positivos como Gram negativos, con una predominancia en streptococus bovis
Gram positivas.
JOS MANUEL SANTOS SANTIAGO.
La caracterizacin de cepa microbiana sigue siendo el principal mtodo de identificacin de la mayora
de las cepas aisladas. Recordemos que en la prctica anterior se logr aislar una cepa para que
positivas y negativas ya que a la hora de realizar la tincin hubo coloracin morada que corresponde
que hay presencia de bacterias Gram positivas y de color rosa las Gram negativa esta caracterstica
est ntimamente ligada a la estructura de la envoltura celular, por lo que refleja un tipo natural de
organizacin bacteriana. Al comparar las caractersticas de las bacterias podemos decir que hubo
presencia de Streptococcus bovis ya que es un grupo de bacterias formado por cocos Gram
positivos pertenecientes al filo firmicutes y al grupo de las bacterias cido lcticas. Estas bacterias
crecen en cadenas o pares, donde cada divisin celular ocurre a lo largo de un eje. Y bacilos en
forma de bastn.
BIBLIOGRAFA
Artculos
Snchez H. C., Meja C.E., Figueroa M.C., Esquivia M. M., Agudelo L. M., Zapata G. N. 2005.
Estudio de cepas nativas Amiloliticas. Vitae, Revista de la facultad qumica farmacutica, pgs.
21- 28.
Rodrguez, Abner, Valencia, Elide y col. (2008), Ruminantia Microbiologa Ruminal. Rep. De
Puerto rico: Departamento de Agricultura. vol.3.
Libros
Madigan M.T, Martingo J. M. y Jack Parker. 2004. Dcima Edicin. Brock Biologa de los
Microorganismos Prentice Hall
Mahon, C. and Manuselis G. 2000. Textbook of Diagnostic Microbiology. Second Edition. W.B.
Saunders Company. USA
Prescott, L.; Harley, J.; Klein, D. 1999. Microbiologa. Cuarta edicin. McGraw-Hill
Interamericana.
W.C. Frazier, D.C. Westhoff. (1993) Microbiologa de los alimentos, Cuarta edicin, Editorial Acribia.
Tortora G. J., B. R. Funke and Ch. L. Case 2007. Introduccin a la Microbiologa 9na Edicin.
Editorial Mdica Panamericana.
Sitios Web.
CUESTIONARIO
presente cuando en realidad est ausente) se incrementan. La mayora de las tcnicas moleculares se
basan en la hibridacin de los cidos nucleicos o bien en la reaccin en cadena de la polimerasa
(PCR).
2.- Qu pruebas bioqumicas podra proponer para la identificacin de sta cepa?
Tincin de flagelos, as como las pruebas de oxidasa, catalasa, citrato, SIM (sulfato-indol-movilidad) y
TSI (triple-azcar-hierro), descritos por el manual de Bergeys (1994).
APNDICES / ANEXOS.
Cuadro 1.- Morfologa bacteriana.
Fuente: http://morfobacteriana.blogspot.mx/2011_04_01_archive.html
Tabla 2.- Genero y especies de bacterias segn su afinidad por tipo de sustrato en el complejo
retculo-rumen.