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UNIVERSIDAD DE SANTANDER (UDES)

MICROBIOLOGA VETERINARIA
GUAS DE LABORATORIO
PRACTICA 8: MASTITIS BOVINA

OBJETIVO GENERAL: Adquirir habilidades para la adecuada toma de muestras y procesamiento de


muestras para diagnstico bacteriolgico de mastitis bovina
Desarrollar destrezas en el estudiante de medicina veterinaria para identificar los agentes
etiolgicos frecuentemente implicados en los cuadros de mastitis bovina.

ASPECTOS GENERALES SOBRE MASTITIS BOVINA


La mastitis (mast=seno, itis=inflamacin) es definida clnicamente como un proceso inflamatorio de
la glndula mamaria en respuesta a un agente infeccioso que afecta el flujo normal y calidad de la
leche (1). Se trata uno de los procesos patolgicos de mayor impacto deletreo para la industria
lechera alrededor del mundo debido a que reduce la produccin de leche, incrementa las labores,
los costos de tratamiento y la muerte prematura (2, 3)
La severidad de la inflamacin y el tiempo de duracin permiten clasificar a la mastitis en subclnica,
clnica y forma crnica, con grados variables de severidad para cada entidad, que a su vez dependen
de la edad, alimentacin, estado de lactancia e inmunidad del animal (2).
Las mastitis clnicas se caracterizan por respuestas inflamatorias a la infeccin que causan
alteraciones visibles de las propiedades fsicas de la leche tales como el color o la presencia de
cogulos de fibrina. As mismo, se hacen evidentes signos clnicos en la ubre del animal dentro de
los que se incluyen calor, dolor, inflamacin y enrojecimiento. Si los signos clnicos son localizados
la mastitis ser clasificada como de severidad media o moderada, sin embargo, si existen signos
sistmicos (fiebre, anorexia o shock), el caso clnico ser catalogado como severo. En trminos
generales, las vacas afectadas severamente, producen secreciones mamarias ms serosas en el (los)
cuartern(es) afectado (s) (4)
La mastitis subclnica por su parte, es de difcil deteccin debido a que hay ausencia de signos de
inflamacin local o compromiso sistmico en el animal y de alteracin de la leche producida por el
mismo, razn por la cual esta entidad tiene un mayor impacto econmico y el diagnstico demanda
la implementacin de metodologas de evaluacin en campo y anlisis de laboratorio para
determinar la etiologa de la enfermedad en los casos en los cuales sta haya sido detectada.
La cronicidad de los cuadros est definida por la duracin y el inicio de los sntomas. Las mastitis
agudas se caracterizan por una rpida aparicin de los signos clnicos y una duracin inferior a dos
meses. Aunque las mastitis crnicas son infrecuentes, cuando se presentan resultan en ubres
inflamadas persistentemente.

ETIOLOGA Y PATOGENESIS DE LAS MASTITIS BOVINAS


Los agentes etiolgicos de la mastitis pueden incluir virus, hongos, algas y bacterias, siendo esta
ltima, la etiologa ms frecuente. La mayora de las infecciones y aqullas de importancia
econmica, son las causadas por especies de Estafilococos, Estreptococos y Bacilos Gram negativos,
especialmente bacterias coliformes (). Los agentes etiolgicos de la mastitis clnica son reconocidos
como patgenos mayores, estos a su vez pueden ser considerados patgenos contagiosos o
ambientales, dependiendo de su forma de transmisin y virulencia. Los patgenos contagiosos son
aqullos que pueden diseminarse de un animal enfermo a otro, o de cuartos afectados a sanos
dentro del mismo animal, mientras que los ambientales tienen su hbitat en el entorno de la vaca y
pueden alcanzar al animal particularmente por malas prcticas. Los microorganismos que
conforman la microbiota del pezn, tambin pueden causar, bajo ciertas circunstancias, infeccin
en el hospedador, a stas se les consideran mastitis oportunistas. Los patgenos menores por su
parte, son aqullos que habitualmente causan mastitis subclnica, aunque con baja frecuencia,
pueden estar tambin involucrados en cuadros de mastitis clnica (3).
Los patgenos contagiosos ms comunes en las mastitis son Staphylococcus aureus y Streptococcus
agalactiae (5). Mycoplasma bovis es otro patgeno contagioso cuyos brotes han sido asociados con
introduccin de nuevos animales en el hato. Otros microorganismos frecuentemente encontrados
incluyen patgenos ambientales como Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus uberis, E. coli,
Klebsiella spp, Enterobacter spp, Staphylococcus xylosus y Staphylococcus sciuri. Los Estafilococos
coagulasa negativos como Staphylococcus hyicus y Staphylococcus chromogenes (aislados de leche
y del canal del pezn), son los patgenos oportunistas ms frecuentes y regularmente se asocian
con mastitis subclnicas, teniendo una mayor prevalencia en novillas de primera lactancia que en
vacas, e inmediatamente despus del parto que durante el resto de la lactancia (3).
Aunque existen otros microorganismos capaces de causar mastitis, son de rara ocurrencia como
causa primaria de la enfermedad. Podemos citar entre ellos a Listeria monocytogens, Bacillus cereus,
Clostridium perfringens y Salmonella spp (6). Muchas otras bacterias pueden causar mastitis severa,
la cual es usualmente espordica y afecta solo a una vaca o a pocas de la granja. Dentro de estas
bacterias podemos citar a Nocardia asteroides, Nocardia brasiliensis y Nocardia jarcinica;
Histophilus somni, Pasteurella multocida, Pasteurella mannheimia, Campylobacter jejuni y otras
bacterias Gram negativas que incluyen Citrobacter spp., Enterococcus jaeca, Proteus spp., P.
aeruginosa y Serratia sp (3).
La glndula mamaria tambin puede verse afectada por infecciones sistmicas que se diseminan va
hematgena. Las principales entidades son Leptospira interrogans, Brucella abortus y
Micobacterium tuberculosis (6).
La mastitis se inicia como el resultado de la penetracin de bacterias patgenas a travs del ducto
del pezn al interior de la glndula. Normalmente este canal est estrechamente cerrado por los
msculos del esfnter, previniendo la entrada de los patgenos. El ducto se encuentra recubierto
por keratina, una sustancia serosa derivada de las clulas del epitelio escamoso estratificado,
obstruyendo la migracin bacteriana y combatiendo la infeccin gracias a su contenido de
sustancias antimicrobianas tales como los cidos grasos de cadena larga. No obstante, la
acumulacin del lquido en el interior de la glndula mamaria, como cuando se avecina el parto,
genera una dilatacin del canal del pezn por aumento de la presin intramamaria y fugas de

secrecin, generando vulnerabilidad de la glndula. Adems, durante la lactancia, la keratina es


expulsada fuera del canal y el esfnter se relaja. Se requieren aproximadamente 2 horas para que
ste recobre la constriccin.
Una vez en el interior del pezn, las bacterias deben sortear los mecanismos inmunolgicos
humorales y celulares de la ubre, si no son eliminados, comenzarn a multiplicarse al interior de la
glndula mamaria. La liberacin de toxinas bacterianas induce la secrecin de citoquinas y
sustancias quimioatrayentes por parte de los neutrfilos y las clulas epiteliales, tales como Factor
de necrosis tumoral alfa (FNT), IL8, IL1, prostaglandinas, radicales de oxgeno y protenas de fase
aguda (haptoglobinas y protena amiloide A srica). Estas sustancias atraen efectores celulares del
sistema inmune al sitio de la infeccin, especialmente polimorfonucleares neutrfilos (PMN) (2)
Los PMN fagocitan y destruyen a las bacterias invasoras a travs de sistemas dependientes e
independientes de oxgeno. Ellos contienen grnulos intracelulares que almacenan pptidos
bactericidas, protenas, enzimas (ej: mieloperoxidasa) y proteasas acidas y neutrales (tales como
elastasa, catepsina G, B y D). Los oxidantes liberados y las proteasas destruyen las bacterias y
algunas de las clulas epiteliales, resultando en disminucin en la produccin de leche y liberacin
de enzimas tales como N acetil -D glucosaminidasa (NAGasa) y lactato deshidrogenasa (LDH) (2).
La destruccin de los PMN ocurre por apoptosis y por medio de los macrfagos. Las clulas muertas
del epitelio mamario, adems de los leucocitos muertos, son secretados en la leche, resultando en
altos recuentos de clulas somticas (2)
Las clulas somticas son glbulos blancos (especialmente leucocitos) y ocasionalmente, clulas del
epitelio escamoso. Las clulas encontradas en leche proveniente de glndulas mamarias de bovinos
sin infeccin, incluyen neutrfilos (1-11%), macrfagos (66-88%), linfocitos (10-27%) y clulas
epiteliales (0-7%). El conteo de clulas somticas en animales saludables generalmente es inferior a
200000 clulas/mL, aunque algunos animales pueden exhibir conteos menores que 100000
clulas/mL. El incremento en el nmero de clulas somticas es un fuerte indicador de mastitis (7).
Si la infeccin persiste, la inflamacin interna del epitelio mamario (no detectable externamente),
puede ocurrir. El alveolo de la glndula mamaria puede daarse y comienza a perder su integridad
anatmica. As mismo, la barrera sangre-leche pierde su integridad, haciendo que los componentes
del fluido extracelular tales como cloro, sodio, hidrogeno, potasio e iones hidrxido, entren en la
glndula y se mezclen con la leche (2,7)
Cuando la barrera sangre-leche ha sufrido dao suficiente, la sangre puede detectarse en la leche.
Esto conduce a cambios visibles sobre la ubre como enrojecimiento. Las alteraciones que puede
sufrir la leche incluyen incremento de la conductividad, incremento del pH, aumento del contenido
de agua, la presencia de cogulos visibles y escamas. Estos eventos marcan el inicio de los sntomas
clnicos, y las infecciones ms severas, pueden resultar en muerte del animal.

ACTIVIDADES:
1. Realizar la prueba de mastitis california de acuerdo a las siguientes instrucciones:

a. Toma de muestra: Las muestras de leche deben tomarse aspticamente, para lo cual es
necesario usar guantes.
Es importante que antes de iniciar el muestreo, descarte 3 o 4 chorros de leche de cada
uno de los cuartos que van a muestrearse, para evitar que haya contaminacin de las
muestras con bacterias que se encuentren en pezn.
Sumerja cada pezn durante 20 a 30 segundos en una solucin desinfectante
(hipoclorito de sodio al 4% o isodine al 0,5%).
Seque rigurosamente cada pezn para remover el desinfectante, usando una toalla
descartable por vaca.
Despus de verificar que la ubre y los pezones estn limpios y secos, utilice un algodn
o gaza humedecidas con etanol o alcohol isoproplico para limpiar el orificio del pezn.
Use un algodn para cada uno de los cuartos de inters, incluso si estos pertenecen al
mismo animal. Para evitar contaminacin cruzada, empiece limpiando el pezn ms
lejano y deje para el final, aqul que est ms cerca de Usted.
Abra el tubo estril donde va a dispensar la muestra, cuidando de mantener en su mano
la tapa del frasco con la cara hacia arriba (evite dejar la tapa en el suelo mientras ejecuta
el procedimiento) y proceda a la recoleccin, cuidando de no introducir o tocar con el
pezn la superficie del recipiente colector. Si se va a ejecutar la prueba de mastitis
california en campo, la leche de cada cuarto se dispensa en uno de los cuatro
compartimientos de una paleta de muestreo (previamente identificada) y se procede
con el test.
b. Ejecucin del test mastitis California:
c. Se escurren 3 4 chorros de leche de cada pezn en los compartimentos de la paleta.
d. Se inclina la bandeja en un ngulo de 60 para igualar la cantidad de leche en cada uno
(aproximadamente deben quedar entre 2 y 4 ml de leche).
e. Se agrega una cantidad igual de reactivo (Alquilauril sulfonato de sodio (2ml a 4ml) y se
inicia un proceso suave de agitacin por rotacin durante 15 a 20 segundos.
f. Leer e interpretar la prueba, de acuerdo a la tabla que se muestra a continuacin:

Tincin De Gram: Se realiza la tincin diferencial de Gram para la visualizacin de bacterias en


la muestra de leche, en donde se observa la morfologa celular bacteriana considerndose
bacterias Gram Positivas y Gram Negativas.

Rotular las lminas con el nombre del bovino y el cuarto afectado.

Bajo condiciones de esterilidad, se realiza un extendido delgado de la muestra.

Dejar secar durante 10 minutos. A continuacin, fijar la muestra a la lmina, pasndola


por el mechero de 2 a 3 veces.

Realizar la coloracin de Gram: Cristal Violeta (1minuto), Lugol (1minuto), Alcohol


(15segundos), Safranina (30segundos).

Lavar con agua corriente, dejar secar.

Observar al microscopio con objetivo de 100X

Conteo de clulas somticas (CCS): Se realiza la tincin correspondiente para la deteccin de este
tipo de clulas de la siguiente manera:

Homogenizar la muestra

Con el asa bacteriolgica realizar el extendido en la lmina, previamente rotuladas con el


nombre del bovino y el cuarto afectado.

Dejar secar el extendido, durante 10 minutos.

Realizar la coloracin con Azul metileno al 1%, dejndolo actuar por 1 minuto sobre la
muestra.

Observar al microscopio con el objetivo de 100X

Observar como mnimo 10 campos

El promedio del nmero de clulas por campo, se multiplica por el Factor microscpico. El
valor obtenido corresponder al nmero de clulas/ml.

Para saber el factor microscpico se tuvo en cuenta que el microscopio tuviese un campo de 0.140
mm de dimetro en aumento 100X. Su factor microscpico es de 600.000; o uno con dimetro de
0.180 mm de dimetro cuyo Factor microscpico es de 400.000
Recuento de Mesfilos: Es una medida de la condicin de higiene de los establecimientos, esta
prueba brinda informacin sobre el nmero total de bacterias presentes en la leche al recolectarla.

Las Placas Petrifilm para Recuento de Aerobios mesfilos, son un medio de cultivo listo para ser
empleado, que contiene nutrientes del Agar Standard Methods, un agente gelificante soluble en
agua fra, y un tinte indicador de color rojo que facilita el recuento de las colonias.
(guia_petrifilm_aerobios.pdf)
IDENTIFICACION DEL AGENTE ETIOLOGICO
Con las muestras positivas en la prueba CMT y recuento de mesfilos superior a 400.000 /ml se
realizan los cultivos microbiolgicos
1.
2.
3.
4.

Realizar la respectiva siembra en los medios Agar sangre y MacConkey


Continuar con los procedimientos segn resultados obtenidos a las 24 horas de incubacin.
Identificacin del agente etiolgico
Realizacin del A/B

ACTIVIDADES PRE LABORATORIO


1. Consulte el fundamento del test de mastitis california
BIBLIOGRAFA
1. Basdew, I. H., & Laing, M. D. (2011). Mini-Review: Biological control of bovine mastitis using

2.
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research and technological advances. World Scientific, Singapore, 386-393.
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current trends and future perspectives. Trends in biotechnology, 27(8), 486-493.
Hamadani, H., Khan, A. A., Banday, M. T., Ashraf, I., Handoo, N., Bashir, A., & Hamadani, A.
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Ali, M. A., Ahmad, M. D., Muhammad, K., & Anjum, A. A. (2011). Prevalence of sub clinical
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Lpez, H. M. Mastitis bovina: Enfoque biotecnolgico. Revista ReCiTeIA.

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7. Ruegg, P. L., & Reinemann, D. J. (2002). Milk quality and mastitis tests.Bovine
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