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UNIVERSIDAD DE LOS ANDES

FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS
BIOLOGICAS

LABORATORIO DE BIOQUIMICA
GENERAL
Profesores: Camila Pulido y Juan Jos Silva

Perodo: 2016-1

Prcticas de Laboratorio No. 8 y No. 9


CARACTERIZACIN DE LPIDOS: SEPARACIN ELECTROFORTICA DE LIPOPROTEINAS Y
CUANTIFICACIN DE COLESTEROL

Figura No. 1 Algunos lpidos de importancia Biolgica.

1.

INTRODUCCION

Es difcil presentar una definicin general y til de los lpidos ya que constituyen un amplio espectro de
compuestos que difieren marcadamente en su estructura qumica. Sin embargo, pueden definirse como
biomolculas que se encuentran en los organismos vivos, insolubles en agua pero solubles en los llamados
solventes orgnicos, como cloroformo, alcohol etlico, acetona, benceno y ter. Esta definicin no es perfecta:
algunos lpidos tienen una capacidad limitada para disolverse en agua, en tanto que ciertos lpidos fosforados
son ms o menos insolubles en acetona. Como la definicin anterior es muy amplia, entre los lpidos se
incluyen sustancias de estructura molecular muy diversa: cidos grasos, terpenoides (vitaminas A, E y K),
carotenoides, esteroides (colesterol, cortisona, estrgenos), prostaglandinas, triglicridos, fosfolipidos y
esfingolipidos (Ver figura No.1). Aparte de la intensa actividad biolgica que ejercen algunas de estas
sustancias (las vitaminas y las hormonas), los lpidos parecen tener cuatro funciones generales:

Componentes estructurales de las membranas celulares.


Depsito y almacenamiento intracelular de energa metablica.
Transporte de dicha energa metablica.
Proteccin y aislamiento del organismo.

Los lpidos ms comunes encontrados en animales pueden dividirse en forma general en cuatro grandes
categoras: CIDOS GRASOS LIBRES, TRIACILGLICRIDOS, COLESTEROL Y FOSFOLPIDOS. Los tres
primeros son lpidos simples porque no se degradan mediante hidrlisis o porque, al degradarse, nicamente
producen derivados lpidos ms glicerol. Los fosfolpidos son lpidos compuestos; su hidrlisis produce
derivados lpidos, fosfato inorgnico, glicerol y otro producto soluble en agua.
ACIDOS GRASOS LIBRES

Los cidos grasos de los fluidos extracelulares y los tejidos son compuestos alifticos, de cadena nica y
terminada en un grupo cido carboxlico (-COOH). Pueden ser saturados o no saturados y tienen un nmero
par de tomos de carbono. Cuando se encuentran en esta forma, se llaman cidos grasos libres (AGL). Sin
embargo, la mayora de los cidos grasos de los organismos se encuentran presentes en suero y tejidos
formando steres o amidas. Los cidos grasos saturados ms abundantes del organismo son el palmtico
(CH3-[CH2]14- COOH) y el esterico (CH3-[CH2]16- COOH) los cuales contienen 16 y 18 carbonos,
respectivamente. El cido graso no saturado ms abundante del organismo en mamferos es el oleico. Este
es un cido de 18 carbonos con un enlace doble en la posicin nueve:

CH3-[CH2]7-CH=[CH2]7 -COOH
Algunos cidos grasos se consideran esenciales porque su ausencia en la dieta ocasiona manifestaciones de
deficiencia: linoleico, linolnico y araquidnico, que tienen 2, 3 y 4 enlaces dobles, respectivamente. Estos
cidos con dobles insaturaciones han adquirido gran importancia a nivel humano, ya que pueden ayudar en
la remocin de colesterol del sistema y previenen el proceso de aterosclerosis, disminuyendo la frecuencia de
la enfermedad vascular coronaria en edades tempranas.
En relacin a su tamao, se habla bsicamente de tres grupos de cidos grasos: de cadena corta cuando el
numero de carbonos es 6 ( Ej: Caproico), de cadena media cuando oscila entre 8-10 carbonos (Ej: caprilico)
y de cadena larga 12 carbonos (Ej: palmitico)
TRIACILGLICERIDOS (TRIGLICERIDOS)
Son compuestos en los cuales cada uno de los tres grupos alcohlicos del glicerol se ha esterificado con un
cido graso, donde R1, R2 y R3 representan cadenas hidrocarbonadas de los cidos grasos. Los triglicridos
simples contiene una sola variedad de cido graso; los mixtos mas de una. (Ver figura No.1)
Un gran porcentaje de la masa del tejido adiposo en vertebrados se compone de triglicridos y una cantidad
muy reducida de monoglicridos y diglicridos. Por lo tanto la forma ms abundante de lpidos en los
organismos son los triacilglicridos. Los cidos grasos que forman parte de estas molculas varan con las
distintas especies de animales. An dentro de la misma especie, la variacin est relacionada con la dieta, la
edad, el clima y otros factores. En el tejido adiposo humano, los principales cidos grasos que forman parte
de los triglicridos, segn un orden decreciente, son: oleico, palmtico, linoleico y esterico.
Los triglicridos constituyen la forma ms eficaz de almacenamiento de energa, ya que tienen un alto
contenido calrico (aproximadamente 9 kcal/g), y se depositan en grandes cantidades en el tejido adiposo,
casi sin agua. Los triglicridos slidos se llaman grasas; los lquidos, aceites. La principal diferencia entre
grasas y aceites es el contenido relativamente alto de cidos grasos no saturados en los aceites. La mayor
parte de las grasas animales son triglicridos que contienen cidos grasos no saturados y saturados; pero
predominan estos ltimos, por lo cual estas grasas son slidas a la temperatura ambiente. Los triglicridos de
origen vegetal existen en forma de aceites y poseen un alto contenido de cidos grasos no saturados.
COLESTEROL
El colesterol es un miembro de una abundante clase
de compuestos biolgicos llamados esteroles. Estos
son alcoholes cclicos de alto peso molecular que se
encuentran en todos los organismos vivos. Son
derivados del ncleo Ciclopentano perhidrofenantreno, que tambin se llama ncleo esteroide, un
esterol de 27 tomos de carbono con un grupo
hidroxilo (-OH) en el carbono 3 (Ver figura No 2.
Puede encontrarse en los fluidos extracelulares y en
los tejidos en forma libre o esterificado con cidos
grasos. La esterificacin es una funcin del radical
hidroxilo. Es el esterol ms abundante de los tejidos
animales: se lo encuentra en la membrana celular y,
en menor cantidad, en las membranas de
mitocondrias y de retculo endoplsmico.

Figura No. 2 Estructura del Colesterol.

El colesterol, es la molcula mas pequea a nivel biolgico, que ha recibido mayor numero de
condecoraciones. Entre los cientficos que han dedicado su vida al estudio de este compuesto, trece han sido
galardonados con el Premio Nobel. Su aislamiento se produjo en 1784 a partir de los clculos biliares y su
seguimiento ha tenido dos fronteras muy importantes, por un lado su papel como agente causal en la

afeccin coronaria y su autentica propiedad que lo hace extraordinariamente til en las membranas celulares,
como lo es su absoluta insolubilidad en agua, propiedad que lo hace letal para el primer fenmeno. El
colesterol se sintetiza a partir del acetil-CoA y sus rutas metablicas posteriores generan una gran variedad
de mensajeros qumicos muy potentes, llamados esteroides u hormonas esteroideas.
FOSFOLIPIDOS

Figura No. 3 Fosfolipidos. Fosfatidilcolina como modelo estructural.

Los fosfolpidos o fosftidos se encuentran en todas las clulas animales y vegetales. Se componen de un
alcohol, cidos grasos, cido fosfrico y otro compuesto que puede ser colina, etanolamina, serina o inositol.
Las lecitinas estn formadas por steres de glicerol, dos cidos grasos, cido fosfrico y colina (como
fosfatidilcolina). Las cefalinas son compuestos semejantes, pero en vez de colina contienen etanolamina o
serina (fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina). Otros fosfolpidos relacionados con las lecitinas y las cefalinas
son derivados del fosfatidil-inositol. Las esfingomielinas contienen esfingosinol en lugar de glicerol; el
esfingosinol es un alcohol aminado.
Todos los fosfolpidos se encuentran en grandes cantidades en el tejido nervioso. Las lecitinas desempean
una funcin importante en el transporte de grasas de un tejido a otro y son fuente de cido fosfrico para las
sntesis celulares. Las cefalinas son factores esenciales en la coagulacin sangunea.
2.

POLARIDAD Y SOLUBILIDAD (DE LOS LIPIDOS)

Los compuestos qumicos en general pueden dividirse


en hidrfilo e hidrfobo segn se disuelven o no en
agua. Esta propiedad reside en la polaridad de los
compuestos y existe una relacin directa entre
polaridad y solubilidad en agua. Los lpidos, a
excepcin de algunos fosfolpidos, son muy poco
polares y, por tanto, prcticamente insolubles en agua.
Los grupos qumicos no polares de los lpidos del suero
incluyen las cadenas hidrocarbonadas de los cidos
grasos y los anillos cerrados del ncleo de los
esteroides. Sin embargo, los lpidos tambin contienen
grupos polares, incluyendo uniones estricas en
triglicridos y fosfolpidos, y el grupo hidroxilo del
colesterol.
Los grupos no polares predominan en la mayor parte de
los lpidos sricos y, por tanto, no son solubles en agua.
Debido a esto, los lpidos no pueden ser transportados
en forma libre por los sistemas sanguneos de los
mamferos, requieren entonces de un sistema de
transporte muy especializado, constituido por un

ensamblaje de protenas y lpidos, denominados Lipoprotenas.

Figura No. 4

Lipoprotena. Modelo estructural.

3.

LIPOPROTEINAS

Las lipoprotenas son partculas seudomicelares solubles en agua, formadas por lpidos (Triglicridos,
Colesterol y Fosfolpidos) unidos a una o ms protenas especficas llamadas Apoprotenas. La estructura
de estas macromolculas esta sujeta a cambios constantes, los que son consecuencia de interacciones entre
ellas y con las enzimas y receptores del microambiente corporal. Adems, existe hacia el plasma un ingreso
continuo de partculas nacientes (Dieta y Biosntesis) y una remocin constante de partculas viejas. Estos
movimientos dan como resultado una gran heterogeneidad en las molculas de lipoprotenas. La funcin
primordial de las lipoprotenas del plasma es el transporte de lpidos. El material principal que transportan
(varios cientos de gramos al da) son los triglicridos. Este sistema permite acomodar cientos de molculas
de triglicridos en las partculas Lipoproteicas y llevarlas hacia los tejidos de manera especfica. Los cidos
grasos unidos al glicerol constituyen 90% de la masa y 95% de la energa potencial de una molcula de
triglicridos.
En los mamferos los cidos grasos libres tambin son transportados en el plasma unidos en forma no
covalente con la albmina, sin embargo esta forma de transporte no posee el alto grado de especificidad que
tienen las lipoprotenas para el tejido blanco. Ambas proveen al organismo de un sistema verstil al movilizar
substratos para el metabolismo energtico.
El colesterol es otro de los materiales transportados por las lipoprotenas, en forma de steres, sintetizados
tanto en el plasma como dentro de las clulas. Su transporte se lleva a cabo por las lipoprotenas hacia los
tejidos en los que se requiere tanto para intervenir como componente estructural como para permitir la
obtencin de metabolitos.
Los fosfolpidos, la tercera variedad de lpidos contenidos en las lipoprotenas, tambin son transportados
hacia los tejidos en los que forman parte de las membranas celulares y subcelulares; adems, desempean
un papel fundamental al formar parte de la estructura de las lipoprotenas y proporcionan el substrato
necesario para la accin de la enzima encargada de la esterificacin del colesterol en el plasma (LCAT:
Lecitina-colesterol acil transferasa).
ORGANIZACION Y ESTRUCTURA DE LAS LIPOPROTEINAS
Los lpidos no polares, como los triglicridos y los steres de colesterol, son transportados en la parte
central de la molcula esfrica de la lipoprotena. Estos lpidos forman microemulsiones, siendo el elemento
emulsificador un fosfolpido, generalmente lecitina (fosfatidilcolina). El colesterol, que contiene un grupo
hidroxilo polar, soluble en agua, es uno de los componentes de la monocapa que constituye la superficie de
las lipoprotenas. El resto de la molcula de colesterol, que es insoluble, se localiza en el centro de la
molcula de lipoprotena. Cada una de las lipoprotenas posee una o ms apoprotenas que tienen varias
regiones helicoidales con propiedades anfipticas; es decir, poseen grupos polares (solubles) y grupos no
polares (insolubles). Las regiones no solubles penetran en el ncleo no polar de la partcula de lipoprotena y
las regiones solubles se encuentran en la superficie, en contacto con el ambiente acuoso. Cada apoprotena
posee determinantes especficos que le permiten funcionar como cofactor de las enzimas o como ligando
para los receptores de las superficies celulares. Por tanto, las apoprotenas juegan un papel importante en
las lipoprotenas, desde los puntos de vista funcional y estructural.
Cuanto ms grande sea la partcula, mayor ser la cantidad de triglicridos y colesterol que puede transportar
en su ncleo. Los lpidos polares y las protenas que componen la superficie de las lipoprotenas son ms
densos que los lpidos no polares del ncleo (centro). As, al disminuir el tamao de las partculas, aumenta la
relacin protena/lpido. Esta propiedad es la base sobre la cual es posible efectuar la separacin de las
lipoprotenas por ultracentrifugacin. Sin embargo, para los procesos analticos de esta prctica se har el
estudio por mecanismos electroforticos, que ofrecen una gran confiabilidad.
NOMENCLATURA Y COMPOSICION DE LAS LIPOPROTEINAS
La nomenclatura de las lipoprotenas se basa tanto en su separacin con la ultracentrfuga como en su
movilidad electrofortica. Las lipoprotenas aisladas del fluido vascular de mamferos sin alteraciones
metablicas en el transporte de lpidos, se han dividido en cuatro clases principales: Quilomicrones (QM),
Lipoprotenas de muy baja densidad (VLDL), del ingls very low density lipoproteins, Lipoprotenas de
baja densidad (LDL), del ingls low density lipoproteins y Lipoprotenas de alta densidad (HDL) , del
ingls high density lipoproteins. Existen dos clases ms. Una es producto intermedio del catabolismo de
los quilomicrones, los remanentes de quilomicrones, que se encuentran en la circulacin despus de la
ingestin de grasa. La otra est constituida por las Lipoprotenas de densidad intermedia (IDL), del ingls

intermediate density lipoproteins, que provienen de la hidrlisis de las VLDL y permanecen por muy corto
tiempo en el plasma.
POLO (-)
CLASE D: (nm)
D: g/ml
MOV. ELECTROFORETICA
QM

100

0.93

ORIGEN (SIEMBRA)

LDL

20

1.019-1.063

BETA

VLDL

30 - 90

0.93-1.006

PRE-BETA

IDL

20 - 30

1.006-1.019

PRE BETA -LENTA-

HDL

10

1.125-1.210

ALFA

QM

ORIGEN

LDL

BETA

VLDL/ IDL
HDL

PRE-BETA
ALFA

POLO (+)

FUNCIONES DE LAS LIPOPROTEINAS (Ver Figura No. 5)

QUILOMICRONES: Transporte de lpidos desde el intestino (origen exgeno: provienen de la dieta)


hasta el tejido adiposo y el Hgado.
VLDL: Transporte de lpidos desde el hgado a todo el sistema ( es decir los lpidos de origen endgeno,
porque son sintetizados en el hgado).
LDL: Producto de degradacin de las VLDL, son las partculas de sistema con mayor carga de colesterol
y son las directamente relacionadas con procesos de dao del endotelio de vasos sanguneos.
HDL: Son las lipoprotenas protectoras del sistema, sus partes son sintetizadas por los ribosomas del
retculo endoplsmico rugoso del intestino y el hgado, son las encargadas de remover el colesterol de
sistema.

Figura No. 5 Metabolismo global de las Lipoprotenas.


4.

CARACTERIZACIN DE LPIDOS: CUANTIFICACIN DE COLESTEROL HDL

FUNDAMENTO
Las lipoprotenas de muy baja densidad (VLDL) y de baja densidad (LDL) presentes en la muestra, precipitan
en presencia de fosfotungstato y iones magnesio. El sobrenadante contiene las lipoprotenas de elevada

densidad (HDL), cuyo colesterol se cuantifica espectrofotomtricamente mediante las siguientes reacciones
acopladas:

MUESTRA
Suero o plasma.
PROCEDIMIENTO
PRECIPITACIN
1.

Muestra 0.1mL y 0.25mL Reactivo A (Kit colesterol HDL).

2.

Agitar e incubar por 10 min a temperatura ambiente

3.

Centrifugar durante 10 min a 4.000 r.p.m

4.

Colectar el sobrenadante.

COLORIMETRIA

Incubar a temperatura ambiente 30 min o 10 min a 37oC. Leer 500nm

5.

CARACTERIZACIN DE LPIDOS: CUANTIFICACIN DE COLESTEROL

FUNDAMENTO
El mtodo para determinacin de Colesterol corresponde a una nueva generacin de mtodos enzimticos
cuya caracterstica fundamental es que son de una sola Etapa, esto quiere decir que se pude hacer una
cuantificacin directa del colesterol sin necesidad de hacer extraccin o purificacin del esteroide (Colesterol)
por medio de solventes orgnicos.
El mtodo es un procedimiento de punto final, lo que define que se agrega la muestra, se lleva a incubacin y
se hace una sola determinacin de absorbancia al final del tiempo indicado por el fabricante, no un
seguimiento de toda la reaccin, como en algunas pruebas cinticas.
ETAPAS DE REACCION

1
2
3
4

Esteres de colesterol Colesterol Estearasa Colesterol + cidos grasos


Colesterol + 02 Colesterol Oxidasa Colest-4-en3-ona + H202
H202 + Aminofenazona Peroxidasa Quinonimina + 4H20
Quinonimina (Complejo coloreado que absorbe en un rango de 500- 525 nm)

MUESTRA.
Cualquier espcimen o sobrenadante contenga o no protenas es adecuado para este estudio.
REACTIVO

Se puede trabajar cualquier mtodo enzimtico, disponible en el mercado.


PROCEDIMIENTO
SOLUCION REACTIVA
PATRON
MUESTRA

BLANCO
PATRON
600 ul
600 ul
-----6 uL
----------Mezclar e incubar 15 minutos a 37 C
LEER Absorbancia a 500 nm

MUESTRA/CONTROL
600 ul
-----6 uL

CALCULOS
Determinar la concentracin de colesterol por medio de una curva de calibracin y calculando el factor.
(Estndares: 0.25g/L 0.5g7L 1g/L y 2g/L)
6.

ELECTROFORESIS DE LIPOPROTEINAS

Figura No. 5 Esquema de composicin y distribucin electrofortica de lipoprotenas.


La finalidad de la electroforesis es separar las fracciones principales de lipoprotenas en bandas
relativamente homogneas para poder evaluar en forma semicuantitativa y cualitativa el perfil lipoproteco
completo. En los estudios referidos a los diferentes medios de soporte (papel, agarosa, agar, almidn,
poliacrilamida y acetato de celulosa) se aplican los mismos principios que en los procedimientos con lmites
mviles.
En consecuencia, para lograr una electroforesis de lipoprotenas exacta y reproducible deben controlarse los
factores que afectan la migracin de partculas en un campo elctrico. Brevemente estos son:

Carga neta de la molcula. El pH debe ser controlado en forma exacta y reproducible para obtener un
perfil lipoproteico adecuado con una ptima resolucin de las bandas de lipoprotenas.

Fuerza inica y viscosidad. Los resultados mejores y ms reproducibles requiere un buffer adecuado
para el medio electrofortico. Si bien los buffers con elevada fuerza inica permiten la formacin de
bandas ms definidas y mejores separaciones, la resolucin puede ser afectada en forma adversa por un
mayor calentamiento que desnaturaliza los solutos termolbiles.

Intensidad del campo elctrico. Debe ser controlada en forma reproducible. Una intensidad de
corriente demasiada elevada puede elevar la temperatura del medio de soporte causando la
desnaturalizacin de las protenas y una escasa migracin y resolucin.

Tipo de medio de soporte. Este es uno de los factores ms importantes en las separaciones de
lipoprotenas. La carga del medio de soporte puede provocar un efecto endosmtico; en los medios
donde la endsmosis es intensa, como en el gel de agar, estos efectos hacen que la lipoprotena-X de
migracin lenta sea arrastrada hacia el ctodo por detrs del punto de aplicacin.

MUESTRA

Se prefiere el uso de plasma, permite una mejor conservacin de las VLDL.


7.

PROCESO EXPERIMENTAL

a.

Cada grupo har la determinacin de Colesterol en suero (de dos estudiantes), junto con una muestra
control. Cada espcimen se analizar por duplicado. (Realizar las lecturas en el espectrofotmetro).

b.

Escriba los resultados obtenidos en las pruebas cualitativas y la determinacin de glucosa en la hoja que
le proporcionar el monitor.

8.

CUESTIONARIO DE EVALUACION

AYUDA PARA EL ANLISIS DE RESULTADOS:


Para el anlisis de la prueba cuantitativa para Colesterol, se deben recolectar todos los datos de absorbancia
obtenidos por los dems grupos de trabajo y calcular las concentraciones. Determine promedio, desviacin
estndar y coeficiente de variabilidad (CV). Discuta ampliamente los resultados. Observacin: Un mtodo
cuantitativo no debe ofrecer CV superiores al 5%**, pero dadas las condiciones de aprendizaje en las que se
desarrolla el curso se aceptar hasta un 10%. (** La excepcin a la regla son los estudios enzimticos que se
acepta un CV hasta el 10%).
1.

Si la cantidad de muestra sembrada en el pozo es de 20uL y la concentracin de colesterol es conocida


por usted (valores establecidos con la curva de calibracin) Cul es la cantidad de muestra en
microgramos que puede detectar el colorante Sudan-Black (utilizado en la prctica)? Justifique su
respuesta realizando los clculos.

2.

Teniendo en cuenta el metabolismo de los lpidos en el organismo, realice una tabla comparativa entre
el transporte exgeno y el transporte endgeno. Tenga en cuenta cada una de las apoprotenas y
enzimas involucradas. Describa la funcin que cumplen cada una de ellas, en que lipoprotenas se
encuentran y nombre las enfermedades asociadas.

3.

El grupo de investigacin en desordenes del metabolismo de la Universidad de los Andes, trabaja sobre
un grupo familiar que presenta una alteracin en la captacin intestinal de grasa, en donde slo se
ingresa al sistema un 2% de la grasa consumida. Teniendo en cuenta el transporte de lpidos conteste:

Qu lipoprotenas estaran seriamente afectadas?


Desapareceran los triglicridos de la circulacin?
Qu otros componentes de naturaleza lipdica podran afectarse y causar serios inconvenientes a
estos individuos?
Si tuviera que realizar una electroforesis de lipoprotenas, Cmo esperara encontrar el corrido
electrofortico?

Justifique sus respuestas lo ms claro posible, si considera necesario elabore un esquema.


4.

Se esta ensayando un nuevo Colorante para lipoprotenas Sudan-Black-564, el cual sufre el mismo
proceso de preparacin para las muestras que el Sudan-Black utilizado en la prctica (200ul de plasma
y 100ul de colorante), con la diferencia que solo se necesita depositar 2ul de muestra en el pozo a
diferencia del normal que esta aproximadamente en 30ul). Cuntos microgramos de lpido de un
individuo con 100 mg/dl de colesterol colocara en el pozo? Realice la comparacin entre ambos
colorantes Cuntas veces es mas sensible este ltimo?

5.

Se tiene una cepa de ratones, afectados con una


Apolipoprotena C-II, qu anormalidades encontrara en
en estos animales? Si se realizara una electroforesis de
electrofortico? Justifique su respuesta adecuadamente
apolipoprotena.

mutacin puntual que compromete la


las concentraciones de lpidos sanguneos
lipoprotenas que encontrara en el patrn
teniendo en cuenta la funcin de esta

8.

BIBLIOGRAFIA

1.

KAPLAN L.A., PESCE A. Clinical chemistry theory, analysis and correlation. The C.V. Mosby Co. St.
Louis, p. 1194-1213.1984.
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MATHEWS C., VAN HOLDE K.E. Bioqumica. Segunda Edicin, Editorial McGraw-Hill- Interamericana
p. 688-691. 1998
MURRAY R., MAVES P., GRANNER D., RODWELL V. Bioqumica de Harper, Editorial el Manual
Moderno. P. 309-327. 2001