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RESUMEN: PROTEASOMA, UN DESTINO DE DAO

OXIDATIVO EN CELULAS CULTIVADAS DEL PIGMENTO


EPITELIAL DE LA RETINA HUMANA
El fin del artculo surge como observacin de que la disfuncin de va
ubiquitina-proteasona (UPP) se asocia con varias enfermedades degenerativas
relacionadas con la edad, pues la ubiquinizacin es un importante sistema del
control de las protenas que sern degradadas por el proteasoma, de lo
contrario, las protenas anormales o mal plegadas, que pueden ser resultado
de situaciones de estrs ambiental, pueden causar daos irreparables. El
objetivo es por tanto investigar el efecto del estrs oxidativo en la UPP de las
clulas de la retina (EPR).
La investigacin del efecto del estrs oxidativo en la UPP en un cultivo EPR se
realiz simulando el estrs oxidativo, exponiendo al cultivo celular a perxido
de hidrogeno (H2O2) de forma continua o tambin a foto-oxidacin; la actividad
de los proteasomas fueron controlados mediante pptidos y se revis la
actividad de conjugacin ubiquitina con ensayos tiolester.
Para tal fin, primero se hizo la exposicin a H 2O2 de clulas clulas del epitelio
pigmentario de la retina (EPR) en lnea (ARPE-19) incubadas en suero,
piruvato y fenol. Tambin se expuso estas clulas a A 2E (fluorforo de la
lipofuscina) y azul claro como su potenciador, para simular el estrs
fotoxidtico. Los conjugados de ubiquitina formados (Ub E1) o tiolsteres
ubiquitina (E2) se visualizaron por autorradiografa.
La actividad del proteasoma de clulas ARPE-19 se determin, utilizando
pptidos. La actividad del proteasoma fue definida como la actividad peptidasa
en los extractos celulares.
Los resultados de la exposicin de las clulas ARPE-19 de 40 a 50 M H 2O2
durante 4 horas resultarn en una reduccin de 30% a 50% en todas las tres
actividades de peptidasa del proteasoma. Del mismo modo, la exposicin de
clulas ARPE-19 a A2E cargado y/o a luz azul, result en una reduccin del
40% al 60% en la actividad del proteasoma. La carga de A2E o la exposicin a
la luz azul tuvieron poco efecto sobre la actividad del proteasoma. En contraste,
la exposicin de ARPE-19 a niveles bajos de H 2O2 (10 M) estimul la actividad
de conjugacin de la ubiquitina. La carga de A 2E, con o sin exposicin a la luz
azul, vari los niveles de la activacin de enzima ubiquidina y aumento la
actividad de conjugacin.
La exposicin a H2O2 o fotooxidacin mediada por A2E tambin result en un
doble a triple aumento en los niveles de conjugados de ubiquitina endgena.
Adems para estudiar el efecto del estrs oxidativo fisiolgicamente relevante
en la UPP, primero se determin los niveles de conjugados de ubiquitina

endgenos en clulas del EPR. Como se inform en otros tipos de clulas, la


mayora de los conjugados de ubiquitina detectados en clulas ARPE-19 fueron
de alta masa. En esta investigacin, los niveles de conjugados de ubiquitina
endgenos aumentaron aproximadamente 2,5 veces cuando las clulas fueron
expuestas a una media de 10 M H 2O2 durante 4 horas (estrs oxidativo
fisiolgicamente relevante). La exposicin a 50 M H 2O2 aument los niveles de
conjugados de ubiquitina endgenas en aproximadamente 3,2 veces.Los
ensayos Tiolster mostraron que el nivel de E1 Ub tiolster no cambi despus
de la exposicin, lo que indica que la actividad E1 no fue afectada por estos
niveles de estrs oxidativo. Por otro parte, con mltiples E2 en clulas de
mamfero, tiolster ensayos detectan al menos cuatro E2 activos diferentes en
clulas ARPE-19. Los niveles de todos estos tiolsteres E2 Ub aumentaron
aproximadamente 60% en la exposicin a 10 MH.
Se evalu adicionalmente el efecto de foto-oxidacin mediada por A 2E en la
actividad de ubiquitina-conjugacin. Se encontr que la acumulacin de A 2E,
independientemente de exposicin a la luz azul, mejor la capacidad de los
lisados de clulas para formar conjugados de ubiquitina por 1.8- a 2,6 veces.
La actividad de ubiquitina-conjugacin mejorada pareca correlacionarse con un
aumento en los niveles de Ub E1 y E2 tiolsteres. La exposicin a la luz azul
sola no tuvo efecto detectable sobre los niveles de E1 en las clulas. Estos
datos indicaron que la regulacin al alza del sistema ubiquitina-conjugacin en
respuesta al estrs oxidativo leve puede explicar en parte la acumulacin de
conjugados de ubiquitina endgenos en las clulas RPE.
Resumiendo lo referido se puede decir que, la foto-oxidacin mediada por A2E
tambin result en un aumento de 3,5 veces en los niveles de conjugados de
ubiquitina endgena en las clulas. La exposicin a la luz azul solo tuvo poco
efecto sobre los niveles de conjugados de ubiquitina endgena, mientras que la
acumulacin de A2E solo result en un aumento de 1,7 veces en los niveles de
conjugados endgenos. La acumulacin dramtica de conjugados de ubiquitina
endgena, cuando se expuso a la RPE con niveles fisiolgicamente pertinentes
de estrs oxidativo; indic, que la capacidad de las clulas para procesar
ubiquitina conjugados se vio afectada por el estrs oxidativo.
Por otro lado, a fin de probar el efecto de la oxidacin fisiolgicamente
relevante sobre la actividad de la proteasoma, se evalu el efect de la
fotooxidacin mediada por A2E en la actividad del proteasoma en clulas
ARPE-19. Encontrndose que la exposicin a la luz azul o a la acumulacin de
A2E e forma independiente, solo tuvo poco efecto sobre la actividad del
proteasoma. En contraste, la acumulacin de A2E y la exposicin a la luz azul
juntas, resultaron en una disminucin de 40% a 60% en las tres actividades de
peptidasa del proteasoma. La actividad de tipo quimotripsina y la actividad de
tipo tripsina del proteasoma fueron preferentemente afectadas por
fotooxidacin. Es decir, los datos indican que el proteasoma en RPE es

susceptible al estrs oxidativo y puede ser inactivado por el estrs oxidativo


fisiolgicamente relevante. La actividad en el sobrenadante de clulas ARPE19 H2O2 o la inactivacin inducida por fotooxidacin-del proteasoma pueden ser
mediados por las especies reactivas de oxgeno o por productos de la
peroxidacin de lpidos.
Tambin se investig los efectos de H 2O2 y HNE sobre las protenas, la
pregunta era si las protenas oxidadas afectaran al proteasoma. Para lo cual
se prepar el sobrenadante-proteasoma libre de clulas ARPE-19, una fraccin
del sobrenadante-proteasoma libre se trat con H 2O2. Resultando que el
tratamiento del sobrenadante con H2O2, aumento significativamente los
carbonilos de protenas, un indicador de la oxidacin de protenas. Se
aadieron tambin, fracciones de proteasoma libre no oxidado u oxidadas a la
fraccin enriquecida de proteasoma ARPE-19 y despus se midi la actividad
de tipo quimotripsina del proteasoma. Encontrandose que la adicin de la
proteasoma no oxidado fraccin libre a la fraccin enriquecida con proteasoma
no tuvo efecto sobre la actividad del proteasoma. Estos datos indican que el
H2O2 y HNE, pero no protenas oxidadas, inhiben la actividad del proteasoma.
Para concluir se recuerda que la UPP juega un papel importante en un gran
nmero de funciones celulares, como el control de la calidad proteica y que,
una extensa agresin oxidativa tambin puede probablemente daar o poner
en peligro el funcionamiento de de las clulas RPE. En este trabajo se
evaluaron los efectos de los factores de estrs oxidativo fisiolgicamente
relevantes de la UPP en las clulas RPE humanas cultivadas.
Los datos obtenidos y ya referidos sugieren, que las especies reactivas del
oxgeno o productos de peroxidacin de lpidos tales como HNE juegan un
papel importante en la inactivacin del proteasoma sobre el estrs oxidativo
fisiolgicamente relevante. En consonancia con la observacin de que el
proteasoma en clulas ARPE-19 es susceptible al estrs oxidativo, de igual
forma los experimentos realizados mostraron que el proteasoma fue inhibido
por especies reactivas del oxgeno o productos de peroxidacin de lpidos pero
no por protenas oxidadas (condiciones oxidantes suaves). Aunque los datos
tampoco descartan esta posibilidad.
Este trabajo indica tambin que otro mecanismo, la inactivacin oxidativa de la
proteasoma, tambin podra contribuir a la acumulacin de conjugados de
ubiquitina en respuesta al estrs oxidativo.
En conclusin se puede afirmar que la disminucin, relacionada con la edad, en
la capacidad antioxidante en muchos tejidos, reducir la actividad del
proteasoma en muchos tejidos, incluyendo retina; esta disminucin en la
actividad del proteasoma puede ser responsable de la acumulacin de
protenas daadas en varios tejidos, en particular para clulas. Por tanto,
proteccin del proteasoma de la inactivacin oxidativa puede ser una estrategia

vlida para prevenir la relacionada con la edad acumulacin de protenas


daadas y la aparicin o el progreso de enfermedades.
Los datos de este trabajo indican, que el proteasoma es un objetivo de estrs
oxidativo y que la inhibicin del proteasoma puede explicar la acumulacin de
conjugados de ubiquitina. Por ejemplo, la inactivacin oxidativa de la
proteasoma en RPE podra ser una de las conexiones mecnicas entre el
estrs oxidativo y la patognesis de la AMD (degeneracin macular relacionada
con la edad).
Por lo tanto, la proteccin del proteasoma de la inactivacin oxidativa puede ser
una estrategia vlida para la prevencin de enfermedades relacionadas con la
edad, incluyendo AMD