Guia Bioquimica General

UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA PROFESIONAL DE TECNOLOGIA MDICA
ESPECIALIDAD LABORATORIO CLINICO Y ANATOMIA

PATOLOGICA
BIOQUIMICA
GENERAL
III CICLO
EPTM LABORATORIO CLINICO

Y ANATOMIA PATOLOGICA
GUIA DE PRACTICA N 1
TOMA DE MUESTRA SANGUNEA. INSTRUCCIONES PARA LA TOMA DE

MUESTRA.
I. Objetivo:
El alumno al final de la prctica tendr los conceptos bsicos de una

correcta toma de muestra.
II. Fundamento terico:
Para realizar una puncin elegimos una de las venas que tenemos en el
antebrazo, la ms visible, o palpable (entre la baslica, ceflica o medial
cubital). La puncin puede ser a lo largo de todo el brazo, aunque es
recomendable que se haga en la zona de la fosa del codo. Pero no se
debe de llevar a cabo la puncin si la zona tiene algn tipo de herida ya
sean cortes, quemaduras, etc. Para llevar a cabo la puncin se debe de
llevar puesta la chaqueta de trabajo y guantes para evitar mancharse o
infectar la zona. Tambin se debe de tener todo el material preparado
para evitar por ejemplo tener la aguja incrustada y evitar la falta de
algodn.

IV. Procedimiento:
a) Pedir al paciente que se siente con el brazo elegido apoyado sobre la mesa.
b) Utilizar el algodn para limpiar la zona con alcohol.
c) Rotular el material.
d) Preparar la aguja.
e) Realizar la puncin con pulso seguro en unos 45 en relacin al brazo.
f) Extraer la sangre hasta llenar dos terceras partes del tubo.
g) Retirar el torniquete
h) Situar un algodn encima de la punta de la aguja y retirar la aguja
rpidamente del brazo.

V. Cuestionario:
a) Cul es el beneficio de utilizar alcohol yodado en la asepsia del paciente?

b) Mencione 3 consideraciones pre analticos a tomar en cuenta, en relacin
al estado del paciente, para realizar una toma de muestra sangunea.

GUIA DE PRCTICA N 2.
DETERMINACIN DE PROTENAS TOTALES EN CLARA DE HUEVO Y

PLASMA HUMANO
I. Objetivo:
Determinar la presencia de proteinas y su importancia dentro de los
organismos vivos y su mecanismo de accin a nivel molecular.
El huevo es un alimento de origen animal que proporciona la mejor

protena de todos los alimentos ya que contiene todos los aminocidos
esenciales en las proporciones exactas que necesita el organismo para
el crecimiento ptimo y el mantenimiento del tejido magro,
metablicamente activo.
Los huevos adems de protenas, proporcionan lpidos, hidratos de carbono,
vitaminas y minerales siendo un alimento muy completo que no debe faltar en
una dieta equilibrada. Adems, en cuanto a las caloras del huevo, un huevo
crudo aporta solamente 70 caloras, una cantidad similar a una pieza de fruta.
La principal protena de la clara de huevo es la ovoalbmina, un tipo de
albmina que constituye entre el 60% y el 65% del peso de la clara de huevo.
Adems de tener el mejor perfil proteico que se puede encontrar en un
alimento, la clara contiene vitaminas y minerales y aporta aproximadamente 17
caloras.
FUNDAMENTOS
En la prctica se realizar la determinacin de protenas totales por el mtodo
de biuret y la medicin de albmina mediante la reaccin con el verde de
bromo cresol.
La reaccin debe su nombre al biuret, una molcula formada a partir de dos de
urea
(H2N-CO-NH-CO-NH2), que es la ms sencilla que da positiva esta reaccin.
La presencia de protenas en una mezcla se puede determinar mediante la
reaccin del Biuret. El reactivo de Biuret contiene CuSO4 en solucin acuosa
5

alcalina (de NaOH o KOH). La reaccin se basa en la formacin de un

compuesto de color violeta, debido a la formacin de un complejo de
coordinacin entre los iones Cu2+ y los pares de electrones no compartidos del
nitrgeno que forma parte de los enlaces peptdicos presentando un mximo de
absorcin a 540 nm. Da positiva esta reaccin en todos los compuestos que
tengan dos o ms enlaces peptdicos consecutivos en sus molculas.
En 1965, Rodkey (2) propuso un mtodo de fijacin de colorante para la
albmina en suero, en el cual utiliz 3',3",5', 5"-tetrabromomcresolsulfoneftalena, sal sdica (verde de bromocresol o BCG). Hernndez y
cols., Dow y Pinto y Doumas y cols., han publicado mtodos manuales y
automticos para determinar la albmina en suero con BCG. Este
procedimiento es una modificacin del mtodo de Doumas que presenta una
linealidad amplia.
Albmina + BCG Complejo BCG-albmina
A pH cido, la albmina se fija al BCG produciendo un aumento en la
absorbancia. El incremento en la absorbancia a 630 nm debido a la formacin
del complejo albmina-BCG es directamente proporcional a la concentracin de
albmina de la muestra.
III. Material:
1. Un analizador espectrofotmetro
2. Cubetas de 1 cm de paso de luz, capaz de transmitir 540 y 630 nm
3. Tubos de ensayo del tamao adecuado
4. Pipetas del volmenes adecuados
5. Suero fisiolgico NaCl 0,9g%
6. Un cronmetro
7. Material biolgico: huevos de gallina, codorniz, pato, pavo, etc.,
IV. Procedimiento:
1. Pese el huevo en una balanza.

2. Coloque la clara en una probeta y mida el volumen.

3. Realice una dilucin 1/20 de la clara del huevo usando como diluyente la
solucin NaCl 0,9g% o solucin fisiolgica., mezcle por inversin hasta su total
homogeneidad.
4. En su mesa de trabajo encontrar suero humano diludo 1/10
5. Desarrolle los protocolos para la determinacin de protenas totales y
albmina.
Protocolo para la determinacin de protenas totales.
REACTIVO
Estndar
Blanc
Estnda
MP clara
MP
suero
--- --
0.2ml
------
-------
g/dL
------
------
0.2ml
------
Clara diluida (ml)
------
-------
0.2m
Suero
-------
1ml
diluido
(mL)
Reactivo biuret
1ml
1ml
l
1ml
Mezclar y reposar a temperatura ambiente por 15 minutos, luego llevar a leer a

540 nm, contra blanco de agua destilada.
Protocolo para la determinacin de albmina.

REACIVO
BLANCO
ESTANDAR
MP CLARA
MP SUERO
ESTANDAR..g/DL
---
0.2ML
---
---
CLARA DILUIDA(mL)
---
---
0,2
---
SUERO DILUIDO(mL) ---
---
---
0,2
REACTIVO BGC (mL)
V. Cuestionario:

1. Adems de las protenas, que otros nutrientes ofrece el huevo de gallina.

2. Cul es la razn de porque debe evitarse comer huevos crudos.
3. Si una persona se come en el desayuno huevos revueltos (dos huevos de
gallina por racin), que cantidad de protena estara consumiendo (use los
resultados de su mesa).
4. En el plasma sanguneo, que protenas hay y como se determinan.
5. Que es una disproteinemia ya que enfermedades se asocia.
6. Revisar
http://www.izt.uam.mx/newpage/contactos/anterior/n60ne/proteina.pdf ,
responda:
- Qu es una protena de fase aguda?
- Qu es la PCR (protena C reactiva)?
- Qu relacin tiene la PCR y su relacin con lipoprotenas?
- Cul es el rol de la PCR en el IAM
- Qu otros roles tiene la PCR?
- Cules son los factores que modifican los niveles de PCR?

GUIA DE PRCTICA N 3
FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD ENZIMTICA: ENZIMA,

TEMPERATURA, TIEMPO.
I. Objetivo:
Investigar la cintica enzimtica de una hidrolasa mediante el modelo de
Michaelis-Menten, para evaluar sus parmetros cinticos y contrastar
con los establecidos en la literatura.
II. Fundamento Terico

El trmino cintica enzimtica implica el estudio de la velocidad de una
reaccin catalizada por una enzima y los efectos que pueden tener
factores como los inhibidores. Uno de los principales estudios que se
realizan en una enzima es medir el efecto en la velocidad de la reaccin
cuando se modifican las concentraciones del sustrato y se mantienen
constantes la concentracin de enzima, el pH, la fuerza inica del medio,
la temperatura, entre otros. Se evala la influencia de estos factores en
la reaccin catalizada por enzimas con la finalidad de determinar los
intermediarios en una reaccin y el papel que juegan en la reaccin
enzimtica, es decir, para predecir mecanismos de reaccin. Es esencial
entender estos mecanismos para desarrollar nuevas herramientas
moleculares, por ejemplo, para combatir enfermedades en las que se
conoce a la enzima que la produce. Tambin es usual medir la actividad
enzimtica con diferentes sustratos para entender su especificidad o
bien, medir la actividad de la enzima de diferentes tejidos u organismos
para entender cmo las diferencias en actividad estn relacionadas con
la funcin y/o la fisiologa del organismo del que proceden.
El modelo clsico de Michaelis-Menten para explicar la cintica enzimtica
considera la unin de una enzima (E) con un sustrato (S) para formar un

complejo enzima-sustrato (ES), el cual puede generar el producto (P) ms la

enzima (E) o disociarse para dar la enzima y el sustrato.
Las reacciones catalizadas por enzimas, generalmente presentan una

dependencia hiperblica de la velocidad respecto a la concentracin de
sustrato, distinguindose 3 componentes en la curva. En la primera parte, a
bajas concentraciones de sustrato, la velocidad es proporcional a la
concentracin de sustrato, de tal manera que si se duplica la concentracin de
sustrato, se duplica la velocidad (reaccin de primer orden). La segunda parte
de la curva, a concentraciones intermedias de sustrato, la velocidad se
incrementa menos que en la primera parte con el incremento de la
concentracin, iniciando alrededor de la de la Vmax. La ltima parte de la
curva, a altas concentraciones de sustrato, la velocidad es independiente de la
concentracin de sustrato (reaccin de orden cero), as la velocidad alcanzada
es cercana a la mxima.
La ecuacin de Michaelis- Menten expresa la relacin matemtica de la

hiprbola cuadrtica que existe entre las variables:
10

En la ecuacin de Michaelis-Menten hay dos variables que son la velocidad (v)

y la concentracin de sustrato [S]. La Km y la Vmax son constantes. La Km es
llamada la constante de Michaelis-Menten. El valor de Km de una enzima para
un sustrato especfico es la concentracin del sustrato a la cual la velocidad de
la reaccin es la mitad de la velocidad mxima. La Vmax es la velocidad terica
mxima de la reaccin catalizada por la enzima. A concentraciones muy altas
de sustrato el valor de la velocidad se aproxima al de la velocidad mxima de la
reaccin, pero nunca se llega a sta. Los valores de Km y Vmax son
caractersticos de una enzima, y se conocen
11

Como parmetros cinticos de la enzima. Aunque son constantes, dependen

de las condiciones en las que se lleva a cabo la reaccin, la enzima es una
protena cuya estructura y carga elctrica se modifican cuando los
componentes de la solucin cambian.
Una manera para obtener los valores de Km y Vmax de una enzima es

graficando los valores de velocidad contra la concentracin de sustrato. Este
mtodo tiene la desventaja de que se grafica una curva y no una lnea recta,
por lo que la interpolacin es difcil. Otra manera para obtener los valores de
Km y Vmax es la de utilizar expresiones matemticas que producen una lnea
recta como la de Lineaweaver-Burk, tambin denominada de dobles
recprocos, la cual se utiliza frecuentemente:
Figura 5.2. Representacin de Lineaweaver-Burk de la cintica de MichaelisMenten.
12

III. Materiales y reactivos:
Matraces Erlenmeyer 50 mL
Pipetas graduadas de 1, 10 y 5 mL,
Pipeteros.
Vasos de precipitado 500 mL.
Bureta 25 mL.
Pinzas para bureta.
Soporte universal.
Piseta.
Bao de temperatura controlada.
Urea 0.01 M.
Solucin de ureasa (2.5 mg/mL).
CuCl 2 2%.
HCl 0.01M.
Solucin de fenolftalena 1%.
IV. Procedimiento:
1) Preparar una serie de matraces de acuerdo a lo establecido en la
siguiente tabla:
MATRAZ
UREA 0.01M
AGUA
ml
ml
24
19
10
14
12,5
11.5
15
17.5
6.5
20
22.5
1.5
24
13

la temperatura del mismo.

3) Aadir 1 ml de la solucin de ureasa a cada matraz y esperar que transcurra
la reaccin enzimtica durante 20 minutos.
4) Adicionar 1 ml de CuCl2 2% a cada matraz y agitar vigorosamente para
suspender la actividad de la enzima.
5) Titular el contenido de cada matraz con HCl 0.01N y fenolftalena como
indicador, hasta el vire de rosa a incoloro.
V. Cuestionario
a) Velocidad de reaccin enzimtica en mEq de NH3/minuto.
b) Grfica de Michaelis-Menten.
c) Grfica de Lineweaver-Burk.
d) Valores de Km y Vmax de la enzima.
14

DIGESTIN DEL ALMIDN POR LA AMILASA SALIVAL
I. Objetivo:
Verificar la actividad de la amilasa sobre el almidn a travs de su
producto de hidrlisis.
El almidn es un polisacrido muy abundante en los vegetales en los

cuales se encuentra generalmente en forma de pequeos grnulos
microscpicos de estructura cristalina. El grano de almidn est
formado por amilosa y amilopectina. La amilopectina se encuentra en la
parte exterior del grano, es insoluble en agua y no da coloracin con la
solucin de lugol. La amilosa se encuentra en la parte interna y da
coloracin violeta en presencia de lugol. Por otro lado, la amilasa
cataliza la hidrlisis del almidn, glucgeno y dextrinas superiores en
molculas cada vez ms pequeas, en un proceso progresivo dando
como producto final el disacrido maltosa. La amilasa es una mezcla de
enzimas. En el hombre la encontramos en la boca (amilasa salival) y en
el intestino (amilasa pancretica). La amilasa pancretica se considera
idntica, en su accin, a la amilasa salival. El pH ptimo para la amilasa
salival es de 6.6. Cuando se encuentra en medios con pH ms cidos o
ms alcalinos, la actividad de la enzima disminuye o se inhibe por
completo. La presencia de sales tambin modifica la actividad de esta
enzima. En esta prctica, el avance de la hidrlisis del almidn se
demostrar siguiendo la formacin del complejo con yodo el cual da una
coloracin violeta con los almidones. A medida que se va efectuado la
hidrlisis, el color azul va desapareciendo y aparece un color rojizo
(eritrodextrinas) y posteriormente se observa una coloracin amarilla,
15

debida nicamente a la solucin de yodo, lo que demuestra que el

almidn ha sido hidrolizado hasta maltosa.
III. Materiales y mtodos:
Materiales
Tubos de ensayo.
Bao mara.
Gradilla.
Pipetas de 1 ml.
Dos pipetas de 5 ml
Dos pipetas de 10 ml
Tres pipeta pasteur.
1 pinzas para tubo.
Solucin de lugol.
Solucin de almidn
IV. Procedimiento
a) En primer lugar, colocamos en un tubo de ensayo saliva y le aadimos lugol

para comprobar que no reacciona sin presencia de almidn.
b) A continuacin, aadimos en otro tubo de ensayo almidn y le echamos
lugol para comprobar que reacciona.
c) Seguidamente, en un nuevo tubo de ensayo aadimos almidn con saliva
para que la amilasa acte con el almidn y lo separe en molculas ms
sencillas: glucosa y maltosa.
d) La temperatura adecuada para que se de la reaccin es de 36.5C , ya que
se acelera esta reaccin (temperatura corporal) por lo que lo calentamos hasta
que alcance el calor indicado.
e) Al calentarlos en un vaso precipitado con agua destilada, los tubos deben
ser medidos la temperatura con el termmetro.
f) Lo dejamos reposar para que enfre y, una vez fro, le aadimos lugol para
comprobar que no hay presencia de almidn.
16

V. Cuestionario
a) Explique Cmo demostraste que el almidn fue totalmente transformado en

sus subproductos al reaccionar con la amilasa?
b) Qu son las Unidades (enzimticas), todas son iguales o varan con el tipo
de sustrato que usas?.
c) En el ser humano, Dnde podemos encontrar amilasa?
d) Cul es el pH en el cual la actividad de la amilasa es ptima?.
e) Haga un esquema de la estructura de amilosa y de amilopectina
f) Describa un mtodo para determinar azcares reductores.
17

DETERMINACIN DE GLUCOSA POR MTODO CINTICO
I. Objetivo:
El alumno determinar la concentracin de glucosa total en suero
humano.
La medicin de la Glucosa sangunea es importante en el diagnstico y

tratamiento de la diabetes y otras patologas, tales como hipoglicemia y
problemas renales, entre otras.
III. Fundamento del mtodo:
La glucosa reacciona con el reactivo enzimtico que contiene una mezcla de

las enzimas Glucosa Oxidasa (GOD) y Peroxidasa (POD). En la primera etapa
la Glucosa es oxidada a Ac. Glucnico por la accin de la enzima GOD,
liberndose como producto H2O2, el cual en una reaccin mediada por la
enzima POD, reacciona con el Ac. p-Hidroxibenzoico y 4-Aminoantipirina
produciendose un compuesto coloreado con un mximo de absorcin a 505
nm., en cantidad proporcional a la cantidad de Glucosa presente en la muestra.
D-Glucosa GOD Acido D-Glucnico + H2O2
H2O2 + p-HBA + 4-AAP POD H2O + Complejo Coloreado
18

IV. Reactivos:
Composicin del Reactivo Enzimtico:
Buffer fosfato pH 7.0 75 mM

Glucosa Oxidasa (Aspergilus Niger) 15000 U/l
Peroxidasa 2000 U/l
4-Aminoantipirina 0.5 mM
Acido p-Hidroxibenzoico 10 mM
Azida sdica 0.1 g/dl
Estabilizantes y preservantes no reactivos c.s.
V. Materiales
10 Tubos de vidrio 12x75.

Ligadura.
Algodn.
Alcohol 70.
10 Agujas 21 .
Esparadrapo.
Campo estril.
Reactivo de glucosa.
Micropipeta 200 1000ul.
Micropipeta 5 25 ul.
Bao Mara
Tips azules
Tips amarillos
Espectofotmetro
VI. Procedimiento:
1) Toma de muestra sangunea:

Realizar el procedimiento de toma de muestra segn lo descrito en la
prctica N1.
19

2) Alicuotacin:
Centrifugar la muestra a 3500rpm x 5 minutos, luego de haber
coagulado la muestra sangunea 15 minutos a 37C.
3) Colorimetra:
Unidades
Blanco
Calibrador
Muestra
Muestra
ml
------
0.01
Calibrador
ml
0.01
------
Reactivo
ml
1.00
1.0
1.0
Mezclar e incubar 5 minutos a 37C o temperatura ambiente (20 - 25C). Leer

las absorbancias ajustando a cero el espectrofotmetro con el blanco de
reactivo. El color resultante es estable por lo menos 30 minutos.
El valor de la glucosa se obtiene utilizando la siguiente formula:
Factor=Concentracin Calibrador/Abs.calibrador
Glucosa (mg/dl) = Factor x Abs. Muestra
VII. Cuestionario
a) Cul es la importancia de la medicin de la glucosa en un paciente

diabtico?
b) Cules son los interferentes pre-analticos que deben de ser tomados en
cuenta en la medicin de glucosa?
c) Cules son los valores de referencia de la glucosa?
20

RECONOCIMIENTO DE LPIDOS
.
I.- Objetivo:
Identificar mediante anlisis bioqumicos la presencia de lpidos en las

muestras problemas
Poner de manifiesto ciertas propiedades de los lpidos, algunas de las
cuales pueden servirnos para su identificacin.
II. Fundamento terico
a) Saponificacin:
La saponificacin es una reaccin qumica entre un cido graso (o un lpido
saponificable, portador de residuos de cidos grasos) y una base o lcali, en la
que se obtiene como principal producto la sal de dicho cido y de dicha base.
Estos compuestos tienen la particularidad de ser anfipticos, es decir tienen
una parte polar y otra apolar (o no polar), con lo cual pueden interactuar con
sustancias de propiedades dispares. Por ejemplo, los jabones son sales de
cidos grasos y metales alcalinos que se obtienen mediante este proceso.
El mtodo de saponificacin en el aspecto industrial consiste en hervir la grasa
en grandes calderas, aadiendo lentamente hidrxido de sodio (NaOH),
agitndose continuamente la mezcla hasta que comienza esta a ponerse
pastosa.
Los productos son el jabn y la glicerina:
b) Tincin:
Los lpidos se colorean selectivamente de rojo - anaranjado con el colorante
21

Sudn III. El Sudn III es un tinte diazo de tipo lisocromo. Se usa al 0.15%, en
alcohol etlico.
c) Solubilidad:
Los lpidos son insolubles en agua. Cuando se agitan fuertemente en ella se
dividen en pequesimas gotas formando una emulsin de aspecto lechoso,
que es transitoria, pues desaparece en reposo por reagrupacin de las gotitas
de grasa en una capa que, por superior densidad, se sita sobre el agua. Por el
contrario, las grasas son solubles en disolventes orgnicos, como el ter,
cloroformo, acetona, benceno, etc.
III. Materiales y Reactivos
3.1 Materiales
Tinta china roja.
Aceite de oliva.
3.2 Material de vidrio
Tubos de ensayo.
Gradilla.
Varillas de vidrio.
Mechero.
Cocina elctrica.
Rejilla de asbesto por cocina.
Vasos de precipitado de 150 250 ml.
Pipetas.
3.3 Reactivos
Solucin de NaOH al 20%.
Solucin de Sudn III.
Eter.
22

Cloroformo.
Acetona
IV. Procedimiento
a) Saponificacin:
1. Colocar en un tubo de ensayo 2ml de aceite y 2ml de NaOH al 20%.
2. Agitar enrgicamente y colocar el tubo al bao Mara de 20 a 30 minutos.
3. Pasado este tiempo, se pueden observar en el tubo 3 fases: una inferior
clara que contiene la solucin de sosa sobrante junto con la glicerina formada,
otra intermedia semislida que es el jabn formado y una superior lipdica de
aceite inalterado.
23

Nota: Cuando ya se ha visto como se forma el jabn, se puede ir echando en

un vaso de precipitado el contenido de los tubos de ensayo, se remueve bien y
se deja calentar hasta que se haga un buen trozo de jabn.
b) Tincin:
1. Disponer en una gradilla 2 tubos de ensayo colocando en ambos 2ml de
aceite.
2. Aadir a uno de los tubos 4-5 gotas de solucin alcohlica de Sudn III.
3. Al otro tubo aadir 4-5 gotas de tinta roja.
4. Agitar ambos tubos y dejar reposar.
5. Observar los resultados: en el tubo con Sudn III todo el aceite tiene que
aparecer teido, mientras que en el tubo con tinta, sta se ir al fondo y el
aceite no estar teido.
24

c) Solubilidad.
1. Poner 2ml de aceite en dos tubos de ensayo.
2. Aadir a uno de ellos 2ml de agua y al otro 2ml de ter u otro disolvente
orgnico.
3. Agitar fuertemente ambos tubos y dejar reposar.
4. Observar los resultados: Se ver cmo el aceite se ha disuelto en el ter y,
en cambio no lo hace en el agua y el aceite subir debido a su menor densidad.
25

V. Cuestionario
1. Por qu en la saponificacin la glicerina aparece en la fase acuosa?
2. Cul es el fundamento terico del sudan III, a lo que se refiere a la tincin
de grasas?
3. Explique el principio de entropa y su relacin con la insolubilidad de las
grasas en el agua.
26

GUIA DE PRCTICA N 7
DETERMINACIN DE COLESTEROL
I. Objetivo:
El alumno determinar la concentracin de colesterol total en suero humano.
El colesterol se encuentra presente en la sangre, bilis y tejido cerebral. Es

precursor de los cidos biliares, esteroides, y vitamina D. Su determinacin
contribuye al diagnstico y clasificacin de las dislipidemias.
III. Fundamento del Mtodo:
El colesterol se determina por accin de las enzimas Colesterol ester

hidrolasa y Colesterol oxidasa. La primera libera el colesterol de los steres de
colesterol, y la segunda oxida el colesterol libre producindose perxido de
hidrgeno, el cual en presencia de la enzima peroxidasa reacciona con el
sistema cromognico dando origen a un compuesto coloreado que absorbe a
505 nm.
Colesterol ester CEH Colesterol + cidos grasos
Colesterol + O2 CHOD Colest-4-en-3-ona + H2O2
2H2O2 + 4-AAP +p-HBA PAP Comp. Coloreado + 4H2O
IV. Reactivos:
Composicin del Reactivo Enzimtico:

Buffer Pipes pH 7.3 50 mM
Colesterol ester hidrolasa >150 U/l
27

Colesterol oxidasa (recombinante) >100 U/l

Peroxidasa >1000 U/l
4-Aminoantipirina 0.4 mM
Acido p-hidroxibenzoico 10 mM
Azida sdica 0.1 g/dL
Estabilizantes y preservantes no reactivos c.s.
V. Materiales

Ligadura.
Algodn.
Alcohol 70.
10 Agujas 21 .
Esparadrapo.
Campo estril.
Reactivo de colesterol.
Bao Mara
Tips azules
Tips amarillos
Espectofotmetro
VI. Procedimiento

prctica N1.
2) Alicuotacin:
28

3) Colorimetra
Unidades
Blanco
Calibrador
Muestra
Muestra
ml
------
0.01
Calibrador
ml
0.01
------
Reactivo
ml
1.00
1.0
1.0

El valor del colesterol se obtiene utilizando la siguiente frmula:
Colesterol (mg/dl) = Factor x Abs. Muestra
VII. Cuestionario
a) Indique la importancia del pH en la medicin de colesterol en suero?
cuenta en la medicin de colesterol?
c) Cules son los valores de referencia del colesterol?
29

GUIA DE PRCTICA N 8
DETERMINACIN DE LIPOPROTEINAS DE BAJA DENSIDAD (LDL)
I. Objetivo:
El alumno determinar la concentracin de colesterol total en suero

humano.
El alumno determinar la concentracin de colesterol LDL en suero
humano.
El colesterol se encuentra presente en la sangre, bilis y tejido cerebral.

Es precursor de los cidos biliares, esteroides, y vitamina D. El
colesterol es transportado por tres lipoprotenas, la lipoprotena de alta
densidad (HDL), la de baja densidad (LDL), y la de muy baja densidad
(VLDL). Castelli y colaboradores han reportado que hay una estrecha
relacin entre los niveles de LDL-Colesterol y el riesgo de enfermedad
coronaria. La evaluacin de los niveles de LDL-Colesterol provee una
valiosa herramienta para la prediccin de enfermedad coronaria, y la
clasificacin de las dislipidemias.
El LDL-Colesterol es obtenido precipitndolo selectivamente mediante el uso

de heparina, en una solucin con el punto isoelctrico adecuado, quedando en
solucin los colesteroles HDL y VLDL. El LDL-Colesterol precipitado se
determina obteniendo el diferencial entre el Colesterol Total y los colesteroles
HDL y VLDL que permanecen en solucin por accin de las enzimas Colesterol
ester hidrolasa y Colesterol oxidasa que actan sobre estos ltimos. La primera
enzima libera el colesterol de los steres de colesterol, y la segunda oxida el
colesterol libre producindose perxido de hidrgeno, el cual en presencia de la
30

enzima peroxidasa reacciona con el sistema cromognico dando origen a un

compuesto coloreado que absorbe a 505 nm.
IV. Materiales y Reactivos
Suero humano.
Espectrofotmetro.
Bao Mara.
Micropipeta 10 uL / 1000 uL.
Tubo de vidrio 12x75
Tips
Gradilla
V. Procedimiento

prctica N1.
2) Alicuotacin:
3) Precipitacin:
Agregar en un tubo de centrfuga 0,5 ml de reactivo precipitante y 0,05
ml. de muestra, mezclar y esperar 10 minutos a temperatura ambiente
(15 a 25C.). Centrifugar 15 minutos a 3500 r.p.m. Extraer el
sobrenadante dentro de los 10 minutos posteriores a la precipitacin.
4) Colorimetra:
Unidades
Blanco
31
Calibrador
Muestra

Muestra
ml
------
0.01
Calibrador
ml
0.01
------
Reactivo
ml
1.00
1.0
1.0

El valor del colesterol - LDL se obtiene utilizando la siguiente frmula:
Factor = Concentracin Calibrador/Abs.calibrador
Colesterol sobrenadante (mg/dl) = Factor x Abs. Muestra

LDL (mg/dl) = C.T Colesterol sobrenadante
VI. Cuestionario
a) Cules son los inconvenientes, que encontr en la prctica, que dificultan la
correcta valorizacin del colesterol LDL?
b) Mencione 3 mtodos que determinan la concentracin de colesterol LDL.
32

GUIA DE PRCTICA N 9
DETERMINACIN DE PROTENAS EN TEJIDO HEPTICO
I. Objetivo:
Estudiar la precipitacin de protenas por solventes orgnicos.
En las cadenas polipeptdicas de las protenas los grupos amino y

carboxilo de los aminocidos, salvo los terminales, se encuentran
constituyendo los enlaces peptdicos. De este modo los grupos que
pueden cargarse elctricamente y actuar como cidos dbiles,
confirindoles a las protenas la capacidad de actuar como
amortiguadores; son:(a) Carboxilos libres de los aminocidos di
carboxlicos, cuyos pKa fluctan alrededor de 4(b) psilon amino de la
lisina, guanidino de la arginina, fenol de la tirosina, sulfhdrico dela
cistena, cuyos pKa son superiores a 9.(c) Imidazol de la histidina cuyo
pKa en las protenas es de 5,6 a 7.Las sales neutras en altas
concentraciones disminuye la solubilidad de las protenas, lo cual se
debe probablemente a una deshidratacin de las molculas proteicas. El
solvente, en estos casos, se organiza alrededor de los iones de la sal,
de modo que ste disminuye alrededor de las molculas de protenas,
las que se asocian en una fase slida. La fuerza inica a la cual
precipitan las protenas es caracterstica para cada una de ellas, a
iguales condiciones de pH y temperatura. Esta propiedad permite
separar mezclas de protenas. El agua tiene una constante dielctrica
relativamente alta (80.36 a 20C), por lo cual en solucin acuosa
disminuye la interaccin entre las molculas proteicas (debido a sus
grupos cargados), mientras que aumenta la interaccin entre las
protenas y el agua. Esto favorece la solubilidad de las protenas. Los
solvente orgnicos tales como el Etanol, metanol y acetona tienen
33

constantes dielctricas bajas (25; 32,4 y 19,6 respectivamente a20C),

de modo que al agregarlos a una solucin acuosa de protenas baja la
constante dielctrica del medio, y adems disminuye la concentracin
efectiva (actividad) del agua; lo que favorece la interaccin de los iones
proteicos entre s y por lo tanto su precipitacin.
III. Materiales y reactivos:
Bao Mara
Termmetro
Tubos de Ensayo
Pinza de madera
Vasos de precipitacin 250 ml
Embudo
NaCl 0,15 M
Acetona
Casena
4. Procedimiento:
a) Precipitacin por solventes orgnicas
Tome 2 tubos de prueba y agregue a cada uno 1 ml de solucin de

casena.
Agregue 3 ml de acetona, dejando un tubo a temperatura ambiente y el

otro en refrigeracin por 30 minutos. Anotar sus observaciones.
Diluir 1:4 cada muestra con solucin de cloruro de sodio 0,15M, tenerlas
a temperatura ambiente unos minutos. Anotar sus observaciones.
34

5. Cuestionario:
a) Qu son las protenas, cmo se clasifican?

b) Qu es punto isoelctrico?
c) Qu es pKa?
d) Qu es una constante dielctrica?
35

GUIA DE PRCTICA N 10
DETERMINACIN DE PROTENAS EN FLUIDOS
Objetivo:
El alumno tendr la capacidad de determinar la concentracin de

protenas humanas en suero por el mtodo de Biuret.
La concentracin de protena total es muy til en el monitoreo de

cambios que se producen en ella como consecuencia de varias
patologas. Niveles elevados se encuentran en procesos de
deshidratacin, mieloma mltiple, nefropatas crnicas, y niveles bajos
en algunas patologas renales.

Para la determinacin de niveles de protena total se utilizan variados mtodos,
entre ellos la densidad, el ndice de refraccin, absorbancia de la muestra en el
rango ultra-violeta, y por la tcnica de Folin-Ciocalteau. Originalmente se meda
por el mtodo de Kjeldahl, que actualmente se utiliza como mtodo de
referencia. El mtodo utilizado se basa en la reaccin de biuret, en la cual los
enlaces peptdicos reaccionan en medio alcalino con sulfato de cobre para
formar un complejo coloreado azul-violeta. El color formado se mide
colorimtricamente, siendo proporcional a la cantidad de protena presente en
la muestra.
IV. Materiales y reactivos:
Reactivo Biuret
Tubos de vidrio 12x75.
Ligadura.
36

Algodn.
Alcohol 70.
10 Agujas 21 .
Esparadrapo.
Campo estril.
Reactivo de urea.
Bao Mara
Tips azules
Tips amarillos
Espectofotmetro
V. Procedimiento:
Unidades
Blanco
Calibrador
Muestra
Muestra
ml
------
0.020
Calibrador
ml
0.020
------
Reactivo
ml
1.00
1.0
1.0
Mezclar e incubar 5 minutos a 37C o temperatura ambiente (20 - 25C).

Leer las absorbanci s a 540nm, ajustando a cero el espectrofotmetro con el
blanco de reactivo. El color resultante es estable por lo menos 30 minutos.
El valor de las protenas totales se obtiene utilizando la siguiente frmula:

37

VI. Cuestionario:
a) Indique en qu condiciones clnicas las protenas totales se encuentran
disminuidas?
cuenta en la medicin de protenas totales?
c) Cules son los valores de referencia?
38

DETERMINACIN DE UREA
I. Objetivo:
El alumno tendr la capacidad de determinar la concentracin de urea

en suero por el mtodo de Faucet y Scott.
II. Fundamento terico :
La urea es el producto final mayoritario del metabolismo del nitrgeno

proteico en los seres humanos. Constituye la fraccin ms abundante
del nitrgeno no proteico. La urea se produce en el hgado y es
excretada por la orina. Su elevacin es producto de trastornos en la
funcin renal o heptica, problemas dietticos, diabetes y otros.

La urea presente en la muestra, es desdoblada a amonio por accin de la
enzima ureasa, segn la proposicin de Faucet y Scott.
(NH2)2CO + 2 H2O UREASA 2 NH3 + CO2 + H2O
El amonio producido reacciona con salicilato e hipoclorito en ambiente alcalino,

formndose un complejo de color verde. La intensidad del color producido es
directamente proporcional a la cantidad de urea presente en la muestra, y su
absorbancia se lee a 600 nm. (580-620).
IV. Materiales y Reactivos:

Ligadura.
39

Algodn.
Alcohol 70.
10 Agujas 21 .
Esparadrapo.
Campo esteril.
Reactivo de urea.
Bao Mara
Tips azules
Tips amarillos
Espectofotmetro
V. Procedimiento
Unidades
Blanco
Calibrador
Muestra
Muestra
ml
------
0.01
Calibrador
ml
0.01
------
Reactivo
ml
1.00
1.0
1.0
Incubar 5 minutos a temperatura ambiente (20 25C), o 3 minutos a 37C.

Agregar a cada tubo:
Reactivo 2
Mezclar e incubar 5 minutos a 37C o 10 minutos a temperatura ambiente (20 25C). Leer las absorbancias ajustando a cero el espectrofotmetro con el
40

blanco de reactivo. El color resultante es estable por lo menos 1 hora.
El valor de la urea se obtiene utilizando la siguiente frmula:
VI. Cuestionario
a) Indique la importancia de la medicin de la urea en suero?

d) Cules son los interferentes pre-analticos que deben de ser tomados en
cuenta en la medicin de urea?
e) Cules son los valores de referencia?
41

DETERMINACIN DE CIDO RICO
I. Objetivo:
El alumno tendr la capacidad de determinar la concentracin de protenas

humanas en suero por el mtodo de Biuret.
El cido rico es producto del metabolismo de las purinas, cidos nucleicos y

nucleoprotenas, valores elevados indican patologas que afectan dichos
metabolismos, algunas de origen gentico. Valores elevados se observan en
pacientes con gota, falla renal, arteriosclerosis, diabetes, hipotiroidismo, etc. Su
disminucin se encuentra asociada a la enfermedad de Wilson.
III. Fundamento del Mtodo:
El cido rico es oxidado por la enzima especfica uricasa generndose

alantona y H2O2, el cual en una reaccin mediada por la enzima POD,
reacciona con el Ac. 3-5-Dicloro-2-Hidroxi-Bencensulfnico y 4-AAP
producindose un compuesto coloreado con un mximo de absorcin a 520
nm., en cantidad proporcional a la cantidad de cido rico presente en la
muestra.
cido rico UOD Alantona + H2O2
H2O2 + DCBS + 4-AAP POD H2O + Comp. Coloreado 5
42

IV. Materiales y reactivos

Ligadura.
Algodn.
Alcohol 70.
10 Agujas 21 .
Esparadrapo.
Campo esteril.
Reactivo de cido urico.
Bao Mara
Tips azules
Tips amarillos
Espectofotmetro
V. Procedimiento
Unidades
Blanco
Calibrador
Muestra
Muestra
ml
------
0.025
Calibrador
ml
0.025
------
Reactivo
ml
1.00
1.0
1.0
Mezclar e incubar 5 minutos a 37C o temperatura ambiente (20 - 25C).

Leer las absorbancias a 540nm, ajustando a cero el espectrofotmetro con el
blanco de reactivo. El color resultante es estable por lo menos 30 minutos.
43

El valor del cido rico se obtiene utilizando la siguiente frmula:
VI. Cuestionario
a) Indique en qu condiciones clnicas el cido rico es de importancia

clnica?
cuenta en la medicin de cido rico?
c) Cules son los valores de referencia?
44

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