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Facultad de Ciencias

Bioqumica y Biologa Molecular

RECOMENDACIONES TILES

1. La asistencia a las prcticas es obligatoria. La falta a alguna sesin de prcticas no


justificada por escrito supondr no obtener calificacin de esa parte de la evaluacin
continua.
2. Es obligatoria la utilizacin de gafas de seguridad en el laboratorio, por lo que cada
persona debe tener las suyas.
3. Es obligatorio el uso de bata blanca para la realizacin de las prcticas.
4. No se debe trabajar con productos inflamables cerca de mecheros encendidos.
5. En el laboratorio no se podrn tomar bebidas ni comidas.
6. Tener cuidado con productos y disolventes txicos. Pipetear siempre con propipeta.
7. Se debe llevar al laboratorio, adems de los correspondientes guiones de prcticas,
una libreta para anotar los clculos, resultados y las observaciones que se van
obteniendo a lo largo de las prcticas. Tambin debe comprarse cada uno su material
bsico para trabajar: un marcador de vidrio, una esptula, y unas tijeras pequeas, de
los cuales se debe responsabilizar.
8. Hay muchos productos que no se deben echar por el fregadero (como el etanol,
azida, cromato potsico, fenol, ninhidrina, cido sulfrico...); en estos casos se
proporcionarn bidones o recipientes donde se almacenarn para su posterior
eliminacin. SE DEBE PREGUNTAR ANTES DE TIRAR CUALQUIER PRODUCTO.
9. Antes de comenzar a realizar una prctica se debe revisar todo el material y
reactivos necesarios para la misma, indicando cualquier anomala.
10. Limpiar el material antes de su uso, y a continuacin enjuagarlo con agua
destilada. Al terminar la sesin de prcticas se dejar todo en perfecto estado de
limpieza y orden. Al final de cada sesin prctica se revisar dicho estado.
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11. Como medida de seguridad controlar las llaves del mechero antes de abrir la espita
del gas.
12. Si se necesita calentar el contenido de un tubo de ensayo directamente sobre el
mechero se har con el tubo algo inclinado, agitando y con la boca del tubo dirigida
hacia un lugar donde no exista ninguna persona.
13. El material de uso comn, as como los frascos de reactivos generales se deben
colocar en su sitio inmediatamente despus de usarlos.
14. No se deben pipetear los reactivos directamente de las botellas de uso comn,
para evitar contaminaciones. Se pondr una pequea cantidad en un vaso y de ah se
pipetear.
15. Los reactivos que se hayan sacado del frasco (o botella) y no se hayan usado no
deben verterse de nuevo en el frasco, puesto que todo el contenido puede
contaminarse. Por tanto, las cantidades de reactivos que se saquen de los frascos no
deben exceder de las necesarias para la realizacin de las experiencias.
16. Cuando se tenga que diluir un cido, aadir siempre el cido sobre el agua.
17. Las reacciones en las que haya produccin de cualquier gas nocivo se llevarn a
cabo siempre en la vitrina con el sistema de aspiracin en funcionamiento. La
atmsfera del laboratorio ha de mantenerse lo ms limpia posible.

SMBOLOS DE PELIGROSIDAD

SUSTANCIAS INFLAMABLES
Se utiliza para sustancias autoinflamables, gases fcilmente
inflamables y sustancias que en contacto con el agua
desprenden gases inflamables.

SUSTANCIAS TXICAS
Productos que inhalados, ingeridos o en contacto con la piel
provocan lesiones e incluso la muerte.

SUSTANCIAS CORROSIVAS
El contacto con estos productos destruye tejidos vivos y otros
materiales.

SUSTANCIAS IRRITANTES O NOCIVAS


Irritantes: Actan sobre la piel, los ojos y las vas respiratorias.
Nocivas: La absorcin de estos productos da lugar a lesiones de
menor gravedad.

SUSTANCIAS COMBURENTES
Productos que en contacto con otros particularmente con los
inflamables, originan una reaccin altamente exotrmica.

SUSTANCIAS EXPLOSIVAS
Productos que son ms sensibles a los golpes que el
dinitrobenceno o que pueden explotar bajo el efecto de una llama
o friccin.

CROMATOGRAFA POR FILTRACIN EN GEL. SEPARACIN DE HEMOGLOBINA Y


ALANINA EN SEPHADEX G-25

1. FUNDAMENTO.
La tcnica implica la separacin de molculas de diferente tamao pasndolas a
travs de una columna de gel. El polisacrido dextrano est entrecruzado dando
pequeas porciones de un polmero hidroflico e insoluble que se hincha en agua para
formar un gel. Las molculas pequeas pueden penetrar en el gel, pero las grandes son
excluidas de la red entrecruzada. Primero, la mezcla de molculas grandes y pequeas
se coloca sobre la superficie libre superior del gel. A medida que la muestra desciende
en la columna, las molculas pequeas difunden dentro del gel teniendo que recorrer
un camino ms largo mientras que las molculas grandes salen de la columna primero
y por ltimo vienen las molculas ms pequeas.
Se distinguen unas constantes que son funcin del tipo y tamao del lecho del
gel. Estas constantes son:
Ve = Volumen de elucin de la sustancia, en mL, donde sta se encuentra en
mayor concentracin. Volumen de disolvente necesario para eluir las molculas de
inters.
Vo = Volumen muerto. Es el volumen de elucin de una sustancia que es
excluida del gel, y coincide con el volumen de lquido que ocupa los intersticios que
hay entre los granos de gel en el lecho.
Vt = Es el volumen total del lecho del gel. El volumen de la columna de gel. Para
calcularlo es necesario conocer la altura y seccin de la misma.
Kav = (Ve - Vo) / (Vt - Vo)
Kav es el coeficiente de particin entre la fase lquida y la fase gel. Esta variable
es independiente de la compactacin del lecho de gel y existe una relacin
prcticamente lineal entre los valores de Kav para diversas sustancias y los respectivos
logaritmos de sus pesos moleculares, por lo cual, conociendo Kav se puede tener un
conocimiento aproximado del peso molecular.
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El grado de entrecruzamiento va a determinar el tamao poro y ste va a


determinar el rango de fraccionamiento de tamaos moleculares. Esta resina permite
separar protenas globulares cuyo peso molecular est entre 1000 y 5000 Da. Esto
ltimo quiere decir que molculas mayores de 5000 Da sern incapaces de entrar en el
poro de la matriz.
En este experimento se observa la separacin de dos molculas basadas en la
diferencia de tamao. Inicialmente se deja pasar una mezcla de azul dextrano y
cromato potsico. El azul dextrano tiene un peso molecular de 2x106 Da, mayor que el
rango de fraccionamiento del Sephadex, con lo que no se retendr y eluir
inicialmente al ser incapaz de entrar por el poro de la matriz. El cromato potsico tiene
un peso molecular de 194 Da, menor que el rango de fraccionamiento del Sephadex,
con lo cual se quedar retenido y eluir conforme vaya pasando el eluyente.
A continuacin se introduce una mezcla de hemoglobina con Pm de 66000 Da, y
de alanina con Pm de 89 Da. Como el lmite de fraccionamiento est entre 1000 y 5000
para pptidos y protenas en este gel, la hemoglobina no se retendr y saldr con el
volumen muerto de la columna. En cambio, la alanina s se retiene, eluyendo
prcticamente al mismo volumen que el cromato.
Debido a que el aminocido es incoloro, para observar mejor su presencia se
realiza la prueba de la ninhidrina. La ninhidrina es un agente oxidante poderoso
que reacciona con todos los -aminocidos a un pH entre 4 y 8, dando lugar a la
formacin de amoniaco y CO2, reducindose la ninhidrina a hidrindantina. Este
compuesto reacciona, a su vez, con el amoniaco y la ninhidrina para dar un compuesto
doble de adicin de intenso color prpura-azulado. Esta reaccin es muy sensible.

2. MATERIAL.
* Columna cromatogrfica con Sephadex G-25
* Erlenmeyer de 250 mL
* Pipetas Pasteur
* 2 Pipetas de 0.5 mL
* Probeta de 25 mL
* Tubos de ensayo pequeos y una gradilla
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* Colormetro o espectrofotmetro
* Bao de agua hirviendo con gradilla incorporada

3. DISOLUCIONES.
* Hemoglobina 2 mg/mL
* Alanina 6 mg/mL
* Ninhidrina 5 mg/mL
* Cromato potsico 2 mg/mL
* Azul dextrano 2 mg/mL
* NaCl 10 g/L

4. DESARROLLO.
Dejad la disolucin de NaCl que est en el interior de la columna a nivel del
lmite del gel, y en este momento incorporad una mezcla (que habris preparado en un
tubo de ensayo) de 0.5 mL de cromato potsico y 0.5 mL de azul dextrano. Recoged
fracciones de unos 3 mL por tubo. En el momento que esta disolucin ha llegado al
nivel del gel se aade disolucin de NaCl con la pipeta Pasteur y luego ya se puede
conectar el cable al erlenmeyer que contiene NaCl. La velocidad de flujo debe ser
lenta. La cromatografa habr terminado cuando haya eludo todo el cromato.
Entonces se pasa a medir la absorbancia de todos estos tubos, los iniciales (azules) a
621 nm, y los siguientes (amarillos) a 470 nm. Se utiliza el tubo n 1 como blanco, o
bien disolucin de NaCl.
NOTA: LAS COLUMNAS SIEMPRE DEBEN TENER LQUIDO SOBRE EL LECHO DEL GEL.
A continuacin se prepara, en un tubo de ensayo, una mezcla con 0.5 mL de
disolucin de hemoglobina y 0.5 mL de disolucin de alanina. Se deja otra vez el nivel
de lquido al nivel del gel y entonces se adiciona esta mezcla con el cuentagotas
operando de igual forma que antes. La cromatografa podr haber terminado cuando
se tengan tantos tubos como en el paso anterior.
Se mide la absorbancia de estos tubos a 430 nm (el blanco tambin es el n 1
de esta etapa, o NaCl) hasta que el valor vuelva a ser 0 (entonces se deja de medir);
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esos sern los que contengan la hemoglobina. A todos los tubos que van a
continuacin se les hace el ensayo de la ninhidrina, puesto que ser donde est
contenida la alanina.
Para ello, se aaden 10 gotas de este reactivo a cada tubo, se agita bien y se
incuba un tiempo indeterminado en un bao con agua hirviendo hasta que algunos se
tian de azul. Pasado este tiempo se dejan enfriar y donde est el aminocido habr
aparecido coloracin azulada. Entonces se mide la absorbancia de todos estos tubos a
540 nm.

5. CLCULO DE LOS VOLMENES DE ELUCIN.


Para medir los volmenes se hace lo siguiente:
5.1. Se cuenta el volumen de todos aquellos tubos del inicio que no tienen color = A.
5.2. Se cuenta el volumen de todos los tubos que presentan el mismo color = B.
Los tubos que no tienen color y que estn detrs de los denominados como B no se
tienen en cuenta.
5.3. Para el clculo del volumen de elucin supondremos que el proceso de elucin es
simtrico, de tal forma que el mximo de concentracin de la sustancia en el eludo va
a estar en la mitad del volumen que contiene dicha sustancia coloreada.
Con esta suposicin, el volumen de elucin para cada sustancia va a ser:
Abs

Ve = A + 1/2 B
Ve

6. CUESTIONES.
1. Haced los cromatogramas de los resultados (volumen en abscisas y
absorbancias en ordenadas).
2. Mide los volmenes de elucin de cada sustancia y calcula los distintos
valores de Kav (Dimetro de la columna de gel = 1.5 cm. Hay que medir la
altura de la columna de gel)

3. En funcin de la masa molecular, qu protenas eluyen en ltimo lugar de la


columna, las ms grandes o las ms pequeas?
4. Define brevemente los siguientes conceptos:
a. Coeficiente de particin.

b. Volumen muerto.

c. Volumen de elucin.

d. Volumen total.

5. Explica qu es la fase mvil y la fase estacionaria en una cromatografa.


6. Cul es el volumen muerto de esta columna?
7. Por qu se emplea ninhidrina en la prctica de filtracin el gel?
8. Para qu sirve el azul dextrano en la prctica de filtracin en gel?
9. Para qu sirve el cromato potsico en la prctica de filtracin en gel?
10. Qu relacin hay entre las masas moleculares de las distintas sustancias y
sus coeficientes de particin?

AISLAMIENTO DE CASENA Y LACTOSA DE LA LECHE

1. FUNDAMENTO.
La casena es la protena principal encontrada en la leche. No es un compuesto
simple sino una mezcla heterognea de protenas que contienen fsforo; es una
fosfoprotena que existe en cuatro formas: alfa, beta, gamma y kappa casena, cada
una con diferente composicin.
Como muchas otras protenas derivadas de fuentes animales, por ej. carne
(miosina) y huevos (albmina) es una protena adecuada nutricionalmente. Tales
protenas contienen todos los aminocidos esenciales requeridos para un crecimiento
y desarrollo normal.
La mayora de las protenas muestran una solubilidad mnima en su punto
isoelctrico y este principio se usa para separar la casena ajustando el pH de la leche a
4.8, su punto isoelctrico. La casena es tambin insoluble en alcohol, lo que permite
extraer la grasa de las preparaciones.

2. MATERIAL.
* 2 vasos de precipitados de 250 mL

* Pipeta de 2 mL

* 1 probeta de 100 mL, otra de 50 mL

* Embudo Buchner

y otra de 25 mL

* Quitasatos

* Varilla de vidrio

* Papel de aluminio

* Bao termosttico a 40 C

* Gasa

* Papel indicador

* Placa calefactora

* Embudo y trpode

3. DISOLUCIONES o REACTIVOS.
* Leche

* Carbonato clcico

* cido actico glacial

* Carbn activo en polvo

* Etanol del 96%


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4. PREPARACIN DE DISOLUCIONES.
* Acido actico al 10 %: 18 mL de agua destilada y 2 mL de cido actico glacial.

5. DESARROLLO.
5.1. AISLAMIENTO DE CASENA:
En un vaso de precipitados de 250 mL se ponen 100 mL de leche y se calientan
a 40 C aproximadamente. Se aade a continuacin cido actico al 10 %, gota a gota,
sin agitar, removiendo un poco el vaso para mezclar, pero lentamente. El pH final de la
mezcla debe ser aproximadamente 4.8 y se debe verificar con papel indicador. Se
produce un precipitado de casena blanco y floculoso. Cuando ya ha terminado este
proceso se enfra la suspensin a temperatura ambiente y se deja reposar 5 minutos
antes de filtrarla a travs de gasa (tres capas). Conservad aparte el suero de leche
filtrado.
Se lava el precipitado con un poco de agua destilada y se suspende en 30 mL de
etanol al 96 %. Se filtra la suspensin a travs de papel de filtro sobre un embudo
Buchner colocado sobre quitasatos haciendo vacio. Se lava el precipitado anterior con
otros 25 mL de etanol y se seca manteniendo el vaco.
Se extrae con una esptula el polvo blanco formado y se coloca en un trozo de
papel de aluminio para permitir la evaporacin total del disolvente (si es posible,
dejadlo unos minutos en la estufa).

5.2. AISLAMIENTO DE LACTOSA:


Al suero de leche filtrado, libre de casena, se le aaden 3 g de carbonato
clcico en polvo fino, agitando fuertemente para conseguir una buena suspensin; se
sigue agitando, manteniendo el recipiente en un bao de agua hirviendo durante unos
10 - 15 minutos, con el fin de acabar de desproteinizar el suero. El lquido an caliente
se filtra usando un filtro de papel plegado y un embudo, recogindolo en un vaso de
vidrio de 250 mL, y a continuacin se somete a ebullicin sobre una placa calefactora
(es conveniente introducir unas cuantas perlas de vidrio para conseguir una
ebullicin ms homognea). Se debe agitar fuertemente con una varilla limpia de
vidrio para evitar la formacin de espuma. Se debe tener la precaucin de llevar las
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gafas de proteccin en este paso. Se contina la ebullicin hasta que queden apenas
unos 20 - 25 mL de lquido. Tras retirar el vaso de la placa (TOMAR PRECAUCIONES
PARA NO QUEMARSE),

se le aaden 100 mL de etanol al 96% al jarabe an

caliente y, aproximadamente, 1 g de carbn activo en polvo, agitando bien para


conseguir una suspensin homognea. Luego se filtra a travs de doble filtro de papel
plegado, recogiendo el filtrado en un vaso de vidrio limpio (es fundamental que el
lquido siga estando caliente, ya que si no, la lactosa precipitara antes de tiempo). El
filtrado se guarda durante varios das en el congelador para permitir la lenta
cristalizacin de la lactosa. Los cristales de lactosa se separan despus por filtrado y,
tras secar al aire o en la estufa a unos 60 C, la lactosa obtenida se pesa para calcular el
rendimiento. Hay que tener en cuenta que la lactosa obtenida es lactosa monohidrato
(Pm = 360.42 Da), por lo que el contenido de agua en la molcula debe ser empleado
en el momento de calcular la riqueza del producto obtenido.

6. CUESTIONES.
1. Pesad la casena obtenida y calculad el rendimiento obtenido en su
extraccin.
2. Por qu se utiliza preferentemente leche desnatada?
3. Pesad la lactosa obtenida y calculad el rendimiento.
4. Por qu se debe aadir el carbn activo?
5. Al separar la casena de la lactosa, por qu se aade carbonato clcico en
polvo a la lactosa?
6. Qu efecto tiene el etanol sobre la lactosa una vez que obtenemos el
jarabe?
7. Qu principio de las protenas se utiliza para aislar la casena en la prctica?

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ACTIVIDAD ENZIMTICA. REACCIN DE LA CATALASA

1. FUNDAMENTO.
La catalasa es una enzima presente en todas las clulas vivas (con algunas
excepciones, como entre microorganismos anaerobios), pero est especialmente
abundante en sangre e hgado. Se ha preparado en forma cristalina de ambas fuentes.
La enzima es altamente especfica y actuar slo sobre el H2O2, que hace de sustrato,
aunque utilizar perxidos alqulicos como dadores de electrones. Cataliza la siguiente
reaccin:
H2O2 H2O + O2

El perxido de hidrgeno es producto de distintas oxidaciones celulares, y la


catalasa est presente en las clulas para evitar la acumulacin de H2O2. Es una de las
enzimas ms activas conocidas.
La actividad de la catalasa se ha determinado por distintos mtodos. Uno
conveniente, aunque aproximado, es determinar el H2O2 no descompuesto por
valoracin con permanganato despus de incubar la enzima con un exceso de H2O2. Se
deja actuar la enzima en una solucin diluida de perxido durante 5 minutos y la
reaccin se para por la adicin de cido sulfrico que destruye la enzima. La reaccin
de valoracin es:
2 MnO4- + 5 H2O2 + 6 H+ 5 O2 + 2 Mn2+ + 8 H2O

La azida o los iones cianuro forman complejos muy estables e inactivan enzimas
que contienen iones frricos, pero slo tienen un pequeo efecto en enzimas que
contienen iones ferrosos. Los citocromos, catalasa y perxidos contienen la forma
frrica y, por lo tanto, estn fuertemente inhibidos por azida o cianuro.

2. MATERIAL.
* Bandeja de plstico
* Hielo
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* 3 erlenmeyers pequeos
* Pipetas de las siguientes medidas: 110 mL, 22 mL, 21mL, 10.5 mL
* Lanceta estril
* Probeta de 50 mL
* Bureta de 25 50 mL
* Propipetas
* Varios vasos de precipitados

3. DISOLUCIONES o REACTIVOS.
* Sangre humana
* Tampn fosfato sdico 20 mM, pH 7.0
* H2O2 (aprox. 50 mM) en tampn fosfato sdico 20 mM de pH 7.0
* Azida sdica 5x10-5 M
* KMnO4 2.5 mM
* H2SO4 6 M

4. DESARROLLO.
Como fuente de enzima se utiliza sangre fresca en una dilucin de 1:500. Para
ello, se colocan 25 mL de agua destilada fra en un erlenmeyer de 50 mL que est en la
bandeja de plstico con agua fra y hielo. Se obtienen dos o tres gotas de muestra de
sangre de la punta del dedo pinchando con una lanceta estril. Se descarga la sangre
en el erlenmeyer que contiene el agua fra, y se agita el erlenmeyer para conseguir una
mezcla homognea. Se mantiene la sangre diluida en fro a lo largo de todo el
experimento para minimizar la inactivacin por calor.
Se preparan los erlenmeyers pequeos como se indica en la tabla siguiente,
aadiendo las cantidades correspondientes a cada uno de ellos. La reaccin debe
realizarse en fro, con el bao de hielo. Despus de cada adicin al erlenmeyer hay que
agitarlo bien.
Para parar la reaccin, al cabo de 5 minutos de estar reaccionando en fro la
enzima se aaden 2 mL de H2SO4 6 M al erlenmeyer correspondiente.
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El n 1 es el blanco de la reaccin y representa la cantidad total de H2O2


aadida en cada erlenmeyer. En este caso, la adicin de 2 mL de H2SO4 6 M precede a
la adicin de la enzima y no es necesario que el erlenmeyer se mantenga 5 minutos
en fro ya que no hay reaccin. Se puede valorar directamente.
El erlenmeyer n 3 corresponde al efecto de la temperatura sobre la actividad
de la enzima. Por ello se debe poner en un tubo de ensayo unos dos mililitros de
catalasa y calentarse en agua a 50 C alrededor de 5 a 10 minutos. A continuacin,
cuando se tenga que poner la cantidad correspondiente de "catalasa calentada", se
coge de este tubo.
NOTA: LAS DETERMINACIONES DEBEN REALIZARSE POR DUPLICADO.
CONSEJO: Es preferible preparar los 2 erlenmeyers del mismo n al mismo tiempo y,
cuando se ha parado la reaccin, empezar con los de otro n.

N erlenmeyer

(temperatura)

(inhibidor)

10

10

10

0.5

--

--

--

0.5

0.5

0.5

--

0.5

--

--

0.5

--

1 (control)

Tampn fosfato, pH 7.0 (mL)

10

H2O2 (mL)
Agua (mL)
-5

Azida 5x10 M (mL)


Catalasa (mL)
Catalasa calentada (mL)

La cantidad de H2O2 que no se ha descompuesto con la catalasa ser estable en


solucin cida al menos durante media hora. Durante este tiempo, se completa la
valoracin de perxido con KMnO4 2.5 mM. La primera gota de permanganato en
exceso sobre la cantidad requerida para la oxidacin de perxido pone la solucin de
color rosa. Este es el punto final.

5. CLCULO DE LA ACTIVIDAD.
La actividad de la catalasa puede expresarse como moles de H2O2
descompuestos por la accin de la enzima en 5 minutos a 0 C por mililitro de sangre:
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moles H2O2 descompuestos x 1000


Actividad enzimtica =
5
Para hacer los clculos, el n de moles de H2O2 encontrados en el n 1 es el
tiempo cero (control). La estequiometra de la descomposicin de H2O2 por
permanganato indica que por cada 2 moles de MnO4- aadidos se descomponen 5
moles de H2O2. El factor es 2.5. Para calcular los moles de H2O2 que quedan se debe
multiplicar por 2.5 los moles de MnO4- aadidos. Restando la cantidad de H2O2 no
descompuesta a partir del volumen de H2O2 presente al empezar (erlenmeyer n 1), se
obtienen los moles de perxido descompuesto. Como se ha realizado una dilucin de
1:500 de sangre y se han tomado alcuotas de 0.5 mL para los ensayos, los moles de
H2O2 descompuestos por la catalasa debe multiplicarse por 1000 para obtener la
actividad enzimtica de la catalasa, de acuerdo a la definicin dada arriba.

6. CUESTIONES.
1. Completad la siguiente tabla:
1

KMnO4 2.5 mM utilizado (mL)


H2O2 que queda sin descomponer (moles)
H2O2 descompuesta (moles)
Actividad enzimtica (moles/mLmin)
Porcentaje de inhibicin (%)

2. Dado que hay un enzima, como es la catalasa, que destruye el agua


oxigenada Qu proceso metablico est implicado en la produccin de
agua oxigenada en las clulas? (Consultar un manual de Bioqumica).
3. En qu orgnulo celular se produce el agua oxigenada?
4. Por qu hay que mantener la catalasa en hielo durante el desarrollo de la
prctica?
5. Qu papel juega el cido sulfrico en la prctica?
16

6. Qu ocurre con la catalasa, a nivel molecular, cuando se calienta en el bao


a 50 C?
7. Explicad cmo afecta la azida a la actividad de la enzima.

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ESTIMACIN CUANTITATIVA DE PROTENAS MEDIANTE EL MTODO DE BIURET

1. FUNDAMENTO.
NOTAS SOBRE ESPECTROFOTOMETRA:
Muchos experimentos bioqumicos incluyen la medicin de un compuesto o
grupo de compuestos que forman parte de una mezcla y, por tanto, la medida de la
absorcin de la luz por una sustancia en solucin es un mtodo importante en el
anlisis bioqumico. Quizs la tcnica ms usada para determinar la concentracin de
dichos compuestos es la colorimetra. El fundamento de la tcnica consiste en que si se
pasa luz blanca a travs de una solucin coloreada, algunas longitudes de onda se
absorben con preferencia sobre otras.
La cantidad de luz absorbida es proporcional a la concentracin de la sustancia
en solucin, o dicho de otra forma, la intensidad de color es proporcional a la
concentracin del compuesto. La absorcin vara con la longitud de onda de la luz,
debiendo efectuarse la medida usando luz de longitud de onda de mxima absorcin
(max), que es caracterstica de cada sustancia. Las sustancias coloreadas tienen una max en la regin visible del espectro. Otras sustancias absorben luz de otras regiones
del espectro (por ejemplo, las protenas absorben luz ultravioleta) y no son detectadas
por el ojo humano.
Para conocer la concentracin de una sustancia coloreada en solucin se utiliza
un aparato, el espectrofotmetro, que mide la cantidad de luz que atraviesa una
solucin.

Ley de Lambert-Beer:
La fraccin de luz incidente absorbida por una solucin a una longitud de onda
determinada es proporcional al espesor de la capa absorbente (paso ptico) y a la
concentracin de sustancia absorbente. Estos dos parmetros estn combinados en la
ley de Lambert-Beer:
log I0/I = cl = A
I0: intensidad de la luz incidente.
I: intensidad de la luz transmitida.
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c: concentracin de la sustancia absorbente (en moles/l mg/ml).


l: paso ptico de la muestra que absorbe luz (en cm).
: coeficiente de absorcin molar (en litros/mol x cm) coeficiente de absorcin
(ml/mg x cm).

La expresin log I0/I se denomina absorbancia y se designa por A. Es una


medida de la cantidad de luz absorbida por la solucin. El porcentaje de transmitancia
(%T = I/I0 x 100) es una medida la cantidad de luz que atraviesa la solucin.
El coeficiente de absorcin molar es una constante fsica que representa la
absorbancia de una sustancia cuando el espesor de la capa absorbente es 1 cm y la
concentracin de la sustancia absorbente es 1 mol/l. El coeficiente de absorcin molar
vara con la naturaleza del compuesto absorbente, el disolvente y la longitud de onda
de la radiacin.

El espectrofotmetro:
El espectrofotmetro es un aparato que mide la cantidad de luz que pasa a
travs de una solucin. Est compuesto por las siguientes partes:
FUENTE DE ENERGIA: lmpara que emite un haz luminoso que contiene un rango de
longitudes de onda.
MONOCROMADOR: se llama tambin selector de longitud de onda. Consiste en una
red de difraccin que separa las diferentes radiaciones procedentes de la fuente y
selecciona la longitud de onda requerida.
RENDIJA: es un dispositivo que sirve para seleccionar un haz fino de radiacin que ser
el que incida sobre la muestra, evitando que la atraviese la luz difusa.
COMPARTIMENTO DE MUESTRA: en l se coloca la solucin problema, que va a
absorber un haz fino de luz monocromtica.
DETECTOR: es un sistema que transforma la energa luminosa que atraviesa la muestra
en energa elctrica. Posee adems un amplificador de la seal elctrica recibida que
posibilita su medicin posterior.
MEDIDOR: traslada la energa elctrica producida en el paso anterior hasta un monitor
donde se analiza la lectura digital obtenida.

19

A continuacin se representa un esquema de un espectrofotmetro bsico:

MTODO DE BIURET.- Las protenas y los pptidos, debido a los enlaces


peptdicos, dan un complejo de coordinacin entre los iones cobre y los grupos CO y
NH del enlace peptdico cuando se encuentran en disolucin alcalina. Este complejo,
de color violeta, da un mximo de absorcin a 545 nm.
El nombre de la reaccin procede del compuesto coloreado formado por la
condensacin de dos molculas de urea con eliminacin de amonaco:

BIURET
UREA
REACCIN DEL BIURET

Si una solucin fuertemente alcalina de sulfato cprico (CuSO4) se aade a una


solucin de protena se forma una complejo entre el ion cprico y los enlaces
peptdicos, con aparicin de una coloracin violeta-prpura, que presenta un mximo
de absorcin a 545 nm.
Las caractersticas ms importantes de la reaccin son:
Se aplica, a partir de los tetrapptidos, a todos los pptidos y protenas.
Su rango de determinacin es de 1 a 6 mg/mL.
No depende de la composicin de aminocidos.
Algunos compuestos (NH4+, Tris, etc.) dan la reaccin.

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Violeta-prpura
Complejo protena - Cu (II)

2. MATERIAL.
* 1 pipeta de 2 mL, 1 de 5 mL, 1 de 0.5 mL y 2 de 1 mL
* 1 vaso de 50 mL
* Tubos de ensayo grandes, y 1 gradilla
* Bao de agua a 37 C
* Colormetro o espectrofotmetro

3. DISOLUCIONES o REACTIVOS.
* Solucin estndar de albmina de suero bovino de 2.5 mg/mL.
* Solucin problema de protena.
* Reactivo de Biuret (ya preparado): Contiene CuSO4.5H2O, tartrato sdicopotsico y NaOH.

4. DESARROLLO.
Preparad nueve tubos de la forma siguiente:

N tubo

Agua
destilada
Albmina
2.5 mg/mL
Disolucin
Problema

1.6

1.2

0.8

0.4

1.5

0.5

0.4

0.8

1.2

1.6

--

--

--

--

--

--

--

--

--

0.5

1.5
21

Se aaden 5 mL de reactivo de Biuret a cada tubo y se agita bien dejando


reposar durante 10 minutos a 37 C. Al cabo de ese tiempo se dejan enfriar y se leen
las absorbancias a 545 nm frente al tubo n 1 que hace de blanco. (El blanco en todas
las determinaciones colorimtricas se hace con todos los reactivos que intervienen en
la reaccin, en las mismas proporciones, sustituyendo el volumen de la protena con
agua destilada).

6. CUESTIONES.
1. Construye la recta de calibrado, representando las absorbancias (en
ordenadas) frente a la concentracin de la solucin patrn de albmina (en
abscisas).
2. Calcula la concentracin de protena en los tubos problema: tubos 7, 8 y 9
Deberan ser iguales?
3. Por qu es necesario teir la protena para determinar la concentracin?
4. Teniendo en cuenta la Ley de Lambert-Beer, qu representa la pendiente de
la recta de calibrado?
5. Escribe la ecuacin de la recta de calibrado obtenida.
6. Cul es la concentracin de protena problema original?

22

ESTUDIO CINTICO DE LA POLIFENOLOXIDASA

1. FUNDAMENTO.
Los textos de prcticas de Bioqumica son una fuente excelente de
experimentos de Enzimologa. La mayora permiten al estudiante obtener extractos de
una enzima, ensayar su presencia en la disolucin y estudiar la cintica enzimtica.
Pocos experimentos ofrecen la oportunidad al estudiante de aplicar todas estas
tcnicas al estudio de una enzima. En este caso se ha escogido la enzima
polifenoloxidasa o tirosinasa, estudiando su extraccin, actividad y cintica. Se ha
elegido esta enzima por diversas razones: 1) Puede ser rpidamente extrada de varias
fuentes vegetales, tales como champin, pltanos y patatas; 2) se dispone de un
ensayo espectrofotomtrico sencillo; 3) el cofactor metlico permite estudios de
inhibicin; 4) es importante en la qumica de la alimentacin, pigmentacin y medicina
clnica.
La enzima polifenoloxidasa se presenta tanto en clulas vegetales como
animales. Su actividad en presencia de oxgeno es la responsable del ennegrecimiento
de las plantas cortadas o daadas. La tirosinasa en clulas de mamfero parece que
tiene un papel especfico en el metabolismo de la tirosina.
Cataliza la conversin de Dopa a dopacromo, segn la reaccin:

POLIFENOLOXIDASA
O2
DOPA

DOPACROMO

En condiciones experimentales, la reaccin sigue una cintica de MichaelisMenten.


Esta secuencia de reacciones est localizada en los melanocitos, cuyo producto
final es la produccin de melaninas, sustancias que dan color a la piel, pelo y ojos. La
irradiacin de la piel por rayos UV del sol activa la tirosinasa, causando de esta forma
la produccin de melaninas.

23

La tirosinasa de vegetales y animales contiene cobre, que puede ser


complejado por varios quelantes, inactivando a la enzima. Pueden utilizarse como
inhibidores la feniltiourea, dietilditiocarbamato, azida, cianuro o cistena.
En este experimento, el extracto de polifenoloxidasa se prepara a partir de
patata. Aunque son posibles diversos mtodos de ensayo, el ms conveniente implica
la oxidacin, catalizada enzimticamente, de 3,4-dihidroxifenilalanina (Dopa) a 2,3dihidroindol-5,6-quinona. Se puede observar la velocidad inicial de formacin de la
quinona por el cambio en la absorbancia a 475 nm.
Los apartados a) y b) de la parte experimental describen la preparacin de la
enzima y el procedimiento de ensayo general. Los detalles necesarios se os dan en
estos dos apartados. Pueden aplicarse a las partes c) y d) donde se estudia un efecto
de la concentracin de la enzima y el efecto de la inhibicin.

2. MATERIAL.
* Probeta de 50 mL

* Tubos de ensayo y una gradilla

* 1 vaso de 50 mL y otro de 100 mL

* Espectrofotmetro o colormetro

* Cuchillo

* Pipetas:
1 0.5mL, 3 1mL, 2 5mL

* Mortero
* Embudo y trpode

* Hielo y recipiente para mantenerlo

3. DISOLUCIONES o REACTIVOS.
* Patatas
* Tampn fosfato sdico 20 mM, de pH 7.0.
* DL--3,4 dihidroxifenilalanina (Dopa) 2 mg/mL disuelta en tampn anterior
(preparada en el da).
* Inhibidor: azida sdica 50 mM.

4. DESARROLLO.
a) Extraccin:
Se pela una patata y se corta en pequeos trozos. Con rapidez se pesan unos
10g de patata, se trituran al mximo en el mortero y despus se mezclan con 50 mL de
24

tampn. Se homogeneiza la mezcla durante un minuto y se filtra el homogeneizado a


travs de un filtro de papel. El extracto se preparar inmediatamente antes de su uso y
se almacenar en un bao de hielo durante la realizacin del experimento.

b) Determinacin de Km y Vmx:
Disponed cuatro tubos de ensayo en una gradilla a los que se les aade tampn
y Dopa con arreglo al siguiente esquema (las cantidades estn en mL):

N tubo

Tampn

2.4

1.9

0.9

Dopa

0.5

2.9

El blanco en el espectrofotmetro se ajusta con 3 mL de tampn fosfato.


A continuacin se aade al primer tubo 0.1 mL de extracto, se agita y se vierte
rpidamente el contenido en la cubeta del espectrofotmetro o colormetro,
leyndose el cambio de absorbancia a 475 nm por un periodo de unos 2 minutos, cada
15 segundos. Se repite este proceso consecutivamente con todos los tubos. El volumen
final del medio de reaccin es siempre de 3 mL.

c) Efecto de la concentracin de enzima sobre la actividad:


Antes de dar por vlido un ensayo debe demostrarse que la velocidad de
reaccin es directamente proporcional a la cantidad de enzima puesta en el ensayo,
por eso se realiza este apartado.
El procedimiento a seguir es el descrito en el apartado b), aadiendo en ltimo
trmino el extracto, justo en el momento de medir. El blanco para ajustar el
espectrofotmetro es tampn fosfato, como el apartado anterior, y la longitud de
onda, la misma de antes.
La mezcla de reaccin final debe contener lo siguiente (en mL):

25

N tubo

Tampn

0.9

0.8

0.6

Dopa

Extracto

0.1

0.2

0.4

d) Estudios de inhibicin:
Puede investigarse la evidencia de que un in metlico est implicado en la
reaccin enzimtica mediante la observacin del efecto de agentes quelantes sobre la
actividad enzimtica. Agentes quelantes del cobre, como los mencionados antes, son
potentes inhibidores de la actividad tirosinasa o polifenoloxidasa. Para esta prctica se
emplear la azida.
Para investigar este efecto, se prepara una serie de tubos mediante el
procedimiento habitual:

N tubo

Tampn

0.9

0.5

0.1

Dopa

Inhibidor (azida)

0.4

0.8

Extracto

0.1

0.1

0.1

5. CUESTIONES.
1. Calcula las velocidades iniciales de reaccin de cada ensayo representando
los valores de absorbancia (ordenadas) frente al tiempo (abscisas).
2. Calcula los valores de Km y Vmx mediante la representacin de LineweaverBurk. Para poder realizar la grfica, completa previamente la siguiente tabla:
N tubo

v0 (min-1)

[Dopa] (mg/mL)

1/v0 (min)

1/[S] (mg/mL)-1

1
2
3

26

3. Realiza la representacin de la actividad enzimtica (ordenadas) en funcin


de la cantidad de enzima (abscisas). Completa previamente la siguiente
tabla:
N tubo

v0 (min-1)

Volumen enzima (mL)

1
2
3

4. Qu conclusiones podis deducir a partir de la representacin de la


actividad enzimtica frente al volumen de extracto?
5. Qu reaccin cataliza la polifenoloxidasa? Cul es el sustrato de la
reaccin?
6. Por qu la azida acta como inhibidor de la polifenoloxidasa?
7. Calcula los porcentajes de inhibicin en presencia de diferentes
concentraciones de azida, completando la tabla siguiente:

N tubo

v0 (min-1)

[inhibidor] (mM)

% inhibicin

1
2
3

27

AISLAMIENTO DE DNA DE ARCHAEAS HALOFLICAS. ELECTROFORESIS DE AGAROSA.

1. FUNDAMENTO.
Los cidos nucleicos, debido a su carcter macromolecular, resultan bastante
difciles de separar de las protenas y polisacridos por mtodos suaves, y los
tratamientos drsticos alteran profundamente su estructura y sus caractersticas. Las
clulas procedentes de archaeas haloflicas necesitan concentraciones salinas elevadas
para mantener su integridad celular; este hecho se ha utilizado para aislar su DNA ya
que pueden ser fcilmente lisadas si se tratan con agua. Las clulas son resuspendidas
en agua, y el lisado se extrae con fenol. El fenol y el agua son inmiscibles, las protenas
se extraen en la fase fenlica y se separan de los cidos nucleicos que se quedan en la
fase acuosa. Adicionando dos volmenes de etanol a la fase acuosa, los cidos
nucleicos de alto peso molecular precipitan como un material fibroso blanco. Si la
precipitacin se produce como un material gelatinoso incoloro indica que todava hay
protena unida a los cidos nucleicos.
La concentracin del DNA obtenido puede determinarse usando la absorbancia
(o densidad ptica) a 260 nm. Una solucin, en agua, de DNA de 1 mg/mL produce una
A260 de 20.
Cuando se prepara DNA ste debe ser de alto peso molecular y no debe estar
roto en pequeos fragmentos. Se puede comprobar, para cada muestra de DNA
obtenida, si es de alto peso molecular realizando una electroforesis en un gel de
agarosa al 0.8 %.
Por otro lado, transcurrida la electroforesis, el DNA se visualizar mediante luz
ultravioleta gracias al reactivo Red Safe que se une especficamente al DNA de doble
cadena y emite fluorescencia al ser excitado a 537 nm.

2. MATERIAL.
* Bao termosttico a 65 C

* Cubeta y fuente de electroforesis

* Tubos eppendorf

* Transiluminador

* Microcentrfuga

* Micropipetas

* Pescador de DNA

* Gafas de seguridad
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3. DISOLUCIONES.
* Clulas de Haloferax mediterranei en su medio de cultivo
* Agua ultrapura
* Fenol (produce quemaduras)
* Etanol absoluto
* Agarosa en tampn TAE (Tris - Acetato- EDTA)
* Red Safe
* Tampn de carga 6x

4. DESARROLLO.
Para evitar la contaminacin con nucleasas es necesario realizar la extraccin
con guantes. Todo el material que se va a utilizar debera estar autoclavado
(esterilizado). Los tratamientos hay que realizarlos con sumo cuidado para evitar el
que el DNA se fragmente lo menos posible y obtenerlo de alto peso molecular.

4.1 Extraccin:
Clulas procedentes de un cultivo reciente de archaeas haloflicas (Haloferax
mediterranei) se cosechan primeramente para eliminar todo el medio de cultivo. Una
vez tenemos el precipitado de clulas seco, se lisan adicionando 400 L de agua
ultrapura a ese precipitado. Despus se aaden 400 L de fenol (saturado con tampn
Tris), se mezcla por inversin y la mezcla se incuba a 65 C durante 10 minutos.
Posteriormente, las fases se separan por centrifugacin a temperatura ambiente. Se
transfiere la fase acuosa (superior) a un tubo eppendorf limpio, se aaden 800 L de
etanol absoluto y se agita suavemente para mezclar. El precipitado de DNA debera
ser visible en esta etapa. Este precipitado es pescado o centrifugado. Se disuelve de
nuevo en 100 L de agua ultrapura, que se aaden a un tubo eppendorf limpio, y se
incuba a 37 C durante un tiempo.

4.2. Electroforesis en un gel de agarosa:


4.2.1. Preparacin del gel de agarosa: Se pesan 0.32 g en un erlenmeyer de
200 mL, se aaden 40 mL de tampn 1xTAE. Se calienta en el microondas hasta que la
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agarosa est disuelta. Cuando la agarosa se haya enfriado, sin llegar a solidificar, se
aaden 2 L de Red Safe y se coloca en el molde del sistema, se sita el peine para
fabricar las calles y se deja solidificar.
4.2.2. Realizacin de la electroforesis: Se rellena el tanque de electroforesis
con tampn 1xTAE; se coloca el gel en el tanque y el gel debe estar cubierto con
tampn al menos 1 cm. Para preparar las muestras de DNA a cargar en el gel se
pipetean 15 L de DNA y 3 L de tampn de carga 6x. Se cargan las muestras en las
calles del gel; en una de las calles se pueden poner marcadores de peso molecular
conocido. Se realiza la electroforesis aplicando 120 V (50 mA). Las muestras corren
desde el electrodo negativo (ctodo) al positivo (nodo). Transcurrida la electroforesis,
el DNA puede visualizarse mediante luz ultravioleta en el transiluminador, CON LAS
GAFAS DE PROTECCIN.

5. CUESTIONES.
1. Cundo se considera que el DNA obtenido es de alto peso molecular,
cualitativamente?
2. Qu caracterstica se observa para considerar si estaba fragmentado?
3. Cmo se calculara la concentracin del DNA obtenido, de forma
cualitativa?
4. Y cmo se calculara la concentracin del DNA obtenido, de forma
cuantitativa?
5. En qu etapa del aislamiento de los cidos nucleicos es visible el DNA? a
qu es debido?
6. Por qu vemos fluorescencia en el DNA cuando lo observamos con el
transiluminador?
7. El mtodo descrito para aislar el DNA de Haloferax mediterranei, se podra
emplear para aislar los cidos nucleicos de cualquier microorganismo?
Razona tu respuesta.

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