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27.

Mtodos para la cuantificacin de protenas


Emilio Fernndez Reyes y Aurora Galvn Cejudo
Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular, Campus Universitario de Rabanales, Edificio
Severo Ochoa, 14071-Crdoba

RESUMEN
En esta prctica se utilizaran tres mtodos para la cuantificacin de protenas:
Biuret, Bradford y BCA. Para cada uno de los mtodos se realizaran: una curva
estndar, el clculo del coeficiente de extincin y el rango de sensibilidad. Se
realizar la cuantificacin de dos muestras problemas de baja y alta
concentracin, respectivamente, y se discutir las ventajas e inconvenientes de
cada uno de los mtodos.
Palabras clave: cuantificacin de protenas, Biuret, Bradford, BCA
Abreviaturas: BCA: cido bicinconnico
1. INTRODUCCIN Y OBJETIVOS
1.1 Mtodos para la cuantificacin de protenas: ventajas e inconvenientes
Determinar la concentracin de protenas en una muestra biolgica es una tcnica
de rutina bsica cuando se aborda un esquema de purificacin de una protena
concreta, cuando se quiere conocer la actividad especfica de una preparacin
enzimtica, para el diagnstico de enfermedades, as como para otros muchos
propsitos.

Existen diferentes mtodos para la cuantificacin de protenas. Muchos de estos


mtodos se basan en: a) la propiedad intrnseca de las protenas para absorber luz en
el UV, b) para la formacin de derivados qumicos, o c) la capacidad que tienen las
protenas de unir ciertos colorantes. En la Tabla I se recogen los mtodos ms usados
as como sus respectivas sensibilidades. Cada uno de estos mtodos tiene sus
ventajas e inconvenientes, las principales se recogen en la Tabla II.
1
Tabla I. Principales
mtodos para la
cuantificacin de protenas
y sus rangos de
sensibilidad Mtodo
Mtodos de Absorcin
A280

Rango de sensibilidad (g)

A205
A280 - A260
A235 - A280
A224 - A236

100-3000
3-100
100-3000
25-700
5-180
2-45

Coeficiente de extincin o
Clculo de la concentracin

280 = 1 mL/mg cm
205 = 31 mL/mg cm
Protena (mg/mL) = (1.55A280
0.76A260)
Protena (mg/mL) = (A235
A280)/2.51

A215 - A225

Protena (mg/mL) = (A224


A236)/0.6
Protena (g/mL) = 144(A215
A225)

Mtodos Derivados Colorimtricos


Biuret

1000-10000

545 = 0.06 mL/mg cm

Lowry
Bradford

25-100 a 500 nm
2-30 a 660 nm
1-2 a 750 nm
1-15

BCA
0.5- 10
Mtodos Derivados Fluorimtricos
o-ftalaldehido
1-5 excitacin a 340 nm

Usar curva estndar


595 = 81 mL/mg cm
Usar curva estndar
Usar curva estndar

emisin a 475 nm
Tabla II. Principales mtodos
para la cuantificacin de
protenas, principales ventaja
e inconvenientes Mtodo
Mtodos de Absorcin

Ventajas

No se pierden las muestras

Mtodos Derivados Colorimtricos


Biuret
Bastante especfico para
protenas
Muestra pocas interferencias
Es barato
Lowry
Tiene bastante sensibilidad

Bradford

Muy sensible

BCA
Mtodos Derivados Fluorimtricos
o-ftalaldehido
Muy sensible

Inconvenientes

Interfieren muchos compuestos


que absorben en el UV
Tiene poca sensibilidad

No todas las protenas


reaccionan igual
Mustra muchas interferencias
como detergentes no inicos,
sulfato amnico etc.
Muestra interferencias con
detergentes
Es el mtodo mas sensible
Es el que muestra menos interferencias
La interferencia de aminas
contaminantes en la muestra
No todas las muestras
reaccionan igual

1.2. Mtodo de Biuret


2+
Se basa en la formacin de un complejo coloreado entre el Cu
y los
2+
grupos NH de los enlaces peptdicos en medio bsico. 1Cu
se acompleja
con 4 NH. La intensidad de coloracin es directamente proporcional a la
cantidad de protenas (enlaces peptdicos) y la reaccin es bastante
especfica, de manera que pocas sustancias interfieren. La sensibilidad del
mtodo es muy baja y slo se recomienda para la cuantificacin de
protenas en preparados muy concentrados (por ejemplo en suero).
1.3. Mtodo de Bradford
Se basa en la unin de un colorante, Comassie Blue G-250 (tambin Serva
Blue) a las protenas. El colorante, en solucin cida, existe en dos formas
una azul y otra naranja. Las protenas se unen a la forma azul para formar
un complejo protena-colorante con un coeficiente de extincin mayor que
el colorante libre. Este mtodo es sensible (1-15 g), simple, rpido, barato

y pocas sustancias interfieren en su determinacin. Entre las sustancias que


interfieren estn los detergentes y las soluciones bsicas.
1.4. Mtodo de BCA
El cido bicinconnico, sal sdica, es un compuesto capaz de formar un
1+
complejo prpura intenso con inones Cu
en medio alcalino. Este reactivo
forma la base de un mtodo analtico capaz de monitorizar el in cuproso
2+
producido en una reaccin entre las protenas con Cu
en medio alcalino
(reaccin de Biuret). La estabilidad del reactivo y el cromforo proporciona
un mtodo para la cuantificacin de protenas que es sencillo, rpido, muy
sensible, y que muestra una gran tolerancia a compuestos que afectan a
otros mtodos.
OHProtena + Cu2+ Cu1+
Cu1+ + BCA complejo prpura BCA- Cu1+

1.5. Objetivos
Con esta prctica se pretende introducir al alumno en los diferentes
mtodos para la cuantificacin de protenas: su fundamento, sus ventajas e
inconvenientes. Se utilizarn tres mtodos (Biuret, Bradford y BCA), para
cada uno de ellos se realizar una curva estndar, se determinar el
coeficiente de extincin, el rango de sensibilidad, y se realizar la
cuantificacin de dos muestras problemas.
2. LISTADO DEL MATERIAL NECESARIO
Tubos de ensayo
Pipetas de automticas regulables de 20-100 l y de 200-1000 l

Espectofotmetro
Agua destilada
Soluciones estndar de protena
Reactivo de Biuret
Reactivo de Bradford
Reactivo de BCA
3. PROTOCOLO A REALIZAR
3.1. Mtodo de Biuret
Aadir 1 ml del reactivo de biuret a los tubos estndar y muestras problemas
preparadas como se indica en la Tabla III.
Dejar a temperatura ambiente y leer la Absorbancia a 545 nm frente al
blanco. El color es estable 1 hora.

Tabla III. Protocolo tipo para la cuantificacin de


protenas por el mtodo de Biuret Reactivos
Estndar
H2O
R. Biuret
Tubos
(20 mg/ml)
Blanco

Resultados
A545 nm

0 l

100 l

1 ml

25 l

75 l

1 ml

50 l

50 l

1 ml

75 l

25 l

1 ml

100 l

0 l

1 ml

M1

100 l

0 l

1 ml

M2

100 l

0 l

1 ml

Muestras

- Representa la curva estndar.


- Calcula el coeficiente de extincin.
- Calcula las concentraciones de protenas de las muestras M1 y M2.
3.2. Mtodo de Bradford

[protena]

Aadir 1 ml del reactivo de Bradford a los tubos estndar y muestras problemas


preparadas como se indica en la Tabla IV.
Dejar a temperatura ambiente y leer Absorbancia a 595 nm frente al blanco. El
color es estable 1 hora.
Tabla IV. Protocolo tipo para la cuantificacin de
protenas por el mtodo de Bradford Reactivos
Estndar
H2O
R. Bradford
Tubos
(0,5 mg/ml)

Resultados
A595 nm

[protena]

Blanco

0 l

100 l

1 ml

25 l

75 l

1 ml

50 l

50 l

1 ml

75 l

25 l

1 ml

100 l

0 l

1 ml

Muestras
M1

100 l

0 l

1 ml

M2

100 l

0 l

1 ml

- Representa la curva estndar.


- Calcula el coeficiente de extincin.
- Calcula las concentraciones de protenas de las muestras M1 y M2.
3.3. Mtodo de BCA
Aadir 1 ml del reactivo de trabajo de BCA a los tubos estndar y muestras
problemas preparadas como se indica en la Tabla V.
Incubar 10 min a 60 C y leer Absorbancia a 562 nm frente al blanco.
Tabla V. Protocolo estndar para la
cuantificacin de protenas por el mtodo de
BCA Reactivos
Estndar
H2O
R. BCA
Tubos
(0,1 mg/ml)
Blanco

Resultados

A562 nm

0 l

100 l

1 ml

25 l

75 l

1 ml

50 l

50 l

1 ml

75 l

25 l

1 ml

100 l

0 l

1 ml

M1

100 l

0 l

1 ml

M2

100 l

0 l

1 ml

Muestras

[protena]

- Representa la curva estndar.


- Calcula el coeficiente de extincin.
- Calcula las concentraciones de protenas de las muestras M1 y M2.
3.4. Compuestos que interfieren en la determinacin de protenas
Repetir las curvas estndar para cada uno de los tres mtodos pero incluyendo se
pueden incluir :
10 l de 1M EDTA ,
10 l de Tritn X-100,
10 l de SDS 20%
Determinar cmo estos compuestos afectan a la cuantificacin de protenas por uno u
otro mtodo.
4. RESULTADOS ESPERADOS
El mtodo de Biuret (poco sensible) permitir cuantificar la cantidad de protenas en la
muestra M1 pero no en la M2. Por el contrario los mtodos mas sensibles (Bradford y
BCA) permitirn cuantificar la muestra M2, pero la M1 se saldr de rango. Para poder
cuantificar la muestra M1 hara falta hacer diluciones de la misma.
5. EJERCICIOS, DISCUSIN Y COMENTARIOS
- Qu mtodo es el ms sensible?, y el menos sensible?.
- Qu problemas tienes para determinar la concentracin de protenas de las
muestras M1 o M2. con cada una de estos mtodos?. Cmo lo resolveras?.
- Discute tus resultados de acuerdo con los datos de la Tabla VI .
- Decide qu mtodo de determinacin de protenas elegiras para la cuantificacin de
protenas en: suero, orina, LCR, durante una purificacin enzimtica, en un extracto
bacteriano concentrado, en preparaciones de membranas plasmticas solubilizadas
con SDS, en preparaciones de membranas mitocondriales solubilizadas con Tritn X100.
Tabla VI. Algunos compuestos que interfiren en la determinacin de protenas
Interferencia en el
Interferencia en el
Mtodo de BCA
Mtodo de Lowry
Compuesto
50 mM EDTA
Si
Si
4 M Cloruro de guanidina

N0

Si

1% Triton X-100

No

Si

40% Sacarosa

No

Si

20% Sulfato amnico

Si

Si

3% Sulfato amnico

No

Si

ANEXO 1: REACTIVOS
Reactivo de Biuret

Reactivo preparado del siguiente modo. Disolver 3,8 g de CuSO .5H O y


4
2
6,7 g NaEDTA en 700 ml de H O. Mientras se agita aadir 200 ml de NaOH
2
5N y luego 1g de KI como estabilizante. Guardar en frasco de plstico.
Reactivo de Bradford
Reactivo preparado del siguiente modo: mezclar 10 mg de Comassie Blue
G-250 con 10 ml de fosfrico al 88% y 4,7 ml de etanol absoluto. Aadir
H O hasta 100 ml. Filtrar a travs de papel de filtro y guardar en la
2
oscuridad.
Reactivo de BCA
Reactivo preparado del siguiente modo.
Reactivo A: BCA 1%, Na CO 2%, tartrato sdico 0,16%, NaOH 0,4% y
2 3
NaHCO 0,95%. Ajustar a pH 11,25 con NaOH.
3
Reactivo B: CuSO al 4%
4
Reactivo de trabajo: mezclar 100 volmenes de A con 2 volmenes de B.
Soluciones estndar de protenas
Seroalbmina bovina 20 mg/ml
Seroalbmina bovina 0,5 mg/ml
Seroalbmina bovina 0,1 mg/ml
Muestras M1 y M2
La muestra M1 debe tener una concentracin de protenas entre 10 20
mg/ml
La muestra M2 debe tener una concentracin de protenas entre 0,1- 0,5 mg/ml