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Folleto de Algas

Escuela Superior Politcnica del Litoral, 1994


Impreso en Ecuador

Henry G. Alvarez Arellano

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CAPITULO IV
MEDIOS DE CULTIVO
(Tomado de Phycologycal Methods, by Janet R. Stein)

Objetivos
Despus de estudiar ste capitulo el estudiante deber estar en condiciones de:
1.-Saber preparar un medio de cultivo elemental para
casos emergentes.
2.-Conocer los pasos a seguir para una buena limpieza de vidriera.

Cristalera.
Limpieza.
Agua salada.
- Mtodo general depreparacin .
Esterilizacin en autoclave.
Soluciones stock.
- Recomendaciones.

3.-Saber preparar un medio enriquecido. Preparar una


solucin stock de macro o de micronutrientes.

- Micronutrientes inorgnicos.

4.-Conocer los medios ms usados en el cultivo de


algas de agua dulce y de agaua salada.

Cianocobalamina (Vit. B12).


Biotina (Vit. H).
Tiamina (Vit. B1).

5.- Saber como almacenar agua salada cruda y cmo


remover materia orgnica disuelta del agua.
6.-Usar el autoclave en el proceso de esterilizacin
de vidrios y de soluciones.
7.-Preparar una solucin stock de trabajo.
8.-Preparar extracto de suelo, esterilizarlo y saber preservarlo.

- Micronutrientes orgnicos:

- Preparacin del extracto de suelo.


- Medios marinos enriquecidos:
Medio Walne.
Medio f/2 Guillard.
Medio Erdschreiber.
- Preservacin de cepas:

9.-Entender la tcnica de liofilizacin en la preservacin de cepas.

- Liofilizacin.

Sinopsis del capitulo

- Bibliografa.

- Medios para algas de agua dulce.


- Materiales:
Qumicos.
Esterilizacin.
Cristalera.
Procedimiento de lavado.
Agua.
Suelo.
- Mtodo de preparacin.
- Medios de cultivo definidos:
Beijerinck.
Bold Basal.
Chu N10.
- Recomendaciones.
- Medios para algas marinas.
- Materiales:
Qumicos.
Equipos.

- Miscelanea de preguntas.

Medios para algas de agua dulce


Entre las principales consideraciones a seguir estn:
El ph del medio.
Las concentraciones de nutrientes primarios.
La fuente de nitrgeno.
Los posibles factores orgnicos o de crecimiento para
el enriquecimiento.
La composicin de micronutrientes.
Los medios de naturaleza artificial, de composicin
qumica conocida, son a menudo empleados como aditivos para medios naturales de composicin qumica desconocida como es el agua de un ro o de un lago. Estamos
entonces ante medios de crecimiento enriquecidos (agua
fertilizada), en donde se aspira a cumplir con los requerimientos nutricionales de una especie o grupo de algas de
quienes no se conoce exactamente sus requirimientos.

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Medios de Cultivo

Materiales

Lavar con solucin cida ( ej. ClH )

Qumicos:

Enjuagar 3 veces con agua destilada

Deben ser de buena calidad y evitar reactivos degradados o contaminados. Es importante la exactitud en el
peso de los qumicos a ser usados.
El agar es usado para solidificar medios de crecimiento, es agregado al medio que fue preparado antes de ser
autoclavado. Si el pH es muy cido no hay que autoclavar.
Se suguiere entonces autoclavar ambos por separado.
El agar es un polmero neutral de galactosa de baja
viscosidad cuando est diludo en agua . Se gelatiniza a
temperatura estable y su estructura es fuerte. Se disuelve
a 95 grados centgrados y endurece a 45.Usar del 1 al 2 %
de concentracin del agar. Preparar como la gelatina.
Autoclavado:
A 121 grados centgrados, 20 lb/inch2 por 20 a 35
minutos despus que ha alcanzado la presin indicada en
el autoclave.
Esta esterilizacin puede ser con el agar ya puesto en
tubos, petri - dish y fiolas o vertir el agar esterilizado en
cada recipiente asepticamente en los vidrios. Los vidrios
deben estar esterilizados debidamente.
Cristalera:
Tubos de ensayo : De diferentes volmenes, con
tapa rosca o algodn o tapones de neopreno.
Platos petri con tapa: No mantienen esterilidad por
largo tiempo.
Fiolas: De diferentes volmenes, igualmente tapados con algodn o tapones de neopreno.
Agua:
El agua para el medio de crecimiento puede ser filtrada con membrana si la condicin del cultivo as lo requiere. Agua destilada para la preparacin de stock.
Suelo:

Mtodo de preparacin
Un medio de crecimiento es generalmente preparado
a partir de soluciones stock ( pre - mixed ):
Las alcuotas de estos stocks son medidos y agregados a un volmen dado de agua dulce.
En algunos casos los componentes son agregados directamente al volmen dado de agua dulce.
Desorden en la aplicacin de los componentes o
alcuotas pueden causar problemas.Ej. Las precipitaciones.
Las soluciones stock deben guardarse en fro o en recipientes de vidrio bien sellados para evitar evaporaciones.
El agua dulce a ser enriquecida debe ser esterilizada
o debidamente filtrada.
Medios de cultivo definidos
Los medios generalmente son preparados a partir de
soluciones stock previamente mezcladas. Las alcuotas de
estas soluciones son medidas y agregadas a un volmen
dado de agua. En algunos casos los componentes indicados son pesados y agregados directamente al volment de
agua, quedando as preparado el medio. Los procedimientos incorrectos pueden causar precipitaciones, especialmente nitratos y fosfatos.
Las soluciones stock pueden prepararse y almacenarse
en frio por largo tiempo, para lo cual se recomienda el uso
de recipientes con tapa de vidrio. Todas estas soluciones
deben prepararse con agua destilada.
A continuacin se describen tres medios de cultivo
para algas de agua dulce:
1. Beijerinck ( pH 6.8 ): Se compone de 3 soluciones stock de macronutrientes y una de micronutrientes.

En caso de usarse su extracto, el suelo debe ser:


Poca cantidad de arcilla ( barro ).
Que se asiente al ser mezclado con el agua.
Poco contenido de humus.
No fertilizado reciente.
Que no haya recibido pesticidas.
(Ver preparacin del extracto ms adelante en este
captulo).
Lavado de vidrieria:
Agua de llave ms detergente.
Enjuagar en agua de llave.

Soluciones stock de macronutrientes


TIPO

CANTIDAD

Stock I
NO3 NH 4
PO4 HK2
SO4 Mg . 7 H2O
Cl2Ca . 2 H2O

(para 100 ml / l )
1,5 g / l
0,2 g / l
0,2 g / l
0,1 g / l

Stock II
PO4 H 2 K

( para 40 ml / l )
9,07 g / l

Stock III
PO4 HK2

( para 60 ml / l )
11,61 g / l

Henry G. Alvarez Arellano

Solucin stock de micronutrientes


TIPO
Micronutrientes
BO3H3
SO4 Cu . 5H2O
EDTA . Na2
SO4Zn . 7 H2O
Cl2Mn . 4 H2 O
Mo7O24 ( NH4)6. 4 H2O

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Solucin stock

CANTIDAD

NUTRIENTE

CANTIDAD

( para 1 ml / l )
1g/l
0,15 g / l
5g/l
2,2 g / l
0,15 g / l
0,10 g / l

( NO3 )2 Ca
PO4 HK2
SO4Mg. 7H2O
CO3Na2
SiO3Na2
Cl3Fe

0,04 g / l
0,01 g / l
0,025 g / l
0,02 g / l
0,025 g / l
0,8 g / l

Recomendaciones
Los micronutrientes se disuelven uno por uno en 100
ml de agua tibia, luego el pH se ajusta a 5 con KOH
granulado. La solucin final debe tener un pH 6,5. El
hierro precipita en pH 7
2. Bold Basal ( pH 6,6 ) o solucin Bristol: Se
compone de 1 solucin stock de macronutrientes y 4 de
micronutrientes.
Solucin stock de macronutrientes
TIPO

CANTIDAD

Stock I
NO3Na
Cl2Ca. 2 H2O
SO4 Mg. 7H2O
PO4HK2
PO4H2K
ClNa

( para 60 ml / l )
10 g / 400 ml
8 g / 400 ml
3 g / 400 ml
3 g / 400 ml
7 g / 400 ml
1 g / 400 ml

Soluciones stock de micronutrientes


TIPO

CANTIDAD

Los medios enriquecidos tienen la ventaja de soportar el crecimiento de un gran nmero de especies de algas.
Si estos medios son muy orgnicos corren el riesgo de
contaminarse con bacterias ms fcilmente que los
inorgnicos. Un medio definido puede transformarse en
indefinido si se le hacen modificaciones.
El nitrgeno generalmente se lo introduce como nitrato y a veces como amonaco, urea o amino cidos. Un
stock de urea se prepara con 54 g / l en agua destilada y 10
ml de esta solucin se usa como fuente de nitrgeno para
reemplazar al nitrato en el medio Bold Basal.
Vitaminas como cianocobalamina, biotina y tiamina
son requeridas por muchas algas cuando crecen en cultivos axnicos. Ellas son usadas en muy bajas concentraciones y almacenadas en solucin stock a temperatura de
congelamiento. Ellas pueden ser autoclavados o filtradas con membrana y agregadas asepticamente al medio
esterilizado.
Las vitaminas son importantes en los cultivos axnicos
(libre de bacterias), ya que cuando las bacterias estn presentes (cultivos clonales) pueden suplir vitaminas directamente al cultivo.
A continuacion se indican las clases de algas que han
sido cultivadas con xito en los medios citados:

EDTA Na2
EDTA Na2
KOH

( para 1 ml / l )
50 g / l
31 g / l

Hierro
SO4Fe. 7 H2O
SO4 H2

( para 1 ml / l )
4, 98 g / l
1g/l

Medios definidos

Boro
BO3H3

( para 1 ml / l )
11,42 g / l

1. Beijerinck
2. Bold Basal

Trazas
SO4Zn. 7 H2O
Cl2Mn . 4 H2O
Mo O3
SO4 Cu. 5H2O
(NO3)2 Co. 6 H2O

Medios de cultivo y clases de algas cultivadas

3. Chu N 10
8,8 g / l
1,44 g / l
0,71 g / l
1,57 g / l
0,49 g / l

3. Chun N 10 (pH 6,5 - 7,0): Evitar pesos repetitivos.


Seguir la secuencia propuesta para la mezcla.

Enriquecidos (Indef.)

Clase de algas
cloroficea
cloroficea,crisoficea,
cianoficea, fodoficea
bacilarioficea,cloroficea,
crisoficea, cianoficea
cloroficea,crisoficea,
cianoficea, rodoficea

Medios para microalgas marinas


El agua de mar es de por s un medio propicio para el
crecimiento de algas. Este es un medio natural complejo
provisto de ms de 50 elementos conocidos (componen-

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Medios de Cultivo

tes) y un elevado nmero de compuestos orgnicos variables.


Este medio marino generalmente es fortalecido cuando se
le aaden nutrientes como el nitrgeno, el fsforo, el hierro y otros.
Un mejor entendimiento de los micronutrientes y de los
factores de crecimiento han permitido mejorar este medio, aunque poco se ha hecho al respecto para las
microalgas bnticas.
El uso de estabilizadores (buffers) del pH no txicos y
quelantes han facilitado la esterilizacin por calor de los
medios marinos, sin que stos se precipiten. Los aparatos
de filtracin son en muchos casos convenientes para esterilizar estos medios debido a la rapidez y facilidad con
que se lo hace.
Muchos medios enriquecidos y sintticos han sido desarrollados para el cultivo de algas microscpicas
planctnicas y algunas especies bnticas han crecido
exitosamente con estos medios.
Las dificultades encontradas en el desarrollo de los cultivos algales estn a menudo relacionadas con los problemas de aislamiento, manipulacin, incubacin y situacin
fisiolgica del organismo.
Un solo medio debe servir para la mayora de las necesidades del cultivador. Este es el caso del medio R.
Guillard f/2 en el cual un gran nmero de especies algales
crecen sin dificultad.
Un medio sinttico puede ser usado igual que uno enriquecido, pero cualquiera que ste sea, el medio deber ser
tan simple como sea posible en su composicin y preparacin.
Materiales
Qumicos:
Los qumicos empleados en la preparacin de un
medio pueden ser del grado reactivo o grado tcnico, dependiendo de la calidad del cultivo que se va a realizar.
Los qumicos de grado reactivo (QP) se usan en la preparacin de medios para cultivo menores (Indoor Culture
Application) o que demanden tal grado de pureza. Estos
medios tienen elevado costo, a diferencia de los que se
preparan con grado tcnico y se usan mayormente en cultivos masivos.
Equipos:
Un autoclave para efectos de esterilizacin.
Una balanza analtica para pesar metales trazas y vitaminas.
Una balanza gramera para pesar valores mayores.
Un pHmetro para estabilizar las soluciones y el medio final.

Un calentador elctrico con agitador magntico para


disolver compuestos.
Un lavador automtico de pipetas.
Varios baldes de acero inoxidable de 13 a 15 l. de
capacidad.
Un refrigerador - congelador para almacenar reactivos,
soluciones stocks y vitaminas.
Un incubador con control de luz y temepratura para
preservacin de cepas.
Cristalera:
La vidriera marca PYREX es de buena calidad. Se
requieren aparatos para filtracin al vaco (membrane
filter); cilindros graduados con tapa y sin tapa; beakers de
varias medidas; fiolas de diferentes volmenes; botellas
con tapa para reactivos; pipetas para medir diferentes volmenes; cilindros plsticos con tapa para lavado de
pipetas; tubos de ensayo con tapa rosca; platos petri; termmetros de -20 a 110 grados centgrados; esptulas;
embudos; mechero de gas y de alcohol; embudos de porcelana para filtracin; fiolas para usar en filtracin
La cristalera usada en los trabajos de rutina no deben
emplearse en la preparacin de medios y toda vidrieria
nueva debe enjuagarse en ClH diluido para remover cualquier agente reaccionante.
Limpieza:
El detergente remueve la materia orgnica del vidrio.
Primero enjuague la cristalera con agua de la llave
inmediatamente despus de usarla.
Djela remojando toda la noche en una solucin con
detergente preparada con agua destilada, en un recipiente
(balde) de acero inoxidable.
La solucin con la vidrieria calintela o hiervala por
una hora. Haga un primer enjuague con agua de la llave y
finalmente con agua destilada por varias ocasiones.
Invierta cada recipiente para que escurra y luego tpelo.
En el caso de las pipetas emplee el mismo procedimiento descrito y para escurrir use el porta pipetas.
Toda vidrieria, incluyendo pipetas, que no responden
al lavado con detergente debe ser remojada en SO4H2
saturado con NO3Na o en NO3H caliente. Luego enjuague bien con agua destilada.
Mnimas cantidades de materia orgnica pueden ser
destruidas mediante coccin a 350 y 400 grados centgrados por 3 a 4 horas. Los dedos sucios son buenos contaminantes.
La preparacin de soluciones stocks se hacen en agua

Henry G. Alvarez Arellano

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doblemente destilada.
Agua Salada

especialmente las unicelulares. El pH del agua de mar es


de 8.2 a 8.4 normalmente.

El agua salada a emplearse en la preparacin de medios debe ser de mar afuera, o de reas costeras consideradas libres de contaminantes, luego filtrada para mantenerla.

Esterilizacin en autoclave:

Las partculas mayores son removidas con papel filtro Whatman # 1, pero una filtracin con membrana
(milipor) de 0.45 um es usada para eliminar todas las partculas menores incluso las bacterias. Cuando se filtra con
membrana la velocidad de paso del agua debe ser lenta, a
diferencia del papel filtro.
Para hacer bioensayos con vitaminas, la materia orgnica disuelta debe ser primeramente absorvida, pasando el agua por una columna de carbn activado que adems la estandariza. Esta forma de remover la materia orgnica es mejor usarla con altas cantidades de agua salada.
Cuando se trata de mnimas cantidades, un litro por
ejemplo, el agua es mezclada con 2 g de carbn activado
nuevo y pulverizado, agitarlo por una hora y luego filtrarlo con membrana milipor. Otra forma de eliminar materia
orgnica es por medio de radiacin ultravioleta de alta
energa, que adems la esteriliza.
El agua salada puede conservarse en recipiente plstico (polietileno), o vidrio. Cuando el recipiente es nuevo, ste debe ser curado con cido clorhdrico varios
das y luego enjuagarlo bien con agua de la llave. Agua
cruda (no esterilizada, ni filtrada con membrana) no debe
almacenarse por mucho tiempo. Es mejor preparar un
medio con agua nueva. El agua debe ser almacenada en
fresco y oscuro.
Mtodo general de preparacin
Coloque el 80 o 90% del volumen requerido en el
recipiente, sea beaker, botella, fiola o matrz.
Agregue los nutrientes apropiados de las soluciones
stock, agitando constantemente.
Ajuste el pH a 7.5 empleando ClH 1N o NaOH segn
se requiera.
Complete el 100% del volumen requerido final con
agua salada y distribuya el medio en los recipientes indicados para su esterilizacin en autoclave o filtracin.
Agregue aspticamente las vitaminas tomndolas de
una solucin previamente preparada y esterilizada despus
que el medio fue autoclavado y enfriado.
Asegrese de que la salinidad final est correcta.Una
salinidad de 35 UPS es considerada normal para el agua
salada. Si hay que rebajarla use agua destilada y si hay
que subirla coloque el agua en un evaporador. La mayora de las algas crecen bien a 30 UPS e incluso menos,

La esterilizacin se logra autoclavando el medio a 121


grados centgrados de temperatura, 15 lb/pulgada cuadrada de presin (de vapor), por un tiempo que vara de 10
minutos para un volumen de 100 ml, 20 minutos para 2 lts
y 35 minutos para 5 lts.
Todo el aire debe salir del autoclave antes de iniciar
la esterilizacin. De no ser as la correcta esterilizacin
no se dar.
En algunos autoclaves este aire se elimina
automticamente, no as en otros, donde la vlvula de escape debe permanecer abierta hasta que se vea salir una
columna de vapor en forma persistente. Cerrando la vlvula, se deja subir la presin hasta 15 libras, momento en
que se inicia la esterilizacin y se toma el tiempo.
Los recipientes (frascos, fiolas, matraces, etc.) que
contienen el medio a ser esterilizado deben taparse con
materiales que permitan el paso del vapor caliente al interior, como tapones de gasa - algodn o papel KRAFT no
encerado-. El papel aluminio no es recomendable usar.
El material esterilizado caliente dejarlo que se enfre dentro del autoclave antes de sacarlo.
Este autoclavado puede causar precipitacin en algunos medios. Este precipitado corresponde a casi todo el
fosfato presente en el medio, pero se lo evita aplicando el
fosfato, los metales traza y el silicato previamente esterilizados. Hacer estas aplicaciones con criterio de asepsia
para evitar contaminacin cuando se trate de cultivos menores.
Ciertos plsticos que se usan en la esterilizacin pueden desprender txicos al medio.
Soluciones Stock :
La mayora de las sales y compuestos empleados en
la preparacin de soluciones stock son muy solubles en
agua, al punto de permitir 500 y hasta 1000 diluciones
para la preparacin de medios enriquecidos.
La concentracin de algunas soluciones es muy baja.
Algunos metales traza, vitaminas y dems nutrientes son
primeramente diluidos para formar las soluciones que servirn para enriquecer un medio de cultivo. Es decir que
estas soluciones viene a ser las soluciones stock de trabajo.
Disuelva la cantidad exacta del compuesto en 80-90%
del volumen requerido en agua destilada. En una hornilla
elctrica o calentador magntico agite suave y constantemente mientras se disuelve el compuesto. Djelo enfriar
y luego mida el pH de la solucin ajustndolo cuando sea
necesario. Use una probeta para enrasar el volumen final..

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Medios de Cultivo

En la preparacin de una solucin stock de trabajo


que contiene una mezcla de compuestos (sales, vitaminas, etc) disuelva cada uno por separado en un volumen
mnimo de agua destilada, luego combine estas soluciones y enrase al volumen final deseado.
Las soluciones stock se almacenan en botellas de vidrio o recipeintes plsticos y se refrigeran. Si las soluciones preparadas van a ser autoclavadas pueden agregarse
unas gotas de un preservante voltil, esto es una solucin
que contiene una parte de clorobenceno (v/v), una parte
de 1.2 dicloroetano y dos partes de n-butilcloruro (1clorobutano). Agitar fuertemente.
Recomendaciones
Algunas sales no se preparan como soluciones stock
debido a su baja solubilidad. Estas sales son el NaCl,
SO4Mg, ClK y SO4Na2.
El nitrgeno es agregado como nitrato de sodio
(NO3Na). El amonaco como cloruro de amonio (ClNH4)
en un mximo de 0.1 mM/l debido a su toxicidad para
algunas especies. Buena parte del nitrgeno se puede perder del medio (volatiliza) durante el autoclavado, por lo
que las solucioens estriles se agregan aspticamente luego de que el medio se ha enfriado. La rea se descompone cuando se la calienta y debe ser agregada por filtracin
estril. Algunos aminocidos tambin se degradan cuando son autoclavados en el medio.
El fsforo es agregado generlamente como
ortofosfato.
El silicio participa en el medio solamente cuando se
trata de algas diatomeas. Este elemento es agreagado como
solucin de metasilicato de sodio (SiO 3Na2). El silicio
siempre se lo disuelve aparte y forma una solucin stock.
El metasilicato de sodio se disuelve con facilidad en agua
destilada tibia y es altamente alcalino, por lo que precipita
o se polimeriza cuando se lo agrega al medio. El problema se resuelve si la solucin stock del silicio primero se la
acidifica a pH 2 con ClH concentrado. Pero las diatomeas
crecen bien si el medio es preparado con solucin stock
de silicio con pH alcalino.
Slo dos amortiguadores (buffers) son usados en
medios marinos: el tris (hidroxilmetilaminometano) y la
glicilglicina. Ambos amortiguan bien en pH 7.5-8.5. Las
soluciones preparadas con estos buffers se deterioran con
el tiempo, por lo que deben ser usadas inmediatamente
despus de su preparacin. El tris es fuertemente alcalino
por lo que para evitar precipitaciones no hay que agregarlo directamente al medio. Disolver la cantidad requerida
de tris en agua destilada aparte y use mnimos volmenes
para enriquecer medios marinos. Ajuste el pH del medio
con el ClH concentrado.
La glicilglicina es soluble en agua y el polvo puede
agregarse directamente al medio. Es altamente acdico,
por lo que no causa precipitados y el pH debe ajustarse
con gotas de NaOH 1N. La glicilglicina es rpidamente

metabolizada por los microorganismos y debe ser usada


slo con los cultivos axnicos, mientras que el tris puede
usarse con los cultivos xnicos.
Algunos organismos inhiben su crecimiento con el
tris y no as con la glicilglicina. Cantidades mnimas deben ser empleadas en ambos casos y de 1 a 5 mM es suficiente. Ninguno de ellos sirve como recurso de nitrgeno
para el crecimiento algal.
Micronutrientes inorgnicos
Corresponden a los metales que intervienen en el enriquecimiento del agua de mar. Los micronutrientes que
se vern aqu slo sern aquellos que se usan para enriquecer medios marinos y no para medios sintticos por
cuanto estos no siempre dan resultados satisfactorios en
las producciones masivas. Los elementos que mayormente
participan son el zinc, manganeso, molibdeno, cobalto,
cobre y el hierro. Las concentraciones de stos compuestos varan segn la frmula del medio que se trate. Es
conveniente usar sales hidratadas para facilitar su dilucin cuando se prepara la solucin de metales traza. Estos metales son agregados en forma quelada, siendo el Na2
EDTA el principal quelante y con el que se evitan precipitados durante la combinacin de las sales.
El cobalto, cobre, manganeso, molibdeno y zinc se
los puede preparar por separado como soluciones stock
primarias y diluidas, para luego formar una solucin stock
de trabajo. Los cloruros o sulfatos de estos elementos
(sales) pueden usarse, pero el molibdeno es preparado
como MoO4Na2. El hierro puede ser diluido aparte junto
con el EDTA y formar la solucin Fe.EDTA para as emplearlo en la preparacin del medio. La primera solucin
stock mencionada es estable en condicin alcalina, pero
el hierro por no brindar esta condicin es quelado con el
EDTA. Si ha de formarse una solucin stock el Fe.EDTA
tambin puede ser agregado en un principio y no hay alteracin.
Otra forma de preparar la solucin stock de metales
traza es con el 80 o 90% del volumen de agua destilada
requerida, disolver primeramente el Na2 EDTA y a continuacin el hierro, luego se irn disolviendo uno a uno los
metales restantes y agitando constantemente. Completar
el volmen final con agua destilada.
Micronutrientes orgnicos
Slo tres vitaminas son realmente necesarias para el
crecimiento de las algas marinas, esto es la
cianocobalamina, biotina y tiamina HCl. Algunos medios
emplean mayor nmero de vitaminas.
Cianocobalamina (Vit. B12):
Es estable en forma de polvo y contiene un 12% de
humedad. En la preapracin pueden usarse las ampollas
que contienen 10 mg del compuesto, para lo cual:
Preparar una solucin stock primaria de cianocobalamina
disolviendo el contenido de una ampolla (inyeccin) en

Henry G. Alvarez Arellano

agua destilada.
Ajustar el pH a 4.5 con ClH y diluir a un volumen
determinado (1 litro).
La condicin cida de la vitamina permite su
autoclavado. Ella tambin puede ser filtrada con membrana milipor. Almacenar la solucin a -20 grados centgrados. Esta vitamina resiste los recongelamientos y los
reautoclavados.
Biotina (Vit. H):
Es estable en forma de cristal y contiene un 4% de
humedad.
La solucin stock primaria se prepara como en el caso
anterior, slo que la biotina deber ser pesada de acuerdo
al requerimiento.
Su acidificacin la vuelve estable para el autoclavado.
Tiamina HCl (Vit. B1):
La cantidad requerida puede diluirse en la solucin
de biotina y ajustar el pH a 5.5. Puede autoclavarse en
esta condicin y guardar en congelamiento. Las tres vitaminas pueden combinarse para formar una sola solucin stock de trabajo hasta para mil diluciones. Agregar
las vitaminas al medio en forma asptica, aunque ellas
son frecuentemente autoclavadas con el medio.
Preparacin del extracto de suelo
La muestra de tierra no debe contener aplicaciones
de fungicidas ni insecticidas. Debe contener la menor
cantidad posible de arcilla.
Mezclar un volumen de tierra en dos volumenes de
agua estilada y autoclavar de 40 a 60 minutos o hervir por
ms de 60 minutos agitando constantemente. Dejar el caldo en reposo durante la noche y luego filtrar. El extracto
obtenido y la tierra son altos contaminantes, por lo que
deben manejarse con extremo cuidado en el laboratorio.
Medios marinos enriquecidos
Los medios enriquecidos ms sencillos slo contienen fuentes de nitrgeno, fsforo y el extracto de suelo,
que son agregados al agua de mar. Los medios enriquecidos ms sofisticados contienen adems mezclas de metales traza y vitaminas.
Medio Walne (1966).- Sofisticado medio usado para
un gran nmero de algas unicelulares.
Solucin bsica de nutrientes:(*)
Cl3Fe.6H2O
MnCl2.4H2O
BO3H3
Na2.EDTA
PO4H2Na.2H2O
NO3Na

1,3 g.
0,36 g.
33,6 g.
45 g.
20 g.
100 g.

Solucin metales traza


Agua destilada

35

1 ml.
1 l.

*Agitar en cada aplicacin.


Agregar 1 ml. de sta solucin por cada litro de agua
salada a enriquecer.
Solucin de metales traza:
Cl2Zn
Cl2CO.6H2O
NH46Mo7O24.4H2O
SO4Cu.5H2O
Agua destilada

2,1 g.
2 g.
0,9 g.
2 g.
100 ml.

Es necesario acidificar sta solucin con ClH para


obtener un lquido claro.
Solucin de vitaminas:
Cianocobalamina (B12)
Tiamina.HCl (B1)
Biotina (vit. H)
Agua destilada

10 mg.
200 mg.
10 mg.
100 ml.

Esta solucin debe ser acidificada a pH 4.5 antes de


autoclavarse. Agregar 0.1 ml. por cada litro de agua
salada.
Medio f/2 Guillard (1968).- Sofisticado medio
usado para un gran nmero de especies unicelulares. Puede ser efectivo para algas bnticas. Los nutrientes y el agua
salada son autoclavados juntos despus del ajuste del pH
a 7.4. Sirve para aislar y mantener.
Solucin bsica de nutrientes:
NaNO3
75 mg.
PO4H2Na.H2O
5 mg.
SiO3Na2.9H2O
15 - 30 mg.
(El silicato es slo para diatomeas).
Solucin de metales traza:
Na2EDTA
Cl3Fe.6H2O
SO4Cu.5H2O
SO4Zn.7H2O
Cl2Co.6H2O
Cl2Mn.4H2O
MoO4Na2.2H2O

4,36 mg.
3,15 mg.
0,01 mg.
0,022 mg.
0,01 mg.
0,18 mg.
0,006 mg.

Solucin de vitaminas:
Cianocobalamina (B12)
Tiamina. HCl (B1)
Biotina (Vit. H)

0,5 mg.
0,1 mg.
0,5 mg.

Por cada litro de agua salada a ser enriquecida.


Medio Erdschreiber (1927).- Este medio es sencillo
y ha sido usado para algas unicelulares y macroalgas. Sirve para aislar y mantener algas. El agua salada y los aditivos son esterilizados por separado y luego combinados
aspticamente. El Fe.EDTA y otros metales traza junto

36

Medios de Cultivo

con las vitaminas pueden reemplazar al extracto de suelo.


Solucin bsica de nutrientes:
NO3Na
PO4HNa2
Extracto de suelo

100,30 - 199,75 mg.


7,90 - 19,80 mg.
50,00 ml.

Por cada litro de agua salada a ser enriquecida.

La tcnica de congelado-seco (freeze-drying) implica remover el agua o algn otro solvente de un producto
congelado a travs de un proceso llamado sublimacin,
que se d cuando un lquido congelado (cristales de agua
por ejemplo) pasa directamente al estado gaseoso sin pasar por el estado lquido. Los productos o materiales as
procesados no necesitan refrigeracin y pueden ser almacenados a temperatura ambiente.
Se conocen 3 mtodos de congelado-seco:

Preservacin de Cepas

1) Secado mltiple (manifold drying).

La liofilizacin:

2) Secado en un solo (batch drying).

El principal propsito de sta modalidad de preservacin (congelado-seco) es mantener los cultivos algales
en estado viable por largo tiempo, tenindose las siguientes ventajas para su aplicacin:

3) Secado en bulto (bulk drying).

Reduccin de tiempo, equipos y espacio fsico requerido para mantener colecciones, comparado con las
formas rutinarias de transferencia.
Estabilidad gentica de las especies preservadas por
largo tiempo.
Los cultivos liofilizados no requieren refrigeracin
para su almacenaje.
Cuando se congelan, pasan por bajas temperaturas y
son liofilizadas, las clulas son expuestas a una secuencia de stress de tipo fsico y qumico.Cualquiera de ellos
pueden hacer perder viabilidad a las clulas.
Entre los daos que pueden sufrir estn:
1) Alteracin de los procesos metablicos debido a
los efectos causados por el diferencial de temperatura
sobre las mltiples reacciones enzimticas.
2) La formacin de los cristales de hielo someten a
las clulas a un stress fsico, especialmente si el grado de
congelamiento es demasiado rpido.
3) El aumento de los cristales de hielo intracelulares
producen una difusin del agua fuera de las clulas, generando su deshidratacin.
4) La deshidratacin genera un incremento de las
concentraciones de sales en la clula, con la consiguiente
desnaturalizacin de proteinas, solubilizacin de
lipoproteinas y alteracin de la permeabilidad de la membrana.
5) El descongelamiento de una muestra y su retorno
a la temperatura ambiente expone a las clulas a efectos
que pueden resultar letales, como cambiar las concentraciones de electrolitos (molculas) o por efectos de la temperatura alterar el grado de reaccin enzimtica.
Se requieren equipos especiales para ste proceso y
estn disponibles para operar tanto a escala de laboratorio como industrial.

Su uso depende del producto final y de la configuracin deseada. Para las algas el primero y segundo son los
mtodos ms requeridos y convenientes.
Toda la tcnica implica 3 pasos a saber :
Precongelado. La coleccin de algas es adecuadamente precongelada. Durante sta fase se forman los
eutticos (solutos que se congelan a una temperatura menor que la del agua circundante). Una vez formados los
eutticos, toda la suspensin se va volviendo viscoza a
medida que la temperatura baja. Finalmente el producto
se congela formando un slido (hielo) de caractersticas
de vidrio. En sta condicin es muy dificil obtener una
liofilizacin.
Primer secado. El hielo debe ser removido del producto congelado (coleccin de algas) va sublimacin, resultando en un producto seco y estructuralmente intacto.
Este paso requiere de un alto control de la temperatura y
la presin de vapor de dicho producto.
Es importante que la temperatura en la cual el producto es congelado-seco est balanceada entre la temperatura que mantiene la integridad del congelamiento del
producto y la temperatura que maximiza la presin de
vapor del producto. Este balance es clave para un secado
ptimo.
Debe crearse la condicin que asegure el libre flujo
de las molculas de agua desde el producto; es por sto
que una bomba de vaco (vacuum pump) es necesaria en
un sitema de congelado-seco para evacuar el ambiente que
circunda el producto.
Otro aparato indispensable es el condensador (cold
trap), usado para colectar la humedad que sale del producto congelado. La bomba de vaco remueve todos los
gases que no son condensables y el condensador captura todos los gases condensables, como las molculas de
agua por ejemplo.
La presin de vapor del producto asegura la
sublimacin del agua (molculas de vapor) desde el producto congelado al condensador. El diferencial de la presin de vapor entre el producto y el condensador permite

Henry G. Alvarez Arellano

el movimiento de las molculas fuera del producto; sin


embargo, la temperatura del condensador debe ser mucho
ms baja que la del producto.
Tabla VIII
Relacin de temperatura/presin de vapor
Temp. (grados centgrados)
0
-10
-20
-30
-40
-50
-60
-70
-80

Presin (mm de Hg)


4.579
1.950
0.776
0.286
0.097
0.027
0.008
0.0019
0.0004

El tercer componente esencial en el congelado-seco


es la fuente de calor que tiene que ser aplicada al producto
para asegurar la salida del agua en forma de vapor desde
el producto congelado. Una forma comn de aplicar calor
es usando el ambiente directamente a las cmaras de secado (manifold drying). Las cmaras portan las fiolas, tubos o ampollas que contienen el producto (algas) a ser
liofilizado.
Segundo secado. Completado el primer secado y una
vez que todos los cristales de hielo han sido sublimados,
la humedad de enlace est an presente en el producto. Se
trata de la humedad residual que puede estar entre un 78%.
Un secado contnuo se necesita bajo una temperatura
ms tibia de la anterior a fin de eliminar la humedad residual. Este proceso se conoce como disorcin isotrmica.
El segundo secado se hace a temperatura mayor que la del
ambiente por ser compatible con la sensitividad del producto.
El vaco debe ser lo ms bajo posible y la temperatura del condensador la ms fra que se pueda lograr.
Todo ste proceso toma medio tiempo del requerido
para el proceso anterior.
Miscelnea de preguntas
1.- Explique por qu se usa el agar en la solidificacin
de medios de crecimiento y cul es su principal ventaja?
2.- Explique en forma breve los pasos a seguir en la esterilizacin con autoclave.
3.- Si recuerda nombre el compuesto qumico que forma el stock II en la solucin de macronutrientes del
medio Beijerinck.
4.- Cules son las caractersticas del suelo para obtener

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un buen extracto ?
5.- En qu concentracin participa el cloruro de hierro
en la frmula Chu No. 10 ?
6.- En forma breve describa los pasos para una buen lavado de vidriera.
7.- Describa el mtodo general de preparacin de agua
salada enriquecida.
8.- Cmo evita el problema de la precipitacin del
silicato antes de agregarlo al medio ?
9.- Cul es la concentracin del nitrato de sodio en el
medio f/2 Guillard ?
10.- Qu es la disorcin isotrmica ?
Bibliografia de consulta:
1) Handbook of Phycological Methods, Culture Methods
and Growth Measurements. Janet R. Stein. 1973.
2) Culture of Phytoplankton for Feeding Marine
Invertebrates. Robert R. Guillard. 1971.
3) Tecnologa de Cultivo de Microalgas. Eduardo Uribe
T. 1992.
4) Rotifer and Microalgae Culture Systems. Wendy Fulks.
Kevan L. Main. 1991.