02-11 Identificacion de Virus Dengue en Poblaciones Naturales de

IDENTIFICACION DE VIRUS DENGUE EN POBLACIONES NATURALES DE
Aedes aegypti DEL MUNICIPIO DE BELLO, ANTIOQUIA
Estudiante:
Laura Silvana Prez Restrepo
Asesor:
Idalyd Fonseca Gonzlez, M.Sc, Dr.Sc.
Profesor Asistente
INSTITUTO DE BIOLOGIA
FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES
UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA
MEDELLIN, OCTUBRE 2011

Aedes aegypti DEL MUNICIPIO DE BELLO, ANTIOQUIA.
El camino hacia una vida productiva,

llena de felicidad y xito comienza cuando
logramos que nuestras acciones sean
congruentes con nuestros valores y
principios.
Benjamn Franklin

DEDICATORIA
A mi Dios a quien le debo mi vida, gracias por iluminar mi camino y por todas las
bendiciones que me llegan cada da. A mi abuela, que aunque ya no est con nosotros, llen
mi vida de bellas enseanzas, gracias por brindarme todo el amor y ternura, por ensearme
a vivir y por hacerme la mujer que soy ahora.

AGRADECIMIENTOS
Nuevamente le doy gracias a mi Dios por su eterno amor y compaa, por las mil cosas
maravillosas que me proporciona cada da.
A mis padres Deisy Restrepo y Ruben Prez, por su compaa, amor, comprensin,
enseanzas y por la fe que tienen en m y el apoyo que me han brindado toda mi vida.
A mi asesora de tesis la Dra. Idalyd Fonseca por brindarme esta oportunidad y el apoyo
para hacer que mi sueo de ser biloga se haga realidad.
A Julin Mosquera por estar siempre a mi lado en esta etapa de mi vida apoyndome y
brindndome sus consejos, amor y comprensin.
Al Instituto de Biologa de la Universidad de Antioquia en cabeza del Dr. Nicols Jaramillo
por ayudarme en mi formacin de pregrado.
Al Dr. Omar Triana por abrirme las puertas del grupo BCEI para realizar mi tesis y por
apoyar mi trabajo.
A Jos Usme Ciro por sus brindarme sus consejos, amistad y su ayuda.
A mis compaeros del grupo BCEI por su ayuda, por el conocimiento que me brindaron,
sus crticas constructivas, por estar pendientes de mi. En especial a Sebastin, Victor,
Nelson, Dahyana, Edilson, Laura, Yoman y Santiago.
A Duver y Sair por apoyarme y ayudarme en todo lo relacionado con el laboratorio y por
brindarme su amistad.
A la Universidad de Antioquia por brindarme, tantos espacios educativos y de formacin, a
todos mis profesores del pregrado en especial al profesor Omar Ocampo Jimnez por
ensearme a ver la biologa con dedicacin y a Silvia por ayudarme con todas los asuntos
administrativos.
A mis compaeros del pregrado en biologa en especial a Andrea, Cristina, Sara, Edwin,
Rafa, Andrs, Laura Rueda y Ana, por brindarme esa amistad tan maravillosa y por estar
siempre pendientes de mi.
A mi familia materna y paterna por apoyarme y darme tantos consejos.
A los funcionarios de la Direccin Local de Salud de Bello por ayudarme en la coleccin
del material biolgico y por su comprensin.

Tabla de contenido
1. RESUMEN ......................................................................................................................... 9
2. ANTECEDENTES ........................................................................................................... 10
2.1 FIEBRE POR DENGUE EN EL MUNDO ................................................................ 10
2.2 FIEBRE POR DENGUE EN LAS AMERICAS ........................................................ 12
2.3 FIEBRE POR DENGUE EN COLOMBIA ................................................................ 13
2.4 BIOLOGIA DE A. aegypti.......................................................................................... 14
2.4.1 CICLO DE VIDA DE A. aegypti ......................................................................... 16
2.5 Biologa del DENV ..................................................................................................... 18
2.5.1 Estructura y composicin del DENV ................................................................... 19
2.5.1 Protenas estructurales del DENV ........................................................................ 20
2.5.2 Protenas no estructurales del virus ...................................................................... 21
2.6 Prevencin y control de la fiebre por dengue ............................................................. 24
2.6.1 Vigilancia virolgica ............................................................................................ 24
2.6.2 Vigilancia entomolgica ...................................................................................... 25
2.6.3 Control vectorial................................................................................................... 25
3. DEFINICIN DEL PROBLEMA .................................................................................... 27
4. HIPTESIS: ..................................................................................................................... 30
5. OBJETIVOS: .................................................................................................................... 30
6. JUSTIFICACIN ............................................................................................................. 31
7. METODOLOGIA............................................................................................................. 33
7.1 AREA DE ESTUDIO ................................................................................................. 33
7.1.1 Ubicacin del municipio de Bello ........................................................................ 33
7.1.2 Caractersticas del municipio de Bello ................................................................. 34
7.2 Coleccin del material biolgico ................................................................................ 34
7.3 Extraccin y purificacin de ARN .............................................................................. 35
7.4 Cuantificacin de ARN ............................................................................................... 35
7.5 Identificacin de DENV y serotipos de DENV .......................................................... 35
7.5.1. Reaccin en cadena de la polimerasa con transcripcin reversa (RT-PCR) ....... 36
7.6 Visualizacin de fragmentos virales ........................................................................... 37

7.7 Determinacin de la tasa mnima de infeccin viral en mosquitos ............................ 37

8. RESULTADOS ................................................................................................................ 38
8.1 Coleccin del material biolgico ................................................................................ 38
8.2 Identificacin de los especmenes ............................................................................... 39
8.3 Anlisis gentico ......................................................................................................... 39
8.3.1 Extraccin de ARN .............................................................................................. 39
8.3.2 Cuantificacin del ARN ....................................................................................... 40
8.3.3 Evaluacin de la integridad del ARN................................................................... 40
8.3.4 Identificacin de DENV y serotipos .................................................................... 41
8.3.5. Determinacin de la mnima concentracin. ....................................................... 41
9. DISCUSIN ..................................................................................................................... 44
10. CONCLUSIONES .......................................................................................................... 47
11. PERSPECTIVAS ........................................................................................................... 48
12. BIBLIOGRAFIA. ........................................................................................................... 49

Lista de figuras
Figura 1 Pases y reas con riesgo para la transmisin de dengue 2008
Figura 2 Ciclo de transmisin de los DENV
Figura 3 Ciclo de vida de A. aegypti
Figura 4 Representacin esquemtica del virin maduro, E: envoltura proteica, M: protena
asociada a membrana, C: protena core
Figura 5 Genoma de los DENV. Se representa el marco de lectura abierto flanqueado por
dos regiones no traducidas, codifica para 3 protenas estructurales: C, M y E, y 7 protenas
no estructurales (NS): NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b y NS5
Figura 6 Mapa del municipio de Bello (Antioquia) mostrando su divisin administrativa en
10 comunas
Figura 7 Gel de agarosa al 1% teido con bromuro de etidio mostrando la amplificacin
del gen ribosomal AAS7. M: machos; H: hembras; El numero indica la cantidad de
mosquitos por pool; CN: control negativo; la flecha indica el tamao de la banda
amplificada (300pb)
Figura 8 Gel de agarosa al 1% teido con bromuro de etidio mostrando la amplificacin de
los serotipos DENV-2 (carril 2: 362 pb), DENV-3 (carril 3: 265 pb) y DENV-4 (carril 4:
426 pb); Carril 5: muestra positiva correspondiente al serotipo DENV-3.
Figura 9. Gel de agarosa al 1% teido con bromuro de etidio mostrando la amplificacin
de las diluciones seriadas realizadas para determinar la sensibilidad de la RT-PCR.

Lista de tablas
Tabla 1 Secuencias nucleotdicas, posiciones consenso (DV1) y primers de tipo especfico
(DSP1-4) para la identificacin de los serotipos virales
Tabla 2 Barrios muestreados en Bello y la comuna a la que pertenecen
Tabla 3 Distribucin de mosquitos en pools y total de pools

1. RESUMEN
La fiebre por dengue (FD) y su complicacin ms frecuente, la fiebre hemorrgica por
dengue (FHD) son, en Colombia, la enfermedad transmitida por vectores ms prevalente
despus de la malaria. Esta arbovirosis es una patologa de alto poder epidmico que en los
ltimos aos se presenta en ms del 80% del territorio colombiano, debido principalmente a
la extensa dispersin del vector A. aegypti. Dado el cada vez ms creciente nmero de
casos confirmados de FD/FHD, es fundamental la vigilancia epidemiolgica permanente, y
como parte de esta, la vigilancia virolgica incluyendo la identificacin del virus tanto en
las poblaciones humanas como en los mosquitos en reas endmicas, con el fin de controlar
y prevenir epidemias, disminuyendo el riesgo de infeccin con el virus dengue (DENV).
La deteccin temprana de los casos con la identificacin del serotipo circulante, unida al
monitoreo entomolgico representan indiscutiblemente la forma ms eficaz de evitar brotes
epidmicos; Considerando que la introduccin de nuevos serotipos en las poblaciones
humanas susceptibles es uno de los mayores factores de riesgo para la emergencia de brotes
y epidemias de FHD, y que en el municipio de Bello (Antioquia) se registra co-circulacin
de al menos dos serotipos virales y casos confirmados de FHD, el objetivo de nuestro
estudio fue identificar la presencia del DENV en poblaciones naturales de adultos del
mosquito vector A. aegypti en el rea urbana del Bello, mediante la estandarizacin de la
reaccin en cadena de la polimerasa con transcripcin reversa (RT-PCR), empleando
primers especficos para la regin NS3 del DENV. La coleccin del material biolgico se
realizo durante los levantamientos de ndices adicos realizados en compaa del personal
de la Direccin Local de Salud de este municipio. De todo el material colectado (1182
larvas y 52 adultos), fue posible identificar la presencia del serotipo DENV-3 en dos
hembras de A. aegypti capturadas durante un brote epidmico de 2009 en el barrio Perz, de
la comuna Suarz; este serotipo DENV-3 estuvo co-circulando con los otros 3 serotipos en
Antioquia entre el 2009 y 2010 segn los registros confirmados en aislados humanos. Lo
anterior apoya la posibilidad de que el virus puede mantenerse activo en la poblacin de
insectos durante los periodos no epidmicos permitiendo la aparicin permanente de casos
de FD y aumentando la probabilidad de ocurrencia de FHD en el municipio de Bello. Estos
resultados confirman que la tcnica molecular empleada es especfica para DENV y
sensible al detectar 0.2ng/ul de virus. Aunque la tasa mnima de infeccin en este estudio
fue de 1.621, a futuro esto puede aumentar si se realizan estrategias de bsqueda de
vectores focalizadas en los lugares con mayor infestacin larvaria y reportes de casos de
FD/FHD. La vigilancia virolgica en las poblaciones de mosquitos es una herramienta til
en la prediccin de epidemias y debera, en los casos en que sea posible, incluirse en la
vigilancia epidemiolgica.
Palabras clave: Aedes aegypti, virus dengue, serotipo, vigilancia, Colombia.

2. ANTECEDENTES
2.1 FIEBRE POR DENGUE EN EL MUNDO
La fiebre por dengue (FD) es una enfermedad viral, de carcter endmico-epidmico,
transmitida por mosquitos del gnero Aedes, principalmente por Aedes aegypti (Linnaeus
1762), que hoy constituye la arbovirosis ms importante a nivel mundial en trminos de
morbilidad, mortalidad y afectacin econmica (Henchal EA y Putnak JR, 1990).
Esta enfermedad se caracteriza por fiebre bifsica, cefalea, dolor generalizado, postracin,
erupcin, linfadenopata y leucopenia. La ms seria complicacin de la FD es la fiebre
hemorrgica por dengue (FHD), caracterizada por anomalas de hemostasia y el aumento de
la permeabilidad vascular, resultando algunos casos en un sndrome de choque
hipovolmico denominado Sndrome de Choque por Dengue (SCD)(WHO, 1975).
El dengue tambin es capaz de expresarse mediante las llamadas formas atpicas que son
relativamente infrecuentes y resultan de la afectacin particularmente intensa de un rgano
o sistema: encefalopata, miocardiopata o hepatopata por dengue, entre otras (Martnez E,
1995; Martnez E, 1997).
Desde el ao 1997, el virus del dengue (DENV) y su principal vector, el mosquito A.
aegypti presentan distribucin mundial con ms de 2,5 billones de personas viviendo en
zonas endmicas y un registro anual de cerca de 100 millones de casos de FD y varios
cientos de miles de casos de FHD, dependiendo de la actividad epidmica (Gubler DJ,
1998).
El DENV es miembro de la familia flaviviridae; est constituido por cuatro serotipos de un
virus ARN que son serolgicamente diferenciables (DENV 1, 2, 3 y 4) y que comparten
analogas estructurales y patognicas, por lo que cualquier ser humano puede producir las
formas graves de la enfermedad sin presentar inmunidad cruzada; Las personas que viven
en reas endmicas pueden infectarse con cualquiera de los cuatro serotipos de DENV y
adems pueden presentarse infecciones por dos serotipos simultneamente (Wang WK et
al., 2003), lo cual determina la importancia de la identificacin del serotipo y el genotipo de
la cepa infectante en relacin con el desarrollo de la enfermedad.
La virulencia viral y la respuesta inmune son considerados los dos mayores factores en la
patognesis de la FHD. Actualmente se considera la hiptesis de infeccin secundaria
como la principal causa del incremento en el nmero de casos de FHD y SCD en el mundo
(Guzmn MG et al., 2007).
10

La inmunidad que deja la infeccin por cada uno de los serotipos virales es duradera,
probablemente de por vida y se expresa por la presencia de anticuerpos (Ac) neutralizantes
hemotpicos. No existe inmunidad cruzada de serotipos, excepto durante las primeras
semanas o algunos meses despus de la infeccin (Martnez, 1998). Sin embargo, cuando
una persona tiene Ac neutralizantes contra uno de los DENV y se infecta con otro serotipo,
se produce una respuesta exclusiva de la infeccin por DENV llamada amplificacin
dependiente de anticuerpos (ADA) que es aumento de la viremia, lo cual condiciona y
favorece el desarrollo de la forma grave de la enfermedad (Guzmn MG et al., 1992;
Halstead, 2002).
En las ltimas 4 dcadas el DENV emergi como el mayor problema de salud en muchas
reas tropicales y subtropicales en el mundo, especialmente en las reas urbanas donde el
virus se mantiene y en el cual el hombre es el principal reservorio y el mosquito A. aegypti,
el principal vector (Morier, L. et al., 2000). Ahora hay un resurgimiento mundial con una
expansin de la distribucin geogrfica tanto de los mosquitos vectores como de los virus
(figura 1), adems de la aparicin de FHD en nuevos pases (Gubler DJ, 1997).
Comparando con nueve pases reportados en 1950, hoy la distribucin geogrfica del
DENV incluye ms de 100 pases en todo el mundo. Muchos de estos no haban reportado
FD/FHD en ms de 20 aos y algunos no presentan antecedentes de la enfermedad.
Comparado con los reportes de la dcada de 1950, el dengue se ha convertido en una de las
principales causas de mortalidad infantil en varios pases de Asia y de Amrica del Sur
(Guha-Sapir y Schimmer B, 2005).
Los factores responsables por el dramtico resurgimiento y emergencia de las epidemias de
FD/FHD como problemas de salud pblica global aun no se entienden completamente
(Gubler DJ y Clark GG, 1995); Se sabe que casi la mitad de la poblacin mundial est en
riesgo de sufrir esta infeccin por habitar en reas tropicales y subtropicales. As mismo, el
incremento del transporte areo (mecanismo ideal para transportar los DENV a zonas
urbanas) durante el cual ms de 400 millones de viajeros de Europa y Norteamrica cada
ao cruzan las fronteras y regresan a sus pases procedentes de zonas endmicas en Asia,
frica y Amrica Latina. Adems se sugiere que el resurgimiento de la FD est
estrechamente relacionado con los cambios sociales y demogrficos de los ltimos 50 aos.
La decadencia en las infraestructuras de los sistemas de salud pblica de los pases en
desarrollo durante los ltimos 30 aos (Gubler DJ, 1998), la vivienda deficiente, el
hacinamiento, la disponibilidad de depsitos de agua, la ausencia de sistemas de
alcantarillado y sistemas deficientes de manejo de residuos asociados con la urbanizacin
no planeada han creado condiciones ideales para el incremento en la transmisin de la
FD/FHD en los centros urbanos de las zonas tropicales (TDR, 2006). A todo esto se le
11

suma la falta de implementacin de un control efectivo del mosquito en reas donde el

dengue es endmico. El control vectorial es hasta ahora es la nica estrategia de prevencin
de la FD/FHD y la forma ms efectiva de controla la transmisin de los DENV mediante el
uso de adulticidas y larvicidas; Lamentablemente, el desarrollo de resistencia a insecticidas
y la falta de mtodos integrados de control han disminuido la efectividad del control
qumico.
2.2 FIEBRE POR DENGUE EN LAS AMERICAS

Los cambios epidemiolgicos en las Amricas han sido muy dramticos. Durante los aos
1960s dos pandemias de dengue afectaron al Caribe y Venezuela. La primera epidemia
declarada en 1963, fue causada por el DENV-3 y azot el Caribe despus de casi 20 aos
de inactividad, en zonas como Jamaica, Puerto Rico, las islas de las Antillas menores y
Venezuela. La segunda epidemia ocurri en el Caribe y Venezuela entre 1968 y 1969 y los
serotipos circulantes fueron DENV-2 y DENV-3 (PAHO, 1997). Durante los aos 1960s
estos dos serotipos causaron grandes epidemias en Colombia donde no se haba observado
dengue desde 1951. Luego en los aos 1980s cinco pases sudamericanos (Brasil, Bolivia,
Paraguay, Ecuador y Per) que no haban sufrido por el DENV anteriormente o que se
haban visto libres del virus por varios decenios, padecieron epidemias explosivas a causa
del DENV-1. En 1993 los ltimos dos pases latinoamericanos tropicales, Costa Rica y
Panam los cuales se haban visto libres de dengue por varios decenios, informaron sobre
casos de transmisin indgena de dengue, con el serotipo DENV-1. En los aos 1980s, la
introduccin de nuevas cepas y serotipos del virus produjo grandes epidemias de FD en las
Amricas. Varios pases de la regin cambiaron su estatus de no endmicos o
hipoendmicos (un solo serotipo presente) a hiperendmicos (mltiples serotipos
presentes), lo que llev a la emergencia de epidemias de FHD con un patrn
epidemiolgico semejante al visto 25 aos antes en el sudeste asitico (Gubler DJ, 1987).
El primer brote de FHD reportado en las Amricas ocurri en 1981 en Cuba; durante esta
epidemia se notific un total de 344.203 casos de dengue, de los que 10.312 se clasificaron
como graves por la OMS y 158 fueron mortales; este brote de FHD es el acontecimiento
ms importante de la historia del dengue en las Amricas. Ya que despus de este, todos los
aos, excepto en 1983, se informa en todo el continente americano sobre casos confirmados
de FHD.
Actualmente, la FD es endmica en casi todos los pases de la regin de las Amricas,
presentando brotes cclicos cada 3 a 5 aos, siendo cada ao epidmico mayor que el
precedente. Los cuatro serotipos del DENV circulan en la regin. En el periodo 20012007, ms de 30 pases de las Amricas notificaron un total de 4.332.731 casos de FD,
12

106.037 casos de FHD y una tasa de letalidad de 1,2% (OPS, 2008). Solo en el 2008, se
report un total de 1.050.590 casos de FD, incluyendo 38.066 casos de FHD y 554
defunciones (OMS, 2009). Hasta la semana epidemiolgica 31 del 2011 se han notificado
en la Regin de las Amricas un total de 890.756 casos de dengue, incluido 10.840 casos de
dengue grave y 488 defunciones por dengue (PAHO, 2011).
Figura 1: Pases y reas con riesgo para la transmisin de dengue 2008. Fuente:
http://www.mosquitaire.com/cms/website.php?id=/en/tigermosquitos/dengue.htm
2.3 FIEBRE POR DENGUE EN COLOMBIA

En Colombia la FD es endmica en casi todos los asentamientos humanos ubicados por
debajo de los 1.800 msnm. A. aegypti es el principal transmisor del dengue en Colombia y
se encuentra distribuido en el 80% del territorio colombiano (MPS, 2006). Durante los
aos 1960s, los serotipos DENV-2 y DENV-3 causaron grandes epidemias de FD; la
primera, ocurri entre 1971 y 1972, y fue ocasionada por DENV-2, mientras que la de
1975-1977 se dio por DENV-3. En diciembre de 1989 se registr el primer caso de FHD en
Puerto Berrio (Antioquia); desde ese momento se observa en Colombia una tendencia
rpida al incremento en el nmero de casos, al pasar de 5.2 casos por cada 100.000
habitantes en la dcada de los 1990s a casi 18.1 casos por cada 100.000 habitantes en los
ltimos siete aos (INS, 2010). Los departamentos que histricamente presentan mayor
transmisin de dengue en el pas son: Atlntico, Santander, Norte de Santander, Valle del
13

Cauca, Antioquia, Tolima, Huila, Casanare y Cundinamarca, entre ellos se distribuye ms

del 60% de los casos notificados anualmente en lo que ha transcurrido del presente siglo.
Hasta la semana epidemiolgica No. 37 del 2011 se han notificado en el Sistema de
Vigilancia de Salud Pblica (SIVIGILA) del Instituto Nacional de Salud: 24.408 casos
totales de dengue (23.408 casos FD y 1066 de FHD) y se han reportado 276 muertes
confirmadas (PAHO, 2011). Este problema de salud pblica es debido a mltiples factores
entre estos la reemergencia e intensa transmisin viral con tendencia creciente, el
comportamiento de ciclos epidmicos cada vez ms cortos, el aumento en la frecuencia de
brotes de FHD y otras formas graves de la enfermedad, la circulacin simultnea de los
cuatro serotipos, la infestacin por A. aegypti en ms del 90% del territorio nacional situado
por debajo de los 2200 msnm, y la urbanizacin de la poblacin por problemas de violencia
en el pas, pone en riesgo a aproximadamente 25 millones de personas que habitan en zonas
urbanas con transmisin de esta enfermedad. El comportamiento epidemiolgico de la
enfermedad en las ltimas dcadas es ascendente, caracterizado por aumento exponencial
de las reas endmicas en las diferentes dcadas. Su comportamiento cclico se caracteriza
por picos epidmicos cada tres o cuatro aos, relacionados con el reingreso de nuevos
serotipos al pas (Root H, 1980).
2.4 BIOLOGIA DE A. aegypti
A. aegypti es un mosquito cuyo origen se ubica en la regin etipica, que nuclea la mayor
cantidad de especies del subgnero Stegomyia Theobald, 1901, de la cual hace parte este
culcido; en el frica este mosquito es una especie silvestre, y ancestralmente desde all
inici una dispersin pasiva, que lo llev a convertirse en un mosquito cosmopolita. Est
presente en la mayor parte de las reas tropicales o subtropicales comprendidas entre los
45 de latitud norte y los 35 de latitud sur, en las zonas isotermales intermedias a los 20C
(Agrelo SR, 1996). Sin embargo, la naturaleza domstica de esta especie probablemente
ejerza ms influencia en la distribucin mundial que el clima o las variables climticas. A.
aegypti est estrechamente relacionado con los asentamientos humanos y se encuentra
fcilmente entre los edificios o casas para poder as alimentarse de los humanos y descansar
(Jansen CC y Beebe NW, 2010).
Los hbitos del mosquito son netamente antropoflicos y domsticos, con radicacin de
criaderos en la vivienda o su peridomicilio. Depsitos de agua ubicados en objetos o
construcciones como neumticos, bateras viejas, recipientes de todo tipo, botellas, floreros
y piletas, entre otros, le sirven a A. aegypti para establecer sus criaderos en agua limpia, con
bajo tenor orgnico y de sales disueltas, mediante la puesta de huevos en la superficie del
recipiente a la altura de la interfase agua-aire (Agrelo SR, 1996). La hembra del mosquito
se alimenta durante el da con un alto pico de actividad en la maana y en el atardecer.
14

Ellas vuelan en sentido contrario al viento, desplazndose mediante lentas corrientes de

aire, siguiendo los olores y gases emitidos por el husped. Cuando estn cerca de los
asentamientos humanos utilizan estmulos visuales para localizar al husped mientras sus
receptores tctiles y trmicos las guan hacia el sitio de alimentacin. El propsito
primordial de la alimentacin sangunea es proporcionar una fuente de protenas para el
desarrollo de los huevos. El hospedero infectado transmite el virus al mosquito y entre 8 10 das el virus se replica, primero en el epitelio intestinal y posteriormente a travs de la
hemolinfa se disemina a otros tejidos como los ganglios nerviosos, cuerpo graso, cerebro,
esfago y glndulas salivales del mosquito hembra, el cual permanece infectado y
asintomtico toda su vida (Martnez E, 2004; Snchez VL, 2006). Los ttulos virales ms
altos ocurren entre los 7-10 das postinfeccin en el intestino medio y entre los 7-17 das en
el abdomen. Ttulos virales altos en cabeza y glndulas salivales se detectan entre los 12-18
das despus de la infeccin (Salazar MI et al., 2007). Luego de 7 a 14 das de incubacin
en el mosquito (periodo extrnseco de incubacin), el genotipo del virus y factores
ambientales como humedad y temperatura, el mosquito puede infectar a un humano
susceptible (Gubler DJ, 1998; Rice CM, 1996; Salazar MI et al., 2007) (Figura 2).
Figura 2: ciclo de transmisin de los DENV

Tomado de: http://www.diariodeciencias.com.ar/imagenes/transmission-ofdengue.JPG&imgrefurl
Los mosquitos A. aegypti de diferentes orgenes geogrficos presentan diferencias en la
susceptibilidad a la infeccin con el DENV (Gunther J et al., 2007). Aunque la transmisin
horizontal (humano-mosquito) es la ms frecuente, existen reportes de transmisin vertical
o transovarica (donde la hembra infectada es capaz de transmitir el virus a su progenie)
experimental (Rosen L et al., 1983) y natural (Hull B et al., 1984). La presencia del DENV
fue demostrada en cerca del 40% de larvas y progenie de hembras de A. albopictus
infectadas oralmente con DENV-2 (Gonalves CM et al., 2004) y en hembras de A. aegypti
15

inoculadas intratorxicamente con DENV-3 (Joshi V et al., 2002). Factores como el

serotipo y la cepa del virus, la especie del mosquito y la lnea de A. aegypti (con alta o baja
susceptibilidad al DENV) afectan este mecanismo de infeccin (Agrelo SR, 1996; Kautner
I et al., 1997).
Algunos estudios sugieren que aunque la transmisin vertical ocurre a una muy baja tasa
para casi todos los arbovirus, esta puede ser un factor importante en la prevalencia y
mantenimiento del DENV en la naturaleza (Gunther J et al., 2007). Fouque F et al., (2004)
encontraron larvas de A. aegypti en plantas que estaban localizadas a 30km del
asentamiento humano ms cercano en la Guinea Francesa respaldando la idea que estas
larvas pudieron haberse infectado verticalmente y ser un reservorio para el DENV.
Adicionalmente, se ha registrado que en regiones con temporadas secas de 3-6 meses, la
alta resistencia a la desecacin que presentan los huevos del mosquito podra contribuir al
mantenimiento de algunos arbovirus como el virus de la fiebre amarilla y el DENV (Kuno
G y Chan GJ, 2005).
Un estudio en Asia mostr evidencias de cambios en los hbitats entre los dos principales
vectores del DENV en el cual A. aegypti se muestra mas exoflico y menos antropoflico
que A. albopictus (Gunther J et al., 2007), sugiriendo la ocurrencia de un intercambio entre
los ciclos urbano y selvtico, lo cual a su vez puede relacionarse indirectamente con la
transmisin vertical del DENV y su papel en la epidemiologia de la enfermedad.
2.4.1 CICLO DE VIDA DE A. aegypti

Son insectos de metamorfosis completa (holometbolos), que durante su desarrollo
ontognico pasan por los estados de huevo, larva (con cuatro estadios larvales), pupa y
adulto (Figura 3).
Huevos: miden aproximadamente 1 mm de longitud, en forma de cigarro, son ms limpios
que los huevos de la mayora de las especies que se cran en recipientes. En el momento
de postura son blancos, pero muy rpidamente adquieren un color negro brillante. Son
fecundados durante la postura y el desarrollo embrionario se completa en 48 horas si el
ambiente es hmedo y clido, pero puede prolongarse hasta cinco das con temperaturas
ms bajas. Los huevos eclosionan en un lapso de 2 a 3 das. Despus de ese periodo, son
capaces de resistir la desecacin y las temperaturas extremas con sobrevidas de siete meses
a un ao. Una vez completado el desarrollo embrionario, un porcentaje reducido de huevos
pueden resistir largos perodos de desecacin, y pueden prolongarse por ms de un ao en
algunas ocasiones. La capacidad de resistencia a la desecacin es uno de los principales
16

obstculos para el control del mosquito y sta condicin, adems, permite transportarlos a
grandes distancias en recipientes secos.
Larvas: presentan un ciclo de cuatro estadios larvales, son netamente acuticas y como la
mayora de los insectos holometbolos, esta fase es el perodo de mayor alimentacin y
crecimiento. Se alimentan de material orgnico sumergido o acumulado en las paredes y el
fondo de recipientes, para lo cual utilizan las cerdas bucales en forma de abanico. Se
asemejan a otras larvas de mosquitos por la cabeza y el trax ovoide y el abdomen de nueve
segmentos. El segmento posterior del abdomen tiene cuatro branquias lobuladas para la
regulacin osmtica y un sifn para la respiracin en la superficie del agua. Las larvas son
fotosensibles. La duracin del desarrollo larval depende de la temperatura, la disponibilidad
de alimentos y la densidad de larvas en el recipiente. Los primeros tres estados se
desarrollan rpidamente, mientras que el cuarto demora ms tiempo con mayor aumento de
tamao y peso. En condiciones rigurosas el cuarto estado larval puede prolongarse por
varias semanas, hasta siete meses, previo a su transformacin en pupa. Las larvas de A.
aegypti pueden diferenciarse a simple vista de las larvas de otras especies por su sifn ms
corto que el de la mayora de los otros culcidos.
Pupas: La pupa es el ultimo estado acutico de A. aegypti; estas no se alimentan, presentan
un estado de reposo donde se producen importantes modificaciones anatmico-fisiolgicas
hasta la aparicin de los adultos. Reaccionan inmediatamente a estmulos externos tales
como vibracin y se desplazan activamente por todo el recipiente. Se mantienen en la
superficie del agua debido a su flotabilidad y sta propiedad facilita la emergencia del
insecto adulto. El perodo pupal dura de 1 a 3 das en condiciones favorables, con
temperaturas entre 28 y 32C. Las variaciones extremas de temperatura pueden rezagar este
perodo.
Adulto: Al emerger de la pupa, el insecto adulto permanece en reposo permitiendo el
endurecimiento del exoesqueleto y las alas. Dentro de las 24 horas siguientes a la
emergencia pueden aparearse inicindose la etapa reproductora del insecto. El
apareamiento en general se realiza durante el vuelo pero en algunas ocasiones se lleva a
cabo en una superficie horizontal o vertical. A. aegypti es un mosquito oscuro con bandas
blancas en las bases de los segmentos torsales y un caracterstico diseo en forma de lira en
el mesonoto (seccin del trax del mosquito). Las hembras son las nicas que succionan
sangre. Esta alimentacin sangunea es necesaria como fuente de protena para el desarrollo
de los huevos. La alimentacin sangunea y la postura se llevan a cabo principalmente
durante el da, especialmente durante las primeras horas o a la media maana y a media
tarde o al anochecer. Si una hembra completa su alimentacin (2 o 3 mg de sangre)
desarrollar y pondr aproximadamente 200 huevos, dispersos en distintos lugares. La
17

hembra grvida es atrada hacia recipientes oscuros o sombreados con paredes duras, sobre
las que deposita sus huevos y prefiere aguas relativamente limpias con poco contenido de
materia orgnica. El macho se diferencia de la hembra por sus antenas plumosas y sus
palpos ms largos. Sus partes bucales no estn adaptadas para chupar sangre por lo que se
alimentan de carbohidratos como el nctar de las plantas.
Figura 3: ciclo de vida de A. aegypti.

Tomado de:
http://ceibal.edu.uy/UserFiles/P0001/ODEA/ORIGINAL/101112_dengue_prevencion3.elp/
conociendo_al_aedes_aegypti.html
2.5 Biologa del DENV

Los DENV pertenecen al genero flavirirus que forma parte de la familia Flaviviridae. Los
flavivirus son 70 virus, mayormente transmitidos por artrpodos (arbovirus) y estn
clasificados en 10 grupos (o especies), entre ellos: Virus Dengue, Virus Encefalitis
Japonesa, Virus TBE (del ingls Tick-Borne Encephalitis), Virus Fiebre Amarilla, Virus
Modoc, Virus MBE (del ingls Mosquito-Borne Encephalitis), Virus Ntaya, Virus Ro
Bravo, Virus Uganda S y Virus Tyuleniy (Henchal EA y Putnak JR, 1990). Gran nmero
de estos son patgenos para el hombre, por lo que son los causantes de problemas de salud
18

pblica mundial. Todos los miembros de esta familia comparten los mismos antgenos
determinantes, lo que hace difcil la identificacin de cada virus por las tcnicas clsicas de
serologa.
El DENV incluye cuatro serotipos cercanamente relacionados pero antignicamente
diferentes; cada serotipo comprende varios genotipos que exhiben diferencias en sus
caractersticas de infeccin tanto en el mosquito vector como el humano hospedador
(Holmes EC y Twiddy SS, 2003).
2.5.1 Estructura y composicin del DENV
Los DENV se caracterizan por tener una cpside icosahdrica rodeada por una membrana
lipdica o envoltura, con un dimetro aproximado de 50 nm (Henchal EA y Putnak JR,
1990). En su interior contienen como genoma una molcula de ARN de cadena sencilla y
polaridad positiva de 10.7 kb. El genoma viral presenta la estructura cap en el extremo 5
y carece de poli(A) en el extremo 3terminal. El nico marco de lectura abierto est
flanqueado por dos regiones no traducidas, que codifica a las tres protenas estructurales: la
protena de la envoltura E, la protena asociada a la membrana M, y la protena de la
cpside C, y a las siete protenas no estructurales (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B y
NS5) (Linderbach BD y Rice CM, 2003) (Figura 4).
Figura 4: Representacin esquemtica del virin maduro, E: envoltura proteica, M:

protena asociada a membrana, C: protena core.
19

2.5.1 Protenas estructurales del DENV
El virin maduro contiene tres protenas estructurales: C, protena de la nucleocpside o

ncleo; M, protena asociada a la membrana y E, protena de la envoltura. Los virus
inmaduros contienen una protena conocida por prM; que es un precursor de M. Los genes
que codifican las protenas estructurales del DENV se encuentran en el extremo 5' del
genoma y comprenden un poco ms de una cuarta parte de la capacidad de codificacin del
ARN viral. El orden de los genes para las protenas estructurales del extremo 5' terminal es
C-prM(M)-E (Figura 5) (Henchal EA y Putnak JR, 1990).
La protena C es componente bsico de la nucleocpside, es el primer polipptido viral
sintetizado durante la traduccin y presenta un peso molecular de 13.5 kd. Es rica en
residuos de lisina y arginina los que le confieren un carcter altamente bsico que permite
su interaccin con el ARN viral, con el que forma la nucleocpside como componente
estructural. Esta protena est involucrada en funciones biolgicas de la partcula viral
como el tropismo celular, fusin de membranas e induccin de anticuerpos neutralizantes.
La infeccin con uno de los serotipos estimula la produccin de anticuerpos neutralizantes
primarios contra la envoltura de la protena, confirindole as larga vida inmune al serotipo.
La existencia de anticuerpos neutralizantes a un serotipo puede promover el ambiente de la
infeccin con otro serotipo. Este modelo anticuerpo-dependiente postula que la severidad
de la enfermedad es el resultado de anticuerpos heterlogos no neutralizantes los cuales
facilitan la infeccin del virus en clulas mononucleares durante una segunda infeccin con
un serotipo diferente (Lanciotti RS et al., 1992).
La prM (22 kb) es el precursor glicosilado de la protena estructural M (8 kb). La
separacin proteoltica de este precursor por una proteasa del aparato de Golgi, durante la
maduracin viral, es lo que da origen a la formacin de la protena M. Esta escisin parece
estar ligada a la liberacin del virus, pero no ocurre necesariamente en todas las molculas
proteicas presentes en la membrana viral, ya que en ocasiones aparece la protena M junto a
la prM en el virin maduro. Anticuerpos contra prM pueden mediar la inmunidad de tipo
protectora, quizs por la neutralizacin de los viriones liberados que contienen prM no
clivada.
La protena M madura es una protena de membrana extracelular o de virus maduros,
resultado de la protelisis de prM y la eliminacin de la porcin amino terminal. Est
estrechamente asociada a la envoltura lipdica. La formacin de protena M a partir de prM
parece crucial en la morfognesis del virus, lo que implica un incremento en la infectividad
y la reorganizacin de la estructura de la superficie viral. No obstante, a la fecha el papel de
la protena M en el virin no es bien conocido.
20

La protena E es una glicoprotena con un peso molecular entre 51 y 60 kD, es la

mayoritaria de la envoltura, glicosilada y la ms conservada; la fusin con la clula husped
es inducida a pH bajo. Est estrechamente asociada a la envoltura lipdica (Henchal EA y
Putnak JR, 1990). Se presenta como un homodmero en la superficie del virin maduro e
intracelularmente se puede encontrar como un heterodmero junto a la protena prM. La
protena E es el componente principal de las proyecciones de la superficie del virin
observadas por microscopa electrnica y contiene los determinantes antignicos
responsables de la neutralizacin del virus y la hemaglutinacin de eritrocitos, induciendo
respuesta inmunolgica en el husped infectado. Se ha propuesto que en ella estn
localizados la mayora de los marcadores moleculares para la patogenicidad (Leitmeyer KC
et al., 1999). La infeccin con uno de los serotipos estimula la produccin de anticuerpos
neutralizantes primarios contra la envoltura de la protena, confirindole as larga vida
inmune al serotipo. La existencia de anticuerpos neutralizantes a un serotipo puede
promover el ambiente de la infeccin con otro serotipo. En este modelo anticuerpodependiente, la severidad de la enfermedad es postulada a ser el resultado de anticuerpos
heterlogos no neutralizantes facilitando la infeccin del virus en clulas mononucleares
durante una segunda infeccin con un serotipo diferente (Lanciotti RS et al., 1992).
2.5.2 Protenas no estructurales del virus
Hasta la fecha se han identificado siete protenas no estructurales del virus (NS): NS1,
NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b y NS5 (Figura 5).
La protena no estructural NS1 es una glicoprotena de 48 kD que contiene dos seales del
tipo Asn -X-Ser/Thr, usadas para la adicin de carbohidratos; estos sitios parecen estar
conservados en todos los flavivirus. Puede estar en forma secretada y no secretada. Es
sintetizada en el retculo endoplsmico rugoso como una protena monomrica y en un
perodo corto se une formando un homodmero. Esta forma es ms hidrofbica y se
desconoce si el incremento de la hidrofobicidad es un resultado de la dimerizacin o alguna
modificacin postraduccional. Una vez formado este dmero, la glicoprotena es
transportada al aparato de Golgi donde sufre modificaciones y de aqu pasa a la superficie
celular, liberndose al medio extracelular (Perera R y Kuhn RJ, 2008). La funcin de la
NS1 en la replicacin viral no ha sido bien dilucidada. Se ha planteado que posee un papel
en la replicacin temprana. Basados en anlisis mutacional se ha relacionado con la
morfognesis viral. A su vez, mutaciones de esta protena afectan la virulencia de la
partcula viral. Tambin se relaciona con la respuesta inmune especfica de serotipo
(Henchal EA y Putnak JR, 1990).
La NS3 es la segunda protena en tamao, con un peso molecular entre 68 y 70 kD y se
encuentra asociada a la membrana. Es altamente conservada en los flavivirus y se piensa
que es un componente de la maquinaria enzimtica de la replicacin del ARN viral. La
21

comparacin de sus secuencias nucleotdicas y los anlisis bioqumicos sugieren que es

trifuncional, conteniendo actividad de proteasa (contra la poliprotena), de helicasa y de
ARN trifosfatasa trifosfato (formacin de la estructura 5' cap). Su extremo N terminal
contiene el dominio cataltico de la proteasa NS2b-NS3, parecido a la serina-proteasa de las
subfamilias de las tripsinas. Esta triada cataltica est conformada por His 51, Asp 75 y Ser
135. Se cree que la actividad proteoltica de esta enzima sea la responsable del corte de
NS2b, NS3, NS4a, NS5 y del extremo carboxilo de la protena C. En esta protena existen
regiones homlogas con la familia de las helicasas, as como un fragmento C terminal de 50
kD derivado de la protelisis, que tiene actividad ARN trifosfatasa y est involucrado en la
formacin de la estructura de la caperuza del extremo 5 del genoma del flavivirus (Xu T et
al., 2005).
Las protenas no estructurales como NS1 y NS3, son capaces de inducir una respuesta
inmune protectora en modelos murinos y, al no estar asociadas con partculas vrales libres
no hay riesgo que la infeccin sea potenciada por anticuerpos facilitadores. Esta
caracterstica las hace buenas candidatas para ser incluidas en el desarrollo de vacunas
contra el dengue (Antuano FJ y Mota J, 2000).
Las regiones hidrofbicas menos conservadas de la poliprotena del DENV son procesadas
en al menos cuatro protenas no estructurales adicionales (NS2a, NS2b, NS4a y NS4b).
Poco se conoce de las funciones de estas en el ciclo de vida de los flavivirus. Sin embargo,
se conoce que la NS2b, de 27 kD, junto con la NS3 forman un complejo esencial para el
procesamiento de todos los sitios de corte de las protenas no estructurales y las
estructurales (Henchal EA y Putnak JR, 1990).
La ltima protena codificada es la NS5, que es la ms grande de 103 a 104 kD, bifuncional
y una de las ms conservadas en los flavivirus. Es una protena bsica y se cree que
funciona como una ARN polimerasa dependiente del ARN, aunque no se ha verificado
directamente. Esto se basa en la presencia de una regin altamente conservada (YF NS5
666-668) caracterstica de este tipo de enzima presente en los virus ARN con cadena
positiva. Se ha sugerido que puede estar involucrada en la metilacin de la estructura de la
caperuza 5 terminal (Henchal EA y Putnak JR, 1990).
22

Figura 5: Genoma de los DENV. Se representa el marco de lectura abierto flanqueado por
dos regiones no traducidas, codifica para 3 protenas estructurales: C, M y E, y 7 protenas
no estructurales (NS): NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b y NS5.
23

2.6 Prevencin y control de la fiebre por dengue

La prevencin y control de la FD/FHD es cada vez ms necesaria conforme aumenta la
distribucin geogrfica de los mosquitos y de los virus as como el incremento en la
incidencia de la enfermedad. Desafortunadamente, las herramientas disponibles para
prevenir las infecciones por DENV son muy limitadas. Hasta la fecha no se dispone de
ningn medicamento especfico para el tratamiento de la FD/FHD y aunque se estn
desarrollando vacunas potencialmente eficaces para controlar los cuatro serotipos del virus,
tomar un tiempo antes de que estn licenciadas para su uso en salud pblica. Por el
momento, los mtodos ms efectivos para prevenir y controlar la FD/FHD son el
diagnstico inmediato de los casos de fiebre aunado al tratamiento clnico adecuado y la
reduccin del contacto humano-vector (Parks W y Lloyd L, 2004).
En Colombia la vigilancia epidemiolgica del dengue se basa en la vigilancia clnica
(sntomas y signos compatibles), serolgica (determinacin de anticuerpos IgM en suero de
pacientes), virolgica (aislamiento viral y determinacin del serotipo) y entomolgica
(ndices de infestacin larvaria y de adultos del vector) (Ospina M, 2004).
2.6.1 Vigilancia virolgica
El diagnstico del laboratorio es esencial para la confirmacin del dengue; este incluye
tcnicas de aislamiento e identificacin del virus, de diagnstico serolgico y de biologa
molecular (deteccin del ARN del dengue). La deteccin de antgenos virales en sueros
virmicos es necesaria para las investigaciones clnicas y epidemiolgicas y debe realizarse
rpidamente para implantar tempranamente el tratamiento anti-choque a los enfermos y la
deteccin precoz de un brote.
En diferentes investigaciones como se ha podido constatar que la viremia ocurre en la
etapa temprana del perodo febril del dengue y su eliminacin es cuando disminuye la
fiebre y aumentan los niveles de anticuerpos (Vaughn DW et al., 1997). Los primeros en
demostrar esto fueron Ashbur y Craig en una investigacin en Manila en 1906. Si bien los
estudios virolgicos de DENV son determinantes para la vigilancia de la enfermedad, la
capacidad instalada de laboratorios es limitada, la utilizacin de estos estudios debe ser
racional y oportuna, de acuerdo con la situacin especfica de cada regin y los objetivos y
necesidades de informacin del sistema de vigilancia virolgica.
24

2.6.2 Vigilancia entomolgica

Se emplea para determinar cambios en la distribucin geogrfica del vector, para obtener
mediciones relativas de la poblacin de vectores a lo largo del tiempo y para facilitar las
decisiones apropiadas y oportunas en lo referente a intervenciones. Puede servir para
identificar las zonas de alta densidad de infestacin o los periodos de aumento de las
poblaciones. En zonas donde el vector ya no est presente, la vigilancia entomolgica es
fundamental para detectar rpidamente nuevas introducciones antes que se generalicen y
sean difciles de eliminar. La vigilancia de la susceptibilidad de la poblacin de vectores a
los insecticidas tambin es parte integral de cualquier programa de control qumico
vectorial. En Colombia las actividades de vigilancia entomolgica del dengue son
realizadas por las autoridades locales de salud y en general se resumen en el levantamiento
clsico de ndices adicos.
2.6.3 Control vectorial
Saneamiento ambiental. Incluye estrategias para reducir los criaderos de mosquitos, tales
como el manejo de los recipientes de almacenamiento de agua (por ejemplo, cubiertas a
prueba de mosquitos para tinajas de almacenamiento de agua, partculas de poliestireno en
tanques de agua), abastecimientos de agua mejor diseados y fiables, y reciclaje de residuos
slidos, tales como neumticos desechados, botellas y latas.
Control biolgico. Uso de especies larvvoras como peces (Gambussia y Poecilia),
tortugas, algas del orden Chlorococcales, microsporidios y coppodos como Mesocyclops
longisetus. La estrategia ms difundida de control biolgico es el uso de la toxina del
Bacillus thuringensis var. Israelensis (Bti), el cual es un bacilo aerbico, Gram positivo,
flagelado, que forma esporas. Durante la biognesis se inicia la produccin de la toxina
denominada tambin cuerpo cristalino, endotoxina- delta o cuerpo parasporal.la propiedad
insecticida del cristal se manifiesta cuando es ingerido por la larva durante su alimentacin,
la pro-toxina se disuelve y activa (se convierte en toxina) por las proteasas y el pH alcalino
del intestino medio; la d-toxina se adhiere a las clulas epiteliales del intestino medio,
creando poros en la membrana intestinal y afectando al equilibrio de iones, y el tejido
pierde la capacidad de regular la permeabilidad. Como resultado, el intestino medio es
rpidamente inmovilizado, las clulas epiteliales se lisan, la larva deja de alimentarse, el pH
del intestino cae por la mezcla con la hemolinfa. Este pH bajo permite que las esporas
germinen y provoquen una septicemia y muerte de la larva. La muerte ocurre en 6 minutos
aproximadamente a altas concentraciones o a ms de 24 horas a bajas concentraciones de
Bti (Chui VWD et al., 1995).
25

Control qumico. Pese a que existen diversas estrategias de control, el control qumico
sigue siendo la forma ms efectiva en el control de brotes y epidemias de dengue. El uso de
insecticidas puede dividirse en dos mtodos principales: atacar a los mosquitos adultos
(adulticidas) y/o atacar sus formas inmaduras (larvicidas). Una falencia de este sistema es la
resistencia a insecticidas la cual ya ha sido detectada en algunas poblaciones colombianas
de A. aegypti, por lo que es fundamental la vigilancia peridica de la susceptibilidad de este
vector (WHO, 2006; Santacoloma L et al, 2010; Fonseca-Gonzlez I et al, 2011; Ocampo
CB et al, 2011)
Larvicidas. La finalidad de los larvicidas es matar los mosquitos en las etapas
inmaduras en los criaderos que se pueden destruir. Los efectos son duraderos pero necesitan
mantenimiento. El uso de larvicidas es comn en las zonas que no cuentan con un
suministro adecuado de agua potable, agua para baarse y para limpieza del hogar. A.
aegypti a menudo se desarrolla en contenedores para el almacenamiento de agua, por lo
cual los larvicidas deben tener poca toxicidad a mamferos y no deben cambiar
significantemente el sabor, olor o color del agua.
Adulticidas: Estos productos se encargan de matar los mosquitos en la etapa adulta,
lo cual se consigue generalmente con la nebulizacin del insecticida. El efecto es inmediato
y de corta duracin; al rociarlos, no duran ms que unos pocos minutos y solo son eficaces
contra los vectores adultos presentes. El rociamiento se recomienda solo durante las
epidemias para concentrarse en las hembras infectadas y lograr su eliminacin reduciendo
as la circulacin del virus en la comunidad.
Reguladores de Crecimiento de Insectos (IGRs). Son compuestos qumicos
similares a las hormonas que regulan el crecimiento en los insectos mediante la inhibicin
de sntesis de quitina y los anlogos a hormonas juveniles. Los reguladores del crecimiento
de los insectos, tanto juvenoides como ecdisoides, han sido muy utilizados en las ltimas
dcadas como una de las alternativas ms promisorias al uso de insecticidas
convencionales, con vistas al control de insectos que constituyen plagas tanto en la salud
pblica como en la agricultura. Esto es porque, en lo fundamental, son compuestos
biolgicamente especficos, no txicos al hombre y otros organismos beneficiosos,
biodegradables y menos propensos al desarrollo de resistencia por los insectos.
Participacin comunitaria. La cooperacin de la comunidad es fundamental para un
control efectivo y sostenible de A. aegypti, al controlar la presencia de criaderos artificiales
en casas, edificios u alrededores, reduciendo as la densidad de este vector en la zona
domiciliar. De esta forma, la educacin primaria en la salud y movilizacin social deben ser
partes integrales de los programas de control (WHO, 2006).
26

3. DEFINICIN DEL PROBLEMA

En Colombia, la FD/FHD es la enfermedad transmitida por vectores ms prevalente,
despus de la malaria. El dengue es una patologa de alto poder epidmico que en los
ltimos aos se presenta en sus formas clsica y hemorrgica en una gran parte del
territorio colombiano debido, entre otros casos a la alta dispersin del vector A. aegypti en
el pas. Hasta el mes de octubre de 2011 se registraron 25.929 casos totales de dengue entre
estos 24.810 de FD y 1.119 casos de FHD. La letalidad alcanz las 41 muertes confirmadas
mientras que 40 an se encuentran en estudio. En Colombia, el 95% de los casos de dengue
se presentan en poblaciones ubicadas por debajo de los 1.000 metros de altitud siendo los
departamentos ms afectados Valle, Norte de Santander, Casanare, Huila, Tolima,
Antioquia y Atlntico (MPS, 2010; PAHO, 2011). Considerando la alta incidencia
presentada en los tres primeros meses del ao 2010 y las condiciones ambientales como el
fenmeno del nio que contribuyen a la reproduccin del mosquito vector y en
consecuencia aumentan la probabilidad de infeccin, las autoridades de salud en Colombia
declararon la alerta epidemiolgica para la FD/FHD (PAHO, 2010).
Desafortunadamente, las herramientas disponibles actualmente para prevenir, detectar y
tratar la FD/FHD son limitadas; no existe un test diagnstico que sea especfico, prctico y
econmico; no hay medicamentos contra el DENV (WHO, 2007) y aunque se ha diseado
una vacuna tetravalente aun no ha sido licenciada. Esto obliga a las autoridades locales y
departamentales de salud a intensificar las acciones de vigilancia epidemiolgica de la
enfermedad, incluyendo la vigilancia entomolgica y virolgica.
Desde la aparicin del primer caso de FHD en diciembre de 1989, en Puerto Berro
(Antioquia), se observa en el departamento una tendencia al rpido incremento en el
nmero de casos. Entre 1994 y 2003 la incidencia oscil entre 0.02 y 4.2 casos por 100.000
habitantes, registrndose en 1998 el mayor nmero de casos, con una letalidad del 6%,
debido a una gran epidemia que afect el departamento de Antioquia. De acuerdo a la
presentacin de casos las regiones ms afectadas son: Magdalena Medio, Nordeste,
Occidente y Valle de Aburr, con compromiso principalmente de la poblacin entre 15 y 44
aos (Ospina M, 2004).
La vigilancia entomolgica en Antioquia se limita a la determinacin de los ndices
adicos. Diferentes estudios han demostrado que los actuales indicadores entomolgicos
no parecen evaluar efectivamente el riesgo de transmisin o definir umbrales para
epidemias de dengue (Focks et al., 2000) dado que la densidad mnima del vector bajo la
cual no hay transmisin de dengue aun no est definida. En Antioquia los tanques, canecas
y llantas son los principales criaderos del vector. Los ndices de infestacin larvaria (ndice
27

de Breteau) oscilan entre 10.2 y 11.6 y sitan al departamento entre los de alto riesgo, de
acuerdo a los criterios definidos por la OMS.
Como el dengue es una enfermedad de reas tropicales es necesario la continua vigilancia e
identificacin del virus en las poblaciones en especial en reas endmicas donde se
presentan casos todo el ao, con el fin de controlar y prevenir epidemias y as disminuir el
riesgo, controlar la prevalencia y el mantenimiento del virus en la naturaleza.
En 1992 se inici la vigilancia virolgica en Antioquia, demostrando la circulacin de los
serotipos 2 y 4. Desde el ao 1993 hasta el 2001 circularon los serotipos 1,2 y 4. En
Antioquia el serotipo 3 se detect por primera vez en el ao 2002 en los municipios de
Bello, Medelln, Cceres, Valdivia, San Pedro de Urab, Cisneros y Turbo, en coincidencia
con un aumento en el nmero de casos. En los aos posteriores se determino la circulacin
de los cuatro serotipos (1 (2002, 2004-2008); 2 (2002); 3 (2002-2006) y 4 (2006)). En
Colombia, los cuatro serotipos estn circulando hace ms de 20 aos y el genotipo ha sido
documentado para todos menos el serotipo 3 (Romero-Vivas et al., 1998; Diaz F, 2005;
Ocazionez R et al., 2006; Ocazionez R et al., 2007).
La deteccin temprana de casos, unida al monitoreo entomolgico representan
indiscutiblemente, la forma ms eficaz de evitar brotes epidmicos. Sin embargo, la
vigilancia virolgica est afectada por la baja especificidad y sensibilidad de las pruebas
utilizadas (la alta frecuencia de reaccin cruzada de los anticuerpos con los determinantes
antignicos que comparte el DENV con otros miembros de la familia Flaviviridae)
(Kautner I et al., 1997), por lo que en ocasiones deben prevalecer los criterios clnicos y
epidemiolgicos para la clasificacin de casos y toma de decisiones, los cuales dependen de
la experticia del mdico tratante, quienes en muchos casos no son los profesionales clnicos
en reas tropicales.
Aunque la vigilancia virolgica en humanos es importante (para el sondeo del virus y los
estudios patognicos) esta es limitada por el tiempo de la muestra, el diagnostico
confirmatorio es post-mortem (muchos pacientes mueren en el estado de efervescencia o
poco despus); en relacin con la toma de muestras para la identificacin del serotipo, esta
debe realizarse entre los das 4-5 del inicio de la enfermedad donde el pico de viremia es
alto (la viremia varia considerablemente dependiendo de los das de evolucin de la
enfermedad) ya que con los das aumenta los ttulos de IgM y disminuyen las partculas
virales. Adicionalmente en zonas tropicales donde confluyen simultneamente diversas
enfermedades con sntomas similares a la FD/FHD sumado a las deficiencias en la atencin
mdica complican aun ms la identificacin del serotipo viral dado que es improbable que
las muestras de pacientes sean tomadas durante los primeros 5 das de iniciados los
sntomas.
28

Teniendo en cuenta que la introduccin de nuevos serotipos en las poblaciones humanas

susceptibles es el mayor factor de riesgo para la emergencia de brotes y epidemias de FHD,
y que en el municipio de Bello se registra co-circulacin de al menos dos serotipos virales y
casos confirmados de FHD, es necesaria buscar metodologas alternativas que permitan la
identificacin de los serotipos circulantes en este municipio endmico para la enfermedad.
En este sentido, la determinacin del DENV y sus serotipos en poblaciones de mosquitos
colectados en campo es una forma sensible, especifica y rpida para el diagnostico precoz
de la infeccin del dengue y la delimitacin de zonas geogrficas en riesgo epidmico. La
vigilancia virolgica en mosquitos infectados naturalmente puede ser un componente
adicional de los sistemas de alerta temprana ya que es posible determinar la infeccin
durante el periodo extrnseco de incubacin.
29

4. HIPTESIS:
Considerando que Bello presenta caractersticas ecolgicas como altitud, humedad y
temperatura que favorecen la presencia del vector de la fiebre por dengue A. aegypti y que
el registro permanente de casos de FD determinan el carcter endmico de este municipio,
es posible identificar la presencia del virus dengue en poblaciones naturales de adultos de
A. aegypti.
5. OBJETIVOS:
OBJETIVO GENERAL
Identificar la presencia del virus dengue en poblaciones naturales de adultos del mosquito
vector A. aegypti en el municipio endmico de Bello.
OBJETIVOS ESPECIFICOS
Participar en los levantamientos trimestrales de ndices adicos durante 2009-2010
mediante visitas domiciliarias, junto con el personal de la Direccin Local de Salud de
Bello (DLSB) en todas las 10 comunas de este municipio.
Determinar los serotipos circulantes del virus dengue mediante RT-PCR (reaccin en
cadena de la polimerasa con transcriptasa reversa) en mosquitos A. aegypti adultos de
poblaciones naturales colectados en las 10 comunas de Bello.
30

6. JUSTIFICACIN
El incremento de la transmisin del DENV es causado principalmente por fallas en el
control de las poblaciones mosquito vector A. aegypti, la introduccin y la rpida
diseminacin de nuevas cepas de virus en una regin, por los viajes areos y la creacin de
condiciones ecolgicas adecuadas en ciudades del trpico que permiten la coexistencia de
serotipos del DENV. La causa principal de brotes epidmicos de FD/FHD es la presencia
de nuevos serotipos circulando especialmente en reas endmicas, adems de la
variabilidad de estos serotipos y la virulencia de las cepas del virus.
Los brotes epidmicos de dengue pueden ser mitigados grandemente usando mtodos de
diagnstico rpido y confiable que permitan el control y manejo de los pacientes. Un
diagnstico confirmatorio depende del aislamiento viral y solo puede ser realizado
mediante la deteccin del antgeno viral, genoma o partculas virales. Hasta hace poco esto
solo era posible a travs de los diferentes mtodos de aislamiento viral como los cultivos
celulares lo cual implicaba una alta inversin en infraestructura y personal. En la actualidad
hay disponibilidad de tcnicas como la RT-PCR que permiten detectar ARN especifico del
virus en diferentes muestras incluyendo mosquitos (Lanciotti RS et al., 1992; Chow VTK
et al., 1993; Seah CLK et al., 1995)
Estudios en Singapur, Venezuela y Mxico han demostrado que las pruebas de RT-PCR
pueden detectar pequeas cantidades de virus. Esta metodologa ha sido empleada para
detectar y serotipificar el DENV en mosquitos A. aegypti recogidos en campo durante bajos
y altos periodos de transmisin determinando la tasa mnima de infeccin en poblaciones
locales de mosquitos. La tcnica es suficientemente sensible como para detectar un
mosquito infectado entre 60 mosquitos no infectados (Chow VTK et al., 1993; Seah CLK
et al., 1995; Urdaneta L et al., 2005); la tcnica tambin es til en la estimacin de la
capacidad vectorial de los mosquitos al detectar el virus en los diferentes tejidos del
mosquito.
El uso de RT-PCR en investigaciones epidemiolgicas permite no solo localizar
geogrficamente los mosquitos infectados sino detectarlos hasta seis semanas antes del
inicio del brote epidmico, permitiendo una correlacin entre los mosquitos infectados con
la vivienda o los sitios de trabajo de las personas afectadas por la enfermedad. Adems, la
vigilancia de los mosquitos infectados con el DENV puede ayudar a monitorear las tasas de
31

infeccin en el vector identificando especficamente el serotipo causal y eliminando las

frecuentes reacciones cruzadas que se presentan entre los arbovirus.
Lo anterior provee una herramienta adicional que puede incorporarse en los sistemas de
alerta temprana para predecir una epidemia en una regin particular. Estos procedimientos
resaltan la importancia de los estudios vectoriales para producir resultados rpidos y
reproducibles. Igualmente, este tipo de investigaciones moleculares son una aproximacin
para el control de estas enfermedades, brindando as una importante relacin de la
informacin sobre la biologa molecular del vector y las interacciones ventor-patgeno.
La identificacin temprana de un brote epidmico de cualquier enfermedad infecciosa es
un paso fundamental en la implementacin de medidas efectivas de control y en la
reduccin de la morbilidad y mortalidad en las poblaciones humanas. Si se identifica el
DENV en poblaciones naturales del mosquito entonces puede ser posible determinar el
riesgo epidmico de FD al identificar la introduccin de un nuevo serotipo en una
poblacin humana susceptible as como el riesgo epidmico de FHD al determinar la
frecuencia de segundas infecciones asociadas con el desarrollo de esta complicacin. La
circulacin de nuevos o antiguos serotipos fcilmente identificados en poblaciones
naturales de mosquito constituye un elemento importante de los sistemas de alerta temprana
de la enfermedad. Igualmente, la estandarizacin e implementacin de nuevas y sencillas
herramientas moleculares por parte de las autoridades de salud puede mejorar las
estrategias de prevencin y control en un rea endmica como el municipio de Bello.
32

7. METODOLOGIA
7.1 AREA DE ESTUDIO
Este trabajo se realiz en las 10 comunas del rea urbana del municipio de Bello (Figura 6).
La tabla 1 presenta los barrios muestreados.
7.1.1 Ubicacin del municipio de Bello
Bello hace parte del Valle de Aburr. El municipio cuenta con un rea total de 142,36 Km
de los cuales 19,7 Km son suelo urbano y 122,66 km son suelo rural. Este valle est
totalmente urbanizado en su parte plana, y muy poblado en sus laderas. Al valle lo cruza el
Ro Medelln, el cual corre en direccin sur-norte, y a lo largo de sus 70 kilmetros recibe
en su recorrido el tributo de 57 quebradas. La ciudad, por estar ubicada en la zona trrida,
no registra cambios estacionarios del clima. El ndice promedio de precipitacin es de
1.347 mm., y su temperatura est determinada por pisos trmicos que van del pramo,
pasando por el fro hasta llegar al medio, en donde est la cabecera, la cual tiene una
temperatura promedio de 23 C durante todo el ao, intercalando perodos secos y lluviosos
y se ve refrescada por los vientos que se encaonan a lo largo del valle y que soplan durante
todo el ao.
Figura 6: mapa del municipio de Bello (Antioquia) mostrando su divisin administrativa

en 10 comunas.
33

7.1.2 Caractersticas del municipio de Bello

De acuerdo con las cifras del censo del DANE en 2005, Bello cuenta con 371.973
habitantes. Es la segunda aglomeracin urbana del rea metropolitana del Valle de Aburr,
que suma en total 3.312.165 personas. El municipio cuenta con una densidad poblacional
de aproximadamente 2.496 por kilmetro cuadrado. El 47.1% de sus habitantes son
hombres y el 52,9% mujeres. La tasa de alfabetismo en la poblacin mayor de 5 aos de
edad es del 92.9%. Segn las cifras de la Gobernacin de Antioquia basadas en la encuesta
de Calidad de Vida 2004, el estrato socio-econmico predominante en el municipio es el 2
(bajo) con el 39.3%, seguido por el estrato 3 (medio-bajo) con el 36.1% y el estrato 1 (bajobajo) con un 20.2%. En una menor proporcin tambin estn los estratos 4 (medio) y 5
(medio-alto) con un 4.3% y 0.1% respectivamente, que son principalmente viviendas
campestres ubicadas en las veredas del municipio. En los ltimos aos la ciudad ha venido
teniendo un crecimiento descontrolado principalmente por la migracin de poblaciones
desplazadas procedentes de otros municipios del departamento, con asentamientos tipo
invasin en algunos barrios. La mayora de la poblacin desplazada vive en viviendas
construidas informalmente en un alto nivel de hacinamiento. El 96.4% de la poblacin tiene
servicio de acueducto aunque en el estrato 1 el suministro de agua es inconstante. ndices
de Breteau (IB) mayores al 5% se registran en 49 (59.7%) de los 82 barrios del rea urbana.
7.2 Coleccin del material biolgico
Durante el periodo comprendido entre Mayo del 2009 a Febrero del 2011 con la
colaboracin de los funcionarios de la Direccin Local de Salud de Bello (DLSB) se
particip en el levantamiento de ndices aedicos con el fin de recolectar larvas y adultos de
A. aegypti para la determinacin de la infeccin y el serotipo viral. Los ndices adicos
evalan la situacin entomolgica en una localidad determinada y permiten la vigilancia y
monitoreo de las medidas de control de A. aegypti en dicha localidad. La DLSB realiza 4
levantamientos anuales en todas las comunas de Bello, especficamente dos levantamientos
durante poca seca (Dic-Feb; Jun-Ago) y dos durante poca de lluvias (Mar-May; SeptNov). Estos levantamientos se realizan mediante visitas domiciliarias durante las cuales se
recolectan larvas y/o pupas y adultos de A. aegypti en los diferentes tipos de criaderos del
mosquito.
Las larvas y pupas fueron transportadas directamente en agua desde criadero al insectario
del Grupo de Biologa y Control de Enfermedades Infecciosas (BCEI). Los adultos se
transportaron vivos en bolsas ziploc con un poco de aire. Los insectos inmaduros se
tuvieron en condiciones estndar de 28C y 70-80% de humedad relativa en recipientes con
agua y se alimentaron con pescarina diariamente hasta que llegaron al estado adulto.
34

Se colectaron varias larvas en un solo criadero puesto que las hembras de A. aegypti
ovipositan pequeas cantidades de huevos en numerosos sitios (Reiter, 2007); sabiendo
esto, se deduce que varias hembras pusieron sus huevos en el mismo sitio durante la poca
de postura. Esto descarta la posibilidad de muestrear hermanos o individuos muy
cercanamente relacionados (Ravel S et al., 2001).
7.3 Extraccin y purificacin de ARN
Para la extraccin del ARN se sigui la metodologa tradicional descrita por Cceres
(2003); brevemente, los adultos fueron homogenizados en pools de mximo 5 mosquitos en
un tubo (eppendorf) con 500 ul de trizol y macerados para la extraccin de cidos
nucleicos; despus se adicionaron otros 500 ul de trizol y se centrifug a 12000 r.p.m a 4C
por 10 min. El sobrenadantte se transfiri a un nuevo vial, se incub el homogenizado por 5
min a temperatura ambiente y luego se adicionaron 200ul de cloroformo; se incub a
temperatura ambiente por 15 min, y la suspensin se centrifug 12000 r.p.m por 15min,
luego se transfiri la fase superior a un nuevo vial, se adicionaron 500ul de isopropanol y se
mezcl para precipitar el ARN; se incub por 10 min a temperatura ambiente, se centrifug
de nuevo a 12000 r.p.m por 10 min, se descart el sobrenadante y se lav el precipitado
con 1ml de etanol al 75% tratado con agua DEPC. El precipitado se centrifug a 7500 r.p.m
por 5min, se descart el etanol y se sec el pellet. El precipitado se resuspendi en 25ul de
agua libre de RNAsas y se incub por 10 min a 55-60C y se almacen -80C hasta ser
utilizado.
7.4 Cuantificacin de ARN
La cuantificacin del ARN total se realiz en un NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer
mediante un procedimiento espectrofotomtrico, para lo cual se midi la absorbancia a 260
nm de las muestras de ARN. La pureza del ARN se determin midiendo la absorbancia a
280 nm y calculando la razn A260/A280 (valor que debe ser superior a 1.8). La
concentracin aproximada de la muestra se calcul utilizando la siguiente relacin: 1
unidad de absorbancia a 260 nm equivale a 40 g/ml de ARN.
7.5 Identificacin de DENV y serotipos de DENV
La presencia de DENV en larvas y adultos colectados en campo se evidenci mediante RTPCR (reaccin en cadena de la polimerasa despus de la transcriptasa reversa) usada
anteriormente para detectar el DENV en saliva de Aedes (Chow et al., 1998). La
identificacin de los serotipos circulantes se realiz mediante anlisis moleculares sobre los
adultos de A. aegypti colectados vivos en campo. Los individuos fueron sacrificados por
congelamiento y mantenidos en solucin de RNA later (QIAGEN) hasta la extraccin del
ARN. El ARN obtenido se someti a transcripcin reversa (RT) para ser convertido en
35

cADN y luego se realiz la reaccin de PCR utilizando los iniciadores y el protocolo

descrito por Seah CLK et al., (1995).
7.5.1. Reaccin en cadena de la polimerasa con transcripcin reversa (RT-PCR)
Antes de realizar la identificacin del serotipo se evalu la integridad del ARN mediante
amplificacin del gen ribosomal AAS7 usando los primers especficos para A. aegypti
descritos en Gnther J et al., 2007 5_- ACGTGAAATCGTTCGTGACATTAAG(sentido)
y 5 _-TTAACTTAGAAGCACTTGCGGTGAA (anti-sentido).
La retro-transcripcin (RT) fue realizada usando el kit para RT-PCR QUANTITECT
SYBR GREEN (Quiagen); La RT se realiz a 48 por 45 min. Luego 35 ciclos de PCR de
30s, 55 por 60s y 68 por 60s, y un ciclo final de 68 por 10 min.
Para detectar el serotipo de DENV se usaron los primers para el gen NS3 descritos por Seah
CLK et al., 1995 (Ver tabla 1).
Tabla 1: Secuencias nucleotdicas, y posiciones consenso arriba (DV1) y primers de tipo
especfico abajo (DSP1-4) para la identificacin de los serotipos virales.
Primer
Posicin
Tamao
Secuencia
(orientacin)
nucleotdica
en pb
DV1 (+)
5-GGRACKTCAGGWTCTCC-3
DSP1 (-)
5-AGTTTCTTTTCCTAAACACCTCG-3
5067-5045
169
DSP2 (-)
5-CCGGTGTGCTCRGCYCTGAT-3
5279-5260
362
DSP3 (-)
5-TTAGAGTYCTTAAGCGTCTCTTG-3
5174-5152
265
DSP4 (-)
5-CCTGGTTGATGACAAAAGTCTTG-3
5342-5320
426
Nucletidos ambiguos: K (G/T), R (A/G), W (A/T), Y(C/T).
36

7.6 Visualizacin de fragmentos virales

La identificacin del serotipo viral se verific considerando el tamao en pb obtenido por
visualizacin en electroforesis en agarosa al 1.5% (DEN1: 169 pb, DEN2: 362 pb, DEN3:
265 pb, DEN4: 426 pb). El ARN viral utilizado como control positivo procedi de cultivos
celulares infectados con los diferentes serotipos, los cuales fueron gentilmente facilitados
por Jos Ciro Usme del Laboratorio Neurociencias de la SIU-UdeA.
7.7 Determinacin de la tasa mnima de infeccin viral en mosquitos
Se determin la tasa mnima de infeccin (MIR) de A. aegypti con el DENV en poblaciones
naturales como se describe en Urdaneta L et al., 2005, basndonos en el supuesto bsico
en que slo un individuo infectado existe en un pool positivo. Por definicin, la MIR tiene
define el lmite inferior de la verdadera tasa de infeccin. Cuando las tasas de infeccin son
bajas y/o
el
pool
es
de
tamao
pequeo, MIR proporciona una
buena
estimacin de la verdadera tasa infeccin de infectados ya que la posibilidad de que exista
ms de un individuo en un pool positivo es insignificante (Gu W et al., 2004)
MIR= (numero de mosquitos positivos / numero total de mosquitos analizados)*1000
37

8. RESULTADOS
8.1 Coleccin del material biolgico
Los insectos fueron colectados en los Barrios de Bello que tenan reportes de ser reas de
alto riesgo o de tener una alta densidad vectorial, que hacen parte del programa de
vigilancia entomolgica de la DLSB; estos barrios fueron visitados al menos una vez
durante los levantamientos de ndices mdicos: Las casas muestreadas en cada barrio
fueron escogidas al azar por los integrantes de la DLSB; cada casa visitada fue sometida a
una bsqueda meticulosa de larvas y adultos de mosquitos, dentro y en sus alrededores,
teniendo en cuenta las horas de mayor actividad hematofgica del mosquito es decir entre
las 9am y las 12m. Los individuos adultos fueron colectados con pequeas redes de barrido
y los estadios inmaduros se colectaron con pipetas paster y luego se mantuvieron en viales
o en bolsas con agua del mismo criadero hasta su transporte al insectario del BCEI. Cada
espcimen colectado se identific con el nombre del barrio, la direccin de la casa y la
fecha de coleccin. Los barrios visitados se muestran en la tabla 2. Los principales
criaderos donde el mosquito realiza parte de su ciclo de vida son canecas, tanques, plantas
en agua y recipientes de plstico que puedan contener agua reposada, donde las hembras
realizan su oviposicin.
En el insectario del BCEI los individuos adultos fueron llevados a -20C para provocarles
un choque trmico y luego ser almacenados en viales eppendorff con solucin RNA later
(Quiagen) a -80C para conservar la integridad del ARN.
Tabla 2: Barrios muestreados en Bello y la comuna a la que pertenecen
BARRIO
COMUNA
FECHA
Prado
# 8. Niqua
Mayo 2009
Prado
#8. Niqua
Septiembre 2009
Granjas
#8. Niqua
Mayo 2009
Bucaros
#3. Santa Ana
Mayo 2009
Santa Ana
#3. Santa Ana
Mayo 2009
Villa Mara
#5. La Cumbre
Mayo 2009
Pachelly
#6. Bellavista
Mayo 2009
Altos de Niqua
#7. Altos de Niqua
Mayo 2009
Altos de Niqua
#7. Altos de Niqua
Septiembre 2009
Ciudad Niqua
#8. Niqua
Mayo 2009
Cafetal
#5. La Cumbre
Septiembre 2009
Buenos Aires
#4. Surez
Septiembre 2009
Sonora
#5. La Cumbre
Septiembre 2009
38

Selva
Niqua
La Camila
La Camila
Guasimalito
Bellavista
Gran avenida
Prez
Prez
Prez
Cabaitas
La Gabriela
Villa Mara
Playa Rica
Espritu Santo
Madera
Pars
Primavera
Maruchenga
San Gabriel
Riachuelo
Urapanes
Hermosa provincia
Tierra adentro
#7. Altos de Niqua

#8. Niqua
#9. Fontidueo
#9. Fontidueo
#7. Altos de Niqua
#6. Bellavista
#2. Madera
#4. Surez
#4. Surez
#4. Surez
#2. Madera
#10. Acevedo
#5. La cumbre
#6. Playa Rica
#4. Surez
#2. Madera
#1. Pars
#5. La Cumbre
#1. Pars
#6. Bellavista
#4. Suarz
#8. Niqua
#7. Altos de Niqua
Septiembre 2009
Septiembre 2009
Septiembre 2009
Agosto 2010
Septiembre 2009
Diciembre 2009
Diciembre 2009
Diciembre 2009
Junio 2010
Agosto 2010
Diciembre 2009
Diciembre 2009
Diciembre 2009
Diciembre 2009
Diciembre 2009
Diciembre 2009
Diciembre 2009
Junio 2010
Junio 2010
Agosto 2010
Agosto 2010
Agosto 2010
Agosto 2010
Agosto 2010
8.2 Identificacin de los especmenes

Todas las hembras y machos analizados fueron primero identificadas correctamente con
ayuda de un estereomicroscopio como A. aegypti siguiendo la clave taxonmica de Rueda
(2004).
8.3 Anlisis gentico
8.3.1 Extraccin de ARN Se realiz la extraccin de ARN de 1000 mosquitos colectados
en los barrios registrados en la tabla 2. Los mosquitos fueron agrupados en un total de 282
pools, distribuidos en mximo 5 mosquitos por pool y separados segn el sexo y el lugar de
coleccin.
39

Tabla 3: Distribucin de mosquitos en pools y total de pools

Numero de
mosquitos por pool
1
2
3
4
5
Total
Total de mosquitos
por pool
72
82
76
182
822
1234
Total de
pools
72
41
25
45
164
347
8.3.2 Cuantificacin del ARN

Al realizar la cuantificacin se pudo apreciar que la cantidad de ARN que se obtuvo de
cada pool estuvo entre 270.5 ng/ul 1535.6 ng/ul, con una pureza promedio de 1.85
(260/280) por pool. Se realizaron diluciones para realizar todas las RT-PCR con el ARN a
una concentracin de 50 ng/uL.
8.3.3 Evaluacin de la integridad del ARN
Para verificar la integridad del ARN extrado se realiz la amplificacin del gen ribosomal
AAS7 (300 pb) de A. aegypti (Figura 6). De este anlisis solo el 0.002% de los pools
analizados no tuvo amplificacin lo que pudo deberse a una degradacin del ARN. Estas
muestras fueron descartadas.
300pb
Figura 7: Gel de agarosa al 1% teido con bromuro de etidio mostrando la amplificacin

del gen ribosomal AAS7. M: machos; H: hembras; El numero indica la cantidad de
40

mosquitos por pool; CN: control negativo; la flecha indica el tamao de la banda
amplificada (300pb).
8.3.4 Identificacin de DENV y serotipos
Solo el 0.002% del total de mosquitos analizados result positivo para DENV por RT-PCR;
El pool positivo contena 2 mosquitos hembras los cuales fueron colectados en el barrio
Prez en Diciembre de 2009. La determinacin del serotipo identific la presencia de
DENV-3 en la muestra positiva (Figura 8).
Marcador
DENV-2
DENV-3
DENV-4
Muestra +
CN
Figura 8: Gel de agarosa al 1% teido con bromuro de etidio mostrando la amplificacin

de los serotipos DENV-2 (carril 2: 362 pb), DENV-3 (carril 3: 265 pb) y DENV-4 (carril 4:
426pb); Carril 5: muestra positiva correspondiente al serotipo DENV-3.
8.3.5. Determinacin de la mnima concentracin.
Para corroborar la sensibilidad de la RT-PCR despus de haber obtenido nuestros
resultados decidimos realizar un ensayo con diluciones seriadas a partir de la concentracin
inicial de 85.8 ng/ul las cuales fueron desde 1:10 hasta 1: 10000000 del ARN del DENV.
La figura 9, muestra los resultados de los productos de amplificacin obtenidos por RTPCR para el serotipos DENV- 2 en una electroforesis en gel de agarosa al 1%.
41

Figura 9. Gel de agarosa al 1% mostrando la amplificacin de las diluciones a partir de

DENV-2. Carril 1: marcador de peso, 2: DENV-2 (85.8ng/ul), 3: dilucin 1:10 (18ng/ul), 4:
1:100 (2.3ng/ul), 5: 1:1000 (1.9ng/ul), 6: 1:10000 (1ng/ul), 7: 1:100000 (0.2ng/ul), 8:
1:1000000 (0.001ng/ul), 9: 1: 10000000 (0.00001ng/ul), 10: control negativo.
El lmite de deteccin fue 1:100000 para nuestro serotipo estudiado de DENV; esto nos
muestra una sensibilidad de deteccin del virus obtenido a partir de una concentracin viral
de 0.2 ng/ul. Al comparar esto con la baja sensibilidad en la deteccin del DENV en los
pools de mosquitos capturados en campo observamos que pudo ser debido a un bajo titulo
viral en los moquitos inferior a 0.2 ng/ul.
8.3.6 Determinacin de la tasa mnima de infeccin viral en mosquitos

Se determin la tasa mnima de infeccin de A. aegypti con el DENV en poblaciones
naturales como se describe en Urdaneta L et al., 2005.
Determinacin de la tasa mnima de infeccin para A. aegypti larvas y adultos

colectados en campo
MIRA.aegypti= (numero de mosquitos positivos / numero total de mosquitos analizados)*1000

MIRA.aegypti = 2/1234 x 1000 = 1.621
42

Determinacin de la tasa mnima de infeccin para larvas de A. aegypti colectados

en campo.
MIRlarvas = (numero de larvas positivas / numero de larvas totales)* 1000

MIRlarvas= 0/ 1182 x 1000 = 0
Determinacin de la tasa mnima de infeccin para A. aegypti adultos colectados en

campo.
MIRadultos = (numero de adultos positivos / numero de adultos totales)* 1000

MIRadultos= 2/ 52 x 1000 = 38.462
43

9. DISCUSIN
En las ltimas dos dcadas, la epidemiologa del dengue en Colombia ha cambiado
dramticamente con un incremento en la frecuencia e intensidad de los brotes epidmicos, a
pesar de los esfuerzos realizados por los programas locales de control. Para disminuir el
riesgo a la salud humana y los costos sociales y econmicos asociados a las enfermedades
arbovirales como la FD/DHF, es necesario conocer la dinmica de transmisin de los
DENV y desarrollar con estos datos programas de vigilancia epidemiolgica. La vigilancia
virolgica debera incluir la deteccin temprana de la circulacin del virus y su serotipo no
solo en humanos sino tambin en los mosquitos vectores, a fin de disponer de verdaderos
sistemas de alerta temprana de epidemias y/o brotes de esta enfermedad. Para cumplir con
esto es clave el diagnstico seguro y la correcta identificacin del serotipo que causa la
patologa, para lo cual la tcnica de la reaccin en cadena de la polimerasa con
transcripcin reversa (RT-PCR) ha demostrado ser ampliamente eficiente. La vigilancia
virolgica de mosquitos recogidos en campo y analizados por esta tcnica ha sido sugerida
como herramienta en el monitoreo y en los sistemas de alerta temprana para brotes de
DENV en reas endmicas y para la deteccin de los serotipos que sean introducidos
recientemente en dichas reas (Chow et al., 1998, Mndez F et al., 2006).
El desarrollo e implementacin de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) ha
facilitado la aparicin de un gran nmero de ensayos de diagnstico para detectar virus,
incluyendo varias pruebas para detectar el DENV (Lanciotti RS, 1992). Estudios enfocados
en usar esta tcnica molecular para detectar los serotipos del DENV en mosquitos han sido
realizados en zonas endmicas de Venezuela y Singapur (Chow VTK et al., 1998, Castro
et al., 2004, Urdaneta L et al., 2005). Aunque algunos de estos trabajos se limitaron solo al
anlisis de datos epidemiolgicos, cuando la epidemia ya se haba establecido, la tcnica
demostr alta sensibilidad y especificidad para DENV comparada con los mtodos
serolgicos usados con este mismo objetivo pero en humanos. Considerando la importancia
de conocer los serotipos que circulan en el municipio endmico de Bello y conociendo
que la segunda infeccin con algunos serotipos y genotipos del virus se asocian con
manifestaciones clnicas graves como la FHD y el SCD, y dado que existen reportes
previos de co- circulacin de dos o ms serotipos en este municipio, nuestro trabajo evalu
el potencial de la deteccin del DENV en mosquitos trados directamente de campo y
colectados en barrios con registros de infestacin por A. aegypti.
En este estudio, la aproximacin molecular usada involucr mltiples primers que estaban
dirigidos al gen que codifica la protena no estructural NS3, lo cual permiti no solo
identificar la infeccin especfica con virus dengue eliminando la posibilidad de reacciones
cruzadas con otros flavivirus, adems de identificar el serotipo viral causante de esta
infeccin en el mosquito. Para corroborar la sensibilidad de la RT-PCR despus de haber
44

obtenido nuestros resultados se realiz un ensayo con diluciones seriadas desde 85.8 ng/ul
hasta 0.0001 ng/ul del ARN obtenido a partir del DENV-2. El lmite mnimo de deteccin
fue 0.2 ng/ul; la baja sensibilidad en la deteccin del DENV con los pools de mosquitos
capturados en campo podra entonces relacionarse con un titulo viral en los moquitos
menor a esta concentracin. Otra posibilidad es que dado que las extracciones de ARN en
nuestro estudio fueron realizadas a partir de todo el mosquito, esto podra haber resultado
en un efecto inhibitorio originado por la cantidad de tejido del mosquito.
La tasa mnima de infeccin (MIR) de 1.621 calculada en este estudio para A. aegypti en
Bello contrasta con resultados anteriores obtenidos en otras ciudades hiperendmicas como
Maracay en Venezuela donde se encontraron 16 por cada 1000 mosquitos (Urdaneta et al.,
2005) y en Singapur donde fue de 57,6 por cada 1000 mosquitos (Chow et al., 1998). No
obstante, la MIR podra aumentar si se incrementa el nmero de especmenes como en el
estudio de Urdaneta et al. (2005) en Venezuela donde se colectaron 4,597
aproximadamente. Para obtener una cantidad de mosquitos significativa se deben
considerar diversos factores como el tipo de instrumentos para realizar las colectas, el uso
de ovitrampas pegajosas, o las trampas de mosquitos BG-centinela (Ritchie et al., 2004).
Las colecciones del material de campo para nuestro trabajo se realizaron dentro de las
actividades convencionales del levantamiento de ndices adicos, las cuales estn limitadas
en trminos de recurso humano (el cual es contratado directamente por la DLSB y en
muchos casos carece de entrenamiento en entomologa o es temporal) y de recurso fsico (el
personal solo dispone de redes de barridos de fabricacin casera). Lo anterior tambin
permitira confirmar la transmisin vertical, sugerida en otros estudios como el de Gunther
J et al. (2007) en donde las larvas colectadas directamente de campo sobrepasaron las
4.000. En nuestro periodo de estudio, el DENV solo fue detectado en hembras adultas de A.
aegypti lo que sugiere que en la poblacin est ocurriendo transmisin horizontal. Nosotros
detectamos la presencia de DENV-3 en estas hembras, las cuales fueron colectadas en
diciembre del 2009 en una casa donde habitaban personas con diagnstico clnico de FD,
segn informacin de la DLSB. Durante este mismo ao, el Laboratorio Departamental de
Salud de Antioquia confirm la circulacin de DENV-3 en el municipio de Bello y sus
municipios vecinos en sueros aislados de pacientes con diagnostico confirmado de FD
(comunicacin personal Dra. Marta Ospina); lo anterior est directamente relacionado con
el brote de la enfermedad ocurrido a finales del 2009 y principios del 2010. Chow et al.
(1998) en Singapur detectaron mosquitos infectados con DENV seis semanas antes de que
se presentaran casos en los humanos. Aunque nuestro estudio no permite determinar el
momento preciso del periodo epidmico durante el cual nuestro pool infectado se detect, si
nos muestra que la tcnica puede incluirse en estudios epidemiolgicos a mayor escala,
donde los resultados obtenidos en la poblacin de mosquitos puedan correlacionarse con los
obtenidos a partir de pruebas serolgicas humanas.
45

Los resultados del presente estudio confirman la importancia de la vigilancia epidemiovirolgica a travs de la deteccin de mosquitos infectados naturalmente con DENV, como
una forma eficiente y rpida para la prediccin de brotes de dengue.
46

10. CONCLUSIONES
De la muestra de mosquitos analizados se identific un pool de dos hembras

infectado con DENV-3, lo que muestra la utilidad de la tcnica RT-PCR empleada
para detectar el virus en poblaciones naturales de A. aegypti.
Nuestros resultados confirman que la regin del virus NS3 amplificada, es sensible
y especfica para detectar y tipificar los serotipos de DENV circulantes en
poblaciones naturales del mosquito A. aegypti.
La tasa mnima de infeccin (MIR) baja (1.621) que se observa en poblaciones

naturales del mosquito se ve reflejada en este estudio, encontrando un solo pool de
dos mosquitos hembras infectado de un total de 282 pools.
Este estudio enfatiza la utilidad de las herramientas moleculares en los sistemas de

alerta temprana, contribuyendo a la disminucin del riesgo de epidemias en una
regin particular, al predecir el/los serotipos del virus DENV circulantes en la
naturaleza.
47

11. PERSPECTIVAS
Es recomendable incluir una mayor cantidad de especmenes y disponer de

controles positivos de mosquitos infectados, se debe conocer la cantidad de virus
con la que estn infectados para as poder determinar hasta que rango de titulo viral
puede detectar la tcnica RT-PCR.
Deben implementarse estrategias de recoleccin de mosquitos ms efectivas con el

fin de obtener un mayor nmero de adultos, y por lo tanto una mayor probabilidad
de encontrar infeccin por DENV en A. aegypti.
Con el fin de una mejor aplicacin epidemiolgica, es fundamental correlacionar los

datos de la vigilancia virolgica en mosquitos con los datos obtenidos a partir de
muestras humanas.
48

12. BIBLIOGRAFIA.
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02-11 Identificacion de Virus Dengue en Poblaciones Naturales de

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Aedes aegypti DEL MUNICIPIO DE BELLO, ANTIOQUIA

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El camino hacia una vida productiva,

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7.7 Determinacin de la tasa mnima de infeccin viral en mosquitos ............................ 37

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suma la falta de implementacin de un control efectivo del mosquito en reas donde el

2.2 FIEBRE POR DENGUE EN LAS AMERICAS

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2.3 FIEBRE POR DENGUE EN COLOMBIA

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Cauca, Antioquia, Tolima, Huila, Casanare y Cundinamarca, entre ellos se distribuye ms

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Ellas vuelan en sentido contrario al viento, desplazndose mediante lentas corrientes de

Figura 2: ciclo de transmisin de los DENV

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inoculadas intratorxicamente con DENV-3 (Joshi V et al., 2002). Factores como el

2.4.1 CICLO DE VIDA DE A. aegypti

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Figura 3: ciclo de vida de A. aegypti.

2.5 Biologa del DENV

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Figura 4: Representacin esquemtica del virin maduro, E: envoltura proteica, M:

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2.5.1 Protenas estructurales del DENV

El virin maduro contiene tres protenas estructurales: C, protena de la nucleocpside o

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La protena E es una glicoprotena con un peso molecular entre 51 y 60 kD, es la

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comparacin de sus secuencias nucleotdicas y los anlisis bioqumicos sugieren que es

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2.6 Prevencin y control de la fiebre por dengue

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2.6.2 Vigilancia entomolgica

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3. DEFINICIN DEL PROBLEMA

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Teniendo en cuenta que la introduccin de nuevos serotipos en las poblaciones humanas

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infeccin en el vector identificando especficamente el serotipo causal y eliminando las

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Figura 6: mapa del municipio de Bello (Antioquia) mostrando su divisin administrativa

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7.1.2 Caractersticas del municipio de Bello

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cADN y luego se realiz la reaccin de PCR utilizando los iniciadores y el protocolo

Nucletidos ambiguos: K (G/T), R (A/G), W (A/T), Y(C/T).