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UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO || FACULTAD DE QUIMICA

INGENIERIA EN BIOTECNOLOGIA

DETERMINACION CUALITATIVA DE ALGUNAS


ENZIMAS TPICAS
Albo Josu Hernndez Rojas
Ingeniera en biotecnologa, Universidad Autnoma de Quertaro, albojosuehr@outlook.es
Fernando Larriva Snchez
Ingeniera en biotecnologa, Universidad Autnoma de Quertaro, larriva_15 @yahoo.com.mx
Fernando Olvera Martnez
Ingeniera en biotecnologa, Universidad Autnoma de Quertaro, fert_om2@yahoo.com.mx
Francisco Len Solorio
Ingeniera en biotecnologa, Universidad Autnoma de Quertaro, Frank_Is@hotmail.com
Natalia Garca Orihuela
Ingeniera en biotecnologa, Universidad Autnoma de Quertaro, naty1095@hotmail.com

RESUMEN: Las enzimas son biocatalizadores que aceleran reacciones qumicas. Estas reacciones se llevan a cabo en
muy especficas: pH, temperatura, locacin, entre otras. El propsito del experimento realizado es ilustrar la
especificidad de las enzimas y el uso de la especificidad de las enzimas para detectar la presencia de dicha enzima en
un extracto crudo. Se realiz la identificacin de cinco enzimas: ureasa, amilasa, peroxidasa, catalasa y polifenol
oxidasa. Adems de una muestra problema para determinar las enzimas presentes. Para cada una de ellas se utilizaron
cinco diferentes muestras. Frijol y coliflor para la ureasa, saliva humana para la amilasa, coliflor para la peroxidasa,
hgado de res para la catalasa y cscara de manzana para la polifenol oxidasa. Cada una tuvo un tratamiento diferente y
en cada prueba hubo un blanco (agua destilada) para poder comparar un resultado negativo con uno positivo. Se
identific la presencia de todas las enzimas en las muestras conocidas y en la desconocida se determin la existencia de
ureasa y peroxidasa.
PALABRAS CLAVE: Peroxidasa, catalasa, amilasa, polifenol oxidasa, ureasa

ABSTRACT: Enzymes are catalysts that accelerate chemical reactions. These reactions are performed in very specific
pH, temperature, location, among others. The purpose of the experiment performed to illustrate the specificity of
enzymes and the use of the specificity of enzymes to detect the presence of said enzyme in a crude extract. urease,
amylase, peroxidase, catalase and polyphenol oxidase: identifying five enzymes was performed. In addition to a test
sample to determine these enzymes. For each five different samples were used. Beans and cauliflower for urease,
human saliva amylase, peroxidase cauliflower, beef liver for catalase and apple peel for polyphenol oxidase. Each had
a different treatment and in each test was a blank (distilled water) to compare a negative with a positive. the presence
of all known enzymes in samples and in the unknown was determined the existence of urease and peroxidase was
identified.

KEYWORDS: Peroxidase, catalase, amylase, polyphenol oxidase, urease.

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INTRODUCCIN
Las enzimas son biocatalizadores que aceleran
reacciones qumicas. Las enzimas son protenas
que participan en la regulacin de mecanismos que
permiten la adaptacin a diferentes situaciones.
Estas reacciones se llevan a cabo en condiciones
muy especficas: pH, temperatura, locacin, etc.
La especificidad de una enzima tambin recae en
el tipo de reaccin catalizada, que se denomina
especificidad de accin, y en los sustratos que
modifican, especificidad de sustratos.
La
actividad de una enzima se mide cuantificando el
incremento de la velocidad de la reaccin [1].
Durante esta prctica se trabaj con 5 enzimas:
ureasa, amilasa, peroxidasa, catalasa y polifenol
oxidasa.
La ureasa es una exoenzima que cataliza la
reaccin de hidrolisis de la urea, el principal
producto celular nitrogenado de la degradacin de
las protenas y los cidos nucleicos. La ureasa se
encuentra
principalmente
en
semillas,
microorganismos e invertebrados [2].
La enzima -amilasa, presente en el tubo digestivo
de los animales (en la saliva y jugo pancretico)
hidroliza la cadena lineal del almidn gelatinizado
atacando los enlaces (1-4) al azar a lo largo de la
cadena para producir una mezcla de maltosa y
glucosa [3].
Las peroxidasas son generalmente enzimas de
protena de porfirina de hierro que catalizan la
oxidacin de los sustratos por el perxido de
hidrogeno. En otras palabras, la peroxidasa es un
enzima que descompone el perxido de hidrogeno
en presencia de un compuesto oxidable el que
transfiere un tomo de oxgeno. La oxidacin del
catecol o bencidina por el agua oxigenada a travs
de la peroxidasa ocasiona un cambio de color que
es normalmente empleado como detector de la
actividad peroxidasa [4].
La catalasa forma parte de los sistemas de
destoxificacin de las clulas animales y vegetales,

y de las bacterias aerobias y anaerobias


facultativas. La reaccin que cataliza es la ruptura
del perxido de hidrogeno para formar agua y
oxgeno [5].
La polifenol oxidasa es una enzima que cataliza la
O-hidroxilacin de monofenoles (un solo
sustituyente hidroxilo) para convertirlos en Odifenoles (dos sustituyentes hidroxilos) [6].
En todas las pruebas se utiliz un amortiguador de
fosfatos con cloruro de sodio a diferentes
concentraciones.
Los
amortiguadores
son
soluciones tampn que nos regulan el pH de una
solucin. Es indispensable usarlos cuando se
trabaja con enzimas por su alta especificidad (que
las condiciones sean las adecuadas) para llevar a
cabo sus actividades [7]. Se busca ilustrar la
especificidad de las enzimas y el uso de la
especificidad de las enzimas para detectar la
presencia de dicha enzima en un extracto crudo.

METODOLOGA
Ensayo enzimtico
1) Preparacin de extractos de enzimas
Se prepararon las siguientes extracciones, los
clculos se encuentran en anexos.
1. Amilasa: Se tomaron aproximadamente 4
ml de saliva humana y se diluyeron con 4
ml de una solucin de NaCl 0.1 M.
2. Ureasa: 20 g de frijol y cebada se
remojaron desde un da antes y se
trituraron con 100 ml de amortiguador de
fosfatos 0.1 M pH 7 conteniendo 0.2 M de
NaCl. El extracto es separado mediante una
gasa.
3. Peroxidasa 20 g de coliflor se macharon
con 100 ml de amortiguador de fosfato de
potasio 0.2 M pH 7.5 conteniendo 0.3 M de
NaCl, el extracto es separado mediante una
gasa.
4. Catalasa: 20 g de hgado de res se
homogenizaron con una licuadora en 100

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ml de amortiguador de fosfatos 0.1 M pH


7.5. Se separa mediante una gasa las
enzimas extradas.
5. Polifenol oxidasa. 20 g de manzana se
macharon en 100 ml de amortiguador e3
fosfatos 0.1 M pH 6.5 conteniendo 0.2 M
de NaCl.
El Dr. Aldo Amaro Reyes proporcion una
muestra problema con una enzima desconocida
para identificarla con las pruebas.
2) Ensayo de enzimas
Se efectuaron las pruebas tanto para las muestras
de enzima conocida como para la desconocida
simultneamente, junto con el blanco conteniendo
agua en lugar de la muestra de enzima, quedando
as:
Tubo 1: Un blanco conteniendo
amortiguador y substrato, pero con la
enzima reemplazada por agua.
Tubo 2: Uno con amortiguador, substrato y
una alcuota de solucin patrn de la
enzima conocida que se prob.
Tubo 3: Otro que contena amortiguador,
substrato y una alcuota apropiada de la
enzima desconocida.
CATALASA: En el ensayo para le enzima, se
adicionaron 0.2 ml de la catalasa conocida o de su
muestra desconocida a 2 ml de perxido de
hidrogeno al 3%.
Nota: Una lenta formacin de hidrogeno pudo
haber ocurrido en el blanco, esto es causado por
contaminacin con metales y no debe ser tomado
como ensayo positivo.
PEROXIDASA: En el ensayo para le enzima se
adiciono 2 o 3 gotas de guayacol al 1% en etanol a
un volumen de 0.5 ml de la peroxidasa conocida o
de la desconocida y luego una gota de perxido de
hidrogeno al 3%.

UREASA: Para la deteccin de la enzima, se


colocaron unos cuantos cristales de urea en un
tubo limpio y se disolvi en casi 2 ml de agua
desionizada. Se adicion 2 o 3 gotas de rojo de
fenol al 0.1% (en agua) y 0.10 0,20 ml de la
ureasa conocida o de la muestra desconocida Se
repiti usando fenolftalena al 0.1% (en alcohol)
como indicador y observar el cambio de color de
claro a rosa.
AMILASA: En un vaso de precipitados de 100 ml
se puso almidn, aproximadamente 3 g y 2 ml de
agua, luego se procedi a calentar la mezcla con
agitacin constante hasta que tenga la consistencia
de un gel espeso. Se adicionaron 3 gotas de agua,
amilasa o la muestra desconocida en la superficie
del gel. No mezclar. Se observ la cantidad del
lquido en la superficie del gel despus de 4-10
minutos con el blanco.
POLIFENOL OXIDASA: Se prepar una
solucin de catecol (45 mM) se prepar
disolviendo 0.050 g de catecol en 100 ml de
amortiguador de fosfatos 0.1 M pH 6.
Se disolvi el catecol por agitacin suave para no
acelerar la oxidacin no enzimtica causada por el
O2. Se adicion 1 ml de la solucin de catecol a 3
tubos y se agregaron 0.1 mL de agua al blanco, 0.1
ml de la enzima conocida al 2do tubo y 0.1 ml de la
enzima desconocida al 3er tubo

RESULTADOS
Ensayo enzimtico
Amilasa
En la figura 1 se puede observar la prueba de
amilasa. Se encuentran dos tubos de ensayo, a la
derecha el blanco (agua destilada) y en la
izquierda el que contiene la saliva humana. En el
tubo conteniendo la saliva humana hay ms
lquido que en el blanco. Se puede decir que el
almidn absorbi el agua destilada, y, por el
contrario, la saliva humana produjo ms lquido.

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en el tubo de la izquierda. Al agitar el tubo se


observ la formacin de espuma.

Figura 1. Prueba de amilasa con saliva


humana y blanco

Figura 3. Prueba de catalasa con hgado

Polifenol oxidasa
La figura 2 representa la prueba de polifenol
oxidasa. El tubo de ensayo a la derecha es el
blanco y el que se encuentra a la izquierda es el
catecol. Se puede observar una diferencia de color
en el lquido. El que contiene catecol tiene un
color caf claro, estilo sepia y el blanco conserva
su transparencia.

y blanco

Peroxidasa
En la figura 4 se encuentran dos tubos de ensayo,
el que est a la izquierda es el blanco y el que est
a la derecha es el que contiene la muestra de
coliflor. Se puede observar un cambio de color en
la muestra positiva, pues de ser incoloro se torn
caf-verdoso.

Figura 2. Prueba de polifenol


Figura 4. Prueba de peroxidasa

oxidasa con catecol

con coliflor

Catalasa
En la figura 3 se hallan dos tubos de ensayo con la
prueba de la enzima catalasa. El de la izquierda es
el que contiene el hgado de res y el de la derecha
es el blanco. El color no tiene importancia en esta
prueba ya que proviene del hgado. La evidencia
de la presencia de la enzima es la espuma formada

Ureasa
En la figura 5 se muestra la prueba de ureasa el
tubo del lado derecho es el blanco, el tubo del
centro contiene la enzima conocida tratada con
fenolftalena y el de la izquierda la enzima

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conocida con rojo fenol. Las coloraciones dieron


negativas con frijol, pero con coliflor dieron
positiva, la fuente no tiene mayor relevancia ya
que ambas son fuente de ureasa.

Figura 5. Prueba de ureasa

Ensayos problema con enzima desconocida


En la figura 6 se observa la enzima desconocida en
5 tubos de ensayo diferentes. En el nmero 1 se
realiz la prueba de polifenol oxidasa, en el tubo 2
la catalasa, en el 3 amilasa, en el 4 peroxidasa, y
en el 5 ureasa.

Figura 6. Identificacin de la enzima


desconocida.

DISCUSIN
Ensayo enzimtico
Amilasa
Como se puede observar en la figura 1, el blanco
(el tubo de la derecha), no tiene lquido debido a
que el almidn absorbi el agua agregada, por otro
lado, en el tubo de muestra (el tubo a la izquierda)

se puede observar que contiene un lquido ya que


la amilasa de la saliva (o pitalina) hidroliza el
almidn, transformndolo en maltosa, pero
pasando previamente por unos compuestos
intermedios denominados dextrinas [7]. El
extracto desconocido no dio positivo a la prueba
de amilasa.
Catalasa
El hgado es un rgano que, tanto en seres
humanos como en animales, en este caso res,
contiene la enzima catalasa. [14] Como ya se
mencion la catalasa se encarga de descomponer
el perxido de hidrgeno en agua y oxgeno. Esto
sucede porque a pesar de que el perxido de
hidrgeno es un residuo del metabolismo celular,
es un compuesto altamente txico que debe ser
transformado inmediatamente. Al entrar en
contacto el hgado triturado con el perxido de
hidrgeno se pudo observar un burbujeo. Estas
burbujas (espuma) indica la presencia de oxgeno,
el cual es producto de la descomposicin del
perxido de hidrgeno [15].
Peroxidasa
Las peroxidasas son las encargadas de catalizar la
oxidacin de ciertos compuestos que son capaces
de donar hidrgeno, tal como lo es el guayacol. El
guayacol es un compuesto fenlico derivado de la
bencina, o bien ter de petrleo. El tetraguayacol
es producto de la oxidacin del guayacol, y tiene
un cambio de color. Como en la figura cuatro se
puede observar, el cambio de color nos indica la
formacin de tetraguayacol gracias a la enzima
peroxidasa encontrada en la coliflor [10].
Ureasa
En la prueba de ureasa inicialmente se trabaj con
frijol, sin embargo, los resultados de la enzima
dieron negativos esto se debe a que el frijol ya era
viejo y por tanto el tiempo de vida de la enzima en
l frijol ya haba agotado, el tiempo de vida de una
enzima puede variar [8] lo mejor para estas
pruebas es usar fuentes frescas para extraer la
enzima y esto se pudo ver claramente al usar otra
fuente de ureasa que es la coliflor. El color rojizo

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del indicador rojo fenol se debe [9] a que la


enzima usa la urea como fuente de nitrgeno,
hidrolizan la urea y liberal el nitrgeno causando
una alcalinizacin del medio cambiando el color
de amarillo a rojo (pH de vire 6.8-8.4)
Polifenol oxidasa
La polifenol oxidasa es una enzima que utiliza
cobre como cofactor y es la responsable del
obscurecimiento de los vegetales cuando existe
dao fsico. La polifenol oxidasa, oxida los grupos
fenilo de su sustrato, que es el amino 3,4dihidroxifenilalamina (DOPA) [13]. Es por esta
razn que el tubo que dio positivo se puede
observar un ligero cambio de color de trasparente
a un ligero amarillo. El extracto desconocido no
mostro cambio, por lo que es un resultado
negativo.
Enzima desconocida
Para la prueba de la enzima desconocida solo dio
positivo para la prueba de peroxidasa y ureasa
dando vire de color. Como ya se dijo antes la
prueba de peroxidasa se encarga de la oxidacin
del guayacol y al oxidarse tiene un cambio de
color, de translucido a caf. Y en la ureasa debido
a la fuente que es urea o un compuesto
nitrogenado se produce un ascenso de pH
(alcalinizacin) y como consecuencia el vire de
color de los indicadores.

CONCLUSIN
En las cinco pruebas realizadas se obtuvieron
resultados positivos para la identificacin de la
presencia de las enzimas. Se esperaban los
resultados positivos porque se conoca la fuente de
la muestra y el contenido de sta. Adems, se
puede concluir que la metodologa fue realizada
correctamente. Esto incluye la preparacin de las
soluciones utilizadas. El buffer se hizo de manera
adecuada pues ninguna de las enzimas perdi su
actividad al ser extrada, lo que nos indica que los
clculos que se presentan en el anexo se realizaron
de manera adecuada.

De la muestra desconocida se determin la


presencia de 2 de las 5 enzimas que fueron
analizadas. stas son ureasa t peroxidasa, sin
embargo, no se puede definir el origen de las
enzimas pues solo se determinaron esas dos
enzimas y es probable que la muestra contuviera
otras enzimas de las que no se realiz un anlisis.

AGRADECIMIENTOS
Agradecemos a la academia de Biotecnologa de la
Universidad Autnoma de Quertaro por brindar
las instalaciones de laboratorio requeridas para
llevar a cabo esta prctica. Agradecemos tambin
al Dr. Aldo Amaro Reyes por el reactivo catecol,
utilizado para la determinacin de la enzima
polifenol oxidasa.

BIBLIOGRAFIA
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WKH2PO4=(136.086g/mol)
=0.8342g

(0.1L)

(0.0613M)

[Base] = 0.1-0.0613= 0.0357 M


WK2HPO4
=0.674g

=(174.17g/mol)

(0.1L)

(0.0357M)

Mezclar las cantidades de cido y base conjugada


en 100 mL de agua.
NaCl
W=(58.44g/mol) (0.1L) (0.2M) =1.1683gPeroxidasa
7.5 = 7.2 + log [Base]/[cido]
Antilog (7.5-7.2) = [Base]/[cido]
[cido] 1.995 = [Base]
[cido] + [cido] 1.995 = 0.2M
[cido] = 0.2 M / 2.995 = 0.0667 M
W=(136.086g/mol) (0.1L) (0.0667M) =0.9077g

ANEXOS

[Base]=0.2-0.0667=0.1332M

Clculos

W=(174.17g/mol) (0.1L) (0.1332M) =2.319g

Peso molecular

Amilasa

cido: KH2PO4 = 136.086 g/mol

W = (58.44 g/mol) /0.1L) (0.1M) =0.5844 g NaCl

Base: K2HPO4 = 174.17 g/mol

Catalasa

pka = 7.2

7.5 = 7.2 + log [Base]/[cido]

pH = pka + log [Base]/[cido]

Antilog (7.5-7.2) = [Base]/[cido]

Ureasa

[cido] = 0.0334 M

7 = 7.2 + log [Base]/[cido]

W=(136.086g/mol) (0.1L) (0.0334M) =0.4545g

Antilog (7-7.2) = [Base]/[cido]

[Base]=0.0666 M

[cido] 0.6309 = [Base]

W=(174.17g/mol) (0.1L) (0.0666M) =1.169g

[cido] + [cido] 0.6309 = 0.1M

Mezclar las cantidades de cido y base conjugada


en 100 mL de agua.

[cido] = 0.1 M / 1.6309 = 0.0613 M