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PRUEBAS BIOQUÍMICAS REALIZADAS

A ENTEROBACTERIAS
CATALASA

NITRITOS

CITOCROMO OXIDASA

PRUEBA AMINO-ACIDOS (CALDO
DESCARBOXILASA DE MOELLER)

CITRATO

ROJO DE METILO(RM)

(EOSINA-AZUL METILENO) EMB

SIM (SULFURO-INDOL-MOTILIDAD)

HECKTOEN-ENTERICO (HE)

SS (SALMONELLA SHIGELLA)

LIA ( LISINA-HIERRO)

TSI (TRES AZUCARES-HIERRO)

MALONATO

UREA

MAC CONKEY

VOGES PROSKAUER (VP)

MOTILIDAD

XLD ( XILOSA-LISINA-DESOXICOLATO)

(PRINCIPAL)

(ENTEROBACTERIAS)

(GLOSARIO)

CATALASA

La catalasa es una enzima que descompone el peroxido de Hidrogeno (H2O2) en
agua y oxigeno. El peroxido de Hidrogeno se forma como uno de los productos
finales del metabolismo aerobio de los hidratos de carbono. Si se permite que se
acumule resulta letal para la célula bacteriana.

FUNDAMENT
O
La prueba de la catalasa se usa con mucha frecuencia para diferenciar miembros
de la familia Micrococaceae de miembros de la familia Streptococcaceae.

MATERIALES *Peroxido de Hidrogeno al 3% almacenado en frasco ámbar en frío.
Y
*Cultivo de 18-24 horas del microorganismo a probar
REACTIVOS
*Con un asa o palillo de madera, transferir parte del centro de una colonia a la
superficie de un portaobjetos
PROCEDIMIE
*Agregar 1 gota de Peroxido de Hidrógeno al 3% y observar la producción de
NTO
burbujas

la producción rápida y sostenida de burbujas o efervescencia constituye una
INTERPRETA reacción positiva.
CION

NOTA

los eritrocitos poseen cátalasa, por lo cual se debe evitar tomar colonias de agar
sangre para evitar falsos positivos.

Las colonias bacterianas con actividad de Citocromo-Oxidasa en segundos toman un color azul intenso en el sitio de la prueba. produciendo un color inicialmente rosado y luego azul oscuro a negro. con formación de agua. dado que los productos de Oxidación formados al esterilizarlas a la llama pueden producir reacciones falsas positivas. transfiriendo electrones (Hidrogeno) al oxigeno. La prueba es muy útil para diferencia Enterobacterias (Todas Oxidasa negativas) de otras especies como Pseudomona o Neisserias oxidasa positiva. Para esta técnica no se debe utilizar INTERPRETA asas de acero inoxidable. . Dichos MATERIALES compuestos son dimetil-fenil-diamina y tetrametil-parafenil-endiamina.ACTIVIDAD CITOCROMO-OXIDASA Los citocromos son Hemoproteinas que contienen hierro y actúan como el ultimo eslabón de la cadena respiratoria aerobia. Por lo cual CION debemos utilizar palillos de madera. Hay dos compuestos susceptibles a oxidarse por la acción de esta enzima. también se dispone en el mercado de tirillas de REACTIVOS Oxidasa o el reactivo ya preparado. El sistema citocromo se encuentra en los organismos aerobios o anaerobios facultativos. Siendo el Y más utilizado el segundo. de modo que la prueba de FUNDAMENT Oxidasa es importante para identificar aquellos organismos que carecen de esta O enzima (anaerobios obligados).

MAC CONKEY Agar selectivo y diferencial para el aislamiento de Enterobacterias. Las colonias fermentadoras de lactosa dan un color rosado. Incubar 24 horas a 37º C. TECNICA: Sembrar en el agar realizando siembra por agotamiento a partir del cultivo del microorganismo en estudio. El medio contiene sales biliares y cristal violeta que son inhibidores de la microbiota Gram FUNDAMENT positiva. CION . Las colonias no INTERPRETA fermentadoras de lactosa son incoloras. dividiendo el grupo en 2: Bacterias O fermentadoras y no fermentadoras de Lactosa. La lactosa junto al indicador Rojo neutro sirven para la comprobación de la degradación de dicho azúcar. lo anterior por el comportamiento del indicador de pH.

Incubar a 37º C por 24 horas. La alta concentración de sales biliares inhibe el desarrollo de las bacterias Gram positivas. Salicina) que contiene el medio. . Inocular realizando siembra por agotamiento a partir del cultivo del microorganismo en estudio. Sacarosa. La combinación de tiosulfato y una sal de hierro dan una coloración negra a las colonias H2S positivas.(REGRESAR) HECKTOEN-ENTERICO (HE) FUNDAMENTO TECNICA INTERPRETACION El agar HE es un medio de cultivo selectivo para la identificación de bacterias intestinales patógenas. La Fucsina acida junto con el azul de Bromotimol reaccionan virando a amarillo al bajar le pH del medio por la acción de los ácidos producidos a partir de la fermentación de los 3 hidratos de carbono (Lactosa. Las bacterias fermentadoras rápidas de lactosa como Escherichiae coli forman colonias de color naranja brillante a rosa salmón.

Klebsiella sp y Enterobacter so. El efecto inhibidor es muy débil. . (REGRESAR) XLD ( XILOSA-LISINA-DESOXICOLATO) FUNDAMENTO TECNICA INTERPRETACION La degradación a acido a partir de la Xilosa. las colonias que se desarrollan son pequeñas y transparentes. Los microorganismos como E. producen cadaverina. coli. Son verde azulosas. Son de color azul verdoso con típicos centros negros por el gas H2S. *Las colonias de Shigella spp. lactosa y sacarosa producen un viraje a amarillo del indicador Rojo de fenol. Las bacterias que descarboxilan la lisina. incubar a 37’ C por 24 horas. * Las cepas de Proteus spp son algo inhibidas. El tiosulfato y sal de hierro revelan la formación de H2S por la precipitación del sulfuro de hierro negro en las colonias. se reconocen por la presencia de un color rojo-purpúreo debido al aumento de pH alrededor de las colonias.* Las colonias de Salmonella spp. Inocular realizando siembra por agotamiento a partir del cultivo del microorganismo en estudio.

la mayoria con centro negro debido a la producción de H2S. Providencia y algunas cepas de Proteus no utilizan ningún hidrato de carbono y forman colonias translucidas. *La mayor parte de las especies de Salmonella y Arizona forman colonias Rojas. *Los géneros Shigella. La Lactosa es el único hidrato de carbono y el Rojo neutro detecta la producción de acido. Inocular realizando siembra por agotamiento a partir del cultivo del . La alta concentración de sales biliares y citrato se sodio inhibe a todas la bacterias Gram positivas y a algunas Gram negativas. El tiosulfato de sodio es una fuente se azufre y las bacterias que producen H2S se detectan por la presencia de un precipitado negro por el citrato ferrico. *Las colonias que solo fermentan la Xilosa presentaran un color Naranja. (REGRESAR) SS (SALMONELLA SHIGELLA) FUNDAMENTO TECNICA El agar SS es un medio altamente selectivo que inhibe el desarrollo de la mayoria de coniformes y permite el desarrollo de las especies de Salmonella y Shigella.Pueden utilizar más de un hidrato de carbono y formar colonias amarillas brillantes.

Colonias trasparentes con centro negro: Proteus y algunas Salmonellas. INTERPRETACION las cepas de Shigella y la mayoria de Salmonella presentan colonias incoloras. Las bacterias fermentadoras de Lactosa presentan colonias rojas a rosadas. (REGRESAR) EMB (EOSINA-AZUL METILENO) FUNDAMENTO TECNICA Es una agar selectivo para el aislamiento de Enterobacterias patógenas. incubar a 37’ C por 24 horas. Los colorantes de anilina (Eosina y azul de metileno) inhiben las bacterias Gram positivas y las Gram negativas exigentes nutricionalmente. También se combinan precipitándose a pH acido actuando como indicadores de producción de ácidos de los carbohidratos presentes en el medio (Lactosa y Sacarosa) Inocular realizando siembra por agotamiento a partir del cultivo del .microorganismo en estudio.

microorganismo en estudio. Escherichiae coli fermenta los azucares y forma colonias verdes con brillo metálico. incubar a 37’ C por 24 horas. Las colonias no fermentadoras son incoloras. utilizan sales de amonio como única fuente de nitrógeno. La citritasa actúa sobre el citrato produciendo acido oxalacetico y acetato. un compuesto orgánico simple que constituye uno de los metabolitos del ciclo de los ácidos tricarboxilicos. Generalmente los microorganismos que emplean el citrato como única fuente de carbono. productos que son convertidos enzimaticamente a piruvato y . INTERPRETACION Las colonias fermentadoras son de color rosado. El metabolismo del citrato realizado. por algunas bacterias se realiza por el ciclo de krebs y requiere el desdoblamiento del citrato por la enzima citritasa (citrato-oxalacetatoliasa o citrato desmolasa) en presencia de magnesio o manganeso y de transportadores como citrato permeasas. (REGRESA CITRATO FUNDAMENTO El citrato de sodio es una sal del acido cítrico.

6).dióxido de carbono. este carbonato da la alcalinidad que produce el cambio de color del indicador de pH del medio de verde a azul Prusia oscuro (indicador: azul de bromotimol. . Incubar a 37 grados C por 24 horas. La prueba también es positiva en ausencia de color azul si existe crecimiento del microorganismo a lo largo de la estría de inoculación. El medio incluye citrato como única fuente de carbono y fosfato de amonio como única fuente de nitrógeno. El desarrollo de un color azul intenso en 24-48 horas indica una prueba positiva y revela que el microorganismo en estudio ha sido capaz de utilizar el citrato en el medio con la formación de productos alcalinos. el cual se combina con el agua y el sodio para formar Carbonato un producto alcalino. TECNICA INTERPRETACION (REGRESAR) Inocular el tubo con agar citrato de Simmons realizando siembra por estría tomando una colonia del microorganismo en estudio. amarillo a pH< de 6.0 y azul a pH > de 7. Durante esta reacción el medio comienza a alcalinizarse por el CO2 que se genera.

La presencia de burbujas que rompen el medio y a veces tienden a expulsarlo indica presencia de gas como producto final de la fermentación. lactosa y sacarosa y la producción de H2S por parte de la bacteria sumándole producción de gas. además los radicales libres no son suficientes para hacer virar el medio. Si se fermentan los 3 azucares hay cambio de color tanto en la superficie como en el fondo. . El cambio de color rojo-anaranjado (color inicial del medio) a amarillo indica fermentación.TSI ( TRES AZUCARES-HIERRO) FUNDAMENTO Es una prueba usada para la fermentación de la glucosa. Si se fermenta únicamente la glucosa el cambio de color del medio ocurre solamente en el fondo debido a que se encuentra 10 veces menos concentrada que la sacarosa y la lactosa. La producción de H2S se manifiesta por la aparición de un precipitado color negro debido a la reducción de la sal de hierro presente en el medio.

Color amarillo INTERPRETACION K: Reacción alcalina. A: Reacción acida.TECNICA Inocular el medio realizando siembra mixta del microorganismo en estudio. Color roja naranja K/A: Fermentación de la glucosa Burbujas: Producción de gas los 3 Precipitado negro: Formación H2S (REGRESAR) A/A: Fermentación 3 azucares K/K: No hay fermentación de . incubar a 37 grados C por 24 horas.

La descarboxilacion de la lisina ocurre en ambiente anaeróbico o sea en el fondo del tubo y se pone de manifiesto por la alcalinización del medio produciendo un viraje del indicador púrpura de bromocresol. La desaminacion de la lisina que se puede producir por los géneros Proteus y Providencia tiene lugar en la parte superior del tubo produciendo acido a cetocarbonico que al combinarse con la sal de hierro y en presencia de oxigeno forma un color violeta rojizo. La presencia de glucosa en los componentes del LIA determina primero una reacción de fermentación.LIA ( LISINA-HIERRO) FUNDAMENTO Es un medio que sirve para demostrar la producción de dos enzimas: la lisina descarboxilasa y la lisina desaminasa. La producción de H2S se evidencia por la presencia de un precipitado . produciendo acidificación y cambio de color del medio a amarillo y el pH favorable para la reacción de descarboxilacion que ocurre después. volviendo a su color violeta original la parte del fondo del tubo. además la presencia de sales de hierro sirve para detectar la producción de H2S por algunos microorganismos.

TECNICA Inocular realizando siembra mixta con doble picadura a partir de una colonia del cultivo del microorganismo en estudio e incubar 24 horas a 37 grados C A: Reacción acida. Color violeta R: Reacción alcalina: color rojo INTERPRETACION K/K: Descarboxilacion lisina K/A: Fermentación glucosa.negro por utilización de las sales de hierro. Fermentación glucosa (REGRESAR) . Color amarillo K: Reacción alcalina. Descarboxilacion lisina R/A: Desaminacion lisina.

El desarrollo de un color rojo-fucsia en la interfase del reactivo y de los medio segundos después añadir el reactivo de Kovacs indica la presencia de indol y por lo tanto una prueba positiva. MEDIO DE CULTIVO: agar SIM o caldo triptofano TECNICA INTERPRETACION Inocular al medio realizando siembra por picadura hasta la mitad del medio a partir del cultivo del microorganismo en estudio. Este es el principio activo del reactivo de Kovacs. . La prueba del indo esta basada en la formación de un complejo rojo cuando el Indol reacciona con el grupo aldehído p-dimetilaminobenzaldehido.SIM ( SULFURO-INDOL-MOTILIDAD) FUNDAMENTO El indol. Incubar 24 horas a 37 grados C. es uno de los productos de la degradación metabólicas del amino acido triptofano. acido piruvico y amoniaco. al finalizar este periodo añadir 5 gotas del reactivo de Kovacs por la pared del tubo. Las bacterias que producen la enzima triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptofano con producción de Indol.

TECNICA Siembra en picadura con el microorganismo a estudiar. . desarrollo de turbidez hacia los lados de la estría de inoculación indica motilidad positiva. incubar 24 horas a 37 grados C INTERPRETACION Formación de nata la parte superior de medio indica viabilidad del microorganismo.(REGRESAR) MOTILIDAD FUNDAMENTO Me permite determinar la capacidad de movimiento por parte de un microorganismo.

Incubar 24-48 horas a 37º C.4 y es .4. finalizado este periodo adicionar 5 gotas del revelador Rojo de metilo.4.(REGRESAR) ROJO DE METILO (RM) FUNDAMENTO REVELADOR TECNICA INTERPRETACION Determinar la capacidad de un microorganismo para producir y mantener estables los productos terminales ácidos de la fermentación de la glucosa y vencer la capacidad amortiguadora del sistema.1 y solo presenta color rojo cuando el pH desciende a 4. Rojo de metilo Inocular en el caldo RMVP con una colonia del cultivo del microorganismo en estudio. de forma que el medio del pH descienda a menos de 4. El desarrollo de un color rojo estable en la superficie del medio indica que la producción de acido es suficiente como para bajar el pH a 4. La prueba Rojo de metilo es cuantitativa para la producción de acido y requiere que los microorganismos produzcan ácidos fuertes a partir de la glucosa. Esta distinción puede hacerse a través del indicador Rojo de metilo que presenta color amarillo por encima de un pH de 5.

3 Butanodiol) a partir de la fermentación d ela glucosa. Incubar a 37º C por 24 horas. alcalisis (Hidróxido de Potasio al 40%) y peptonas. (REGRESAR) VOGES PROSKAUER (VP) FUNDAMENTO Determinar la capacidad de algunas bacterias para generar un producto final neutro (acetoina y 2.6ml) de la solución A y 2 gotas (0.una prueba positiva. dejar en . Cuando ocurre la formación de un color amarillo la prueba es negativa. se oxidan en diacetilo. Al finalizar este periodo adicionar 6 gotas (0. Solución A: Alfa naftol al 5% en etanol absoluto REVELADOR Solución B: Hidróxido de Potasio al 40% en agua destilada. TECNICA Inocular en RMVP con una colonia del cultivo del microorganismo en estudio. El Alfa naftol actúa como catalizador para revelar un complejo color rojo.2ml) de la solución B. reactante para el color producido en la reacción. Los productos neutros formados en la presencia de oxigeno atmosférico.

TECNICA inocular 1-2 asadas del microorganismo en el Caldo Malonato. . azul de Bromotimol. se produce un aumento de la alcalinidad que se debe a la formación de Hidróxido de sodio (NaOH). INTERPRETACION Una prueba positiva esta indicada por el desarrollo de un color rojo a los 15 minutos de añadido los reactivos reveladores por la presencia de acetoina. incubar a 37º C por 24 horas.reposo durante 10-15 minutos. MALONATO FUNDAMENTO El malonato de sodio. Si un microorganismo es capaz de utilizar el malonato de sodio como única fuente de carbono. al mismo tiempo que utilizar el sulfato de amonio como fuente de nitrógeno. es una sal orgánica que es utilizada por las bacterias como única fuente de carbono con formaron de productos alcalinos que se evidencia por un viraje de verde a azul del indicador del medio. Una prueba negativa da un color cobrizo. INTERPRETACION El cambio de color de verde a azul indica una prueba positiva.

Un cambio de color Rojo fucsia indica que la urea fue hidrolizada por la .(REGRESAR) UREA FUNDAMENTO TECNICA INTERPRETACION Los microorganismos que poseen la enzima Ureasa tienen la capacidad de hidrolizar la urea contenida en el medio con producción de amoniaco. incubar a 37º C por 24 horas.0) inoculación en caldo. para esta prueba se utiliza el caldo urea de stuart o agar urea de christensen. El caldo sturat esta estabilizado con sales de fosfato a un pH de 6.8. el microorganismo en estudio debe producir cantidades relativamente grandes a fin de superar el sistema estabilizador del medio y elevar el pH del medio los suficiente como para virar el indicador (por encima de 8.

Si el amino-acido es descarboxilado se forman .ureasa del microorganismo. El amino-acido por ensayar se añade al medio base antes de inocular el microorganismo en estudio. Ausencia de cambio de color indica reacciona negativa (REGRESAR) PRUEBA AMINO-ACIDOS (CALDO DESCARBOXILASA DE MOELLER) FUNDAMENTO El caldo descarboxilasa de Moeller es el medio base mas comúnmente utilizado para determinar la capacidad de descarboxilacion de aminoácidos por las Enterobacterias. Durante las etapas iniciales de incubación ambos tubos se vuelven amarillos debido a la fermentación de la pequeña cantidad de glucosa del medio (pH 5. Ambos se incuban anoxigénicamente adicionando una capa de aceite mineral estéril.6). Se debe emplear paralelamente un control que consiste en un tubo con medio base sin el amino-acido.

uno con el amino-acido y otro sin este (control). El retorno al color púrpura o violeta del tubo que contiene el amino-acido indica una reacción positiva debido a la liberación de aminas por descarboxilacion. Arginina y Ornitina son 3 amino-ácidos ensayados y producen las siguientes aminas específicas. Cubrir ambos tubos con una capa de aceite mineral estéril.aminas alcalinas y el medio retorna a su color púrpura inicial. Los amino-ácido Lisina. dos tubos de caldo de Moeller. El desarrollo de un color amarillo en el tubo control indica que el microorganismo es viable y que el pH del medio ha disminuido lo suficiente para activar las enzimas descarboxilasas. Lisina TECNICA INTERPRETACION arginina (+) (REGRESAR) Cadaverina (Descarboxilasa) Ornitina Putrescina (Descarboxilasa) Arginina Citrulina ( Dihidrolasa) Inocular con material de una colonia del cultivo del microorganismo en estudio. Incubar a 37º C por 24 horas. ornitina (+) lisina (+) .

. con al formación de un colorante Rojo de Diazonio.NITRITOS Determinar la capacidad de un microorganismo de reducir los Nitratos o gas Nitrógeno libre. La O mayoría de las bacterias aerobias son anaerobias facultativas y solo pueden reducir los Nitratos en ausencia de oxigeno. es decir el protón y el aceptor final de protones. REVELADOR: La presencia de Nitritos se detecta en el medio. en las cuales el FUNDAMENT microorganismo produce su oxigeno del Nitrato. El oxigeno actúa como un aceptor de Hidrógeno. añadiendo el reactivo de Griessllovays. La reducción de Nitrato (NO3) a Nitrito (NO2) y a Nitrógeno gaseoso (N2) se produce en condiciones de anaerobiosis.

indica la presencia de Nitritos y representa una prueba positiva. NTO El desarrollo de un color rojo después de añadir el reactivo. Oxido Nitroso e Hidroxilamina. La ausencia del color tras el agregado del reactivo puede indicar que los nitritos no han sido reducidos (Una verdadera prueba negativa). Nitrógeno molecular.Inocular el medio de Nitrato con una parte de la colonia del cultivo Axenico del PROCEDIMIE microorganismo en estudio. Incubar 24 horas a 37º C. después de este tiempo añadir 5 gotas del reactivo de Griess-llovays. o que han sido reducidos a productos distintos de los nitritos. Por lo tanto es necesario añadir una pequeña cantidad de polvo de zinc a todas las INTERPRETA reacciones negativas. Nitrógeno molecular u Oxido Nitroso e Hidroxilamina. (REGRESAR) . como Amoniaco. Si no hay cambio de color tras agregar el polvo de zinc indica que los nitratos fueron reducidos a otros compuestos como amoniaco. Los iones de Zinc reducen los nitratos a Nitritos y el CION desarrollo de un color Rojo tras agregar polvo de zinc indica la presencia de nitratos residuales y confirma la reacción negativa verdadera.