2009

Combinacin gentica por

Insercin de plsmido INC M en
Escherichia coli como tratamiento
de biorremediacin de suelos
1

Marcos Eduardo Crdenas ; Jeimy Contreras Ramos ; Yuli Corredor ; Diana Daniela Portela
1
1
1
Dussan ; Diana Marcela Guaqueta ; Leidy Andrea Plazas *
Estudiantes de Bacteriologa y Laboratorio Clnico Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca

03/11/2009

ombinacin gentica por Insercin

de plsmido INC M en Escherichia coli

como tratamiento de biorremediacin
de suelos

Marcos Eduardo Crdenas ; Jeimy Contreras Ramos ;

3
4
Yuli Corredor ; Diana Daniela Portela Dussan ; Diana
5
6
Marcela Guaqueta ; Leidy Andrea Plazas *

Resumen. El manejo inadecuado de residuos

y el constante derramamiento de materiales
peligrosos en suelos y agua se ha convertido
en un problema de gran preocupacin
mundial, por esta razn se han creado
tcnicas como es la manipulacin gentica
relacionando la diversidad gentica y
versatilidad metablica de microorganismos.
En el presente trabajo se inserta un plsmido
en dos cepas de Escherichia coli, los cuales
contienen la informacin gentica del
Bacillus cereus cepa CMB-503 codificantes
para la sntesis de enzimas desoxigenasa y
oxigenasa, genes de Pseudomona putida que
codifica para la familia taurina dioxigenasas
(PP0229, PP0169, PP4466) y genes que
codifican 15 monooxigenasas; estas cepas
fueron sembradas en agar nutritivo con una
concentracin de gentamicina y en el medio
HCB, de esta manera se determin que las
dos cepas se transformaron con el plsmido
insertado. Finalmente se implementan en la

degradacin de petrleo en un terrario

contaminado
Palabras clave: biorremediacin, clonacin,
Escherichia coli, Pseudomona putida KT2440,
Bacillus cereus cepa CMB-50.
Abstract. Improper management of waste
and the constant outpouring of hazardous
materials in soil and water has become an
issue of worldwide concern, for this reason
have developed techniques such as genetic
manipulation
and
genetic
diversity
correlating
metabolic
versatility
of
microorganisms. In this work, a plasmid is
inserted in two strains of Escherichia coli,
which contain the genetic information of
Bacillus cereus strain WBC-503 coding for the
synthesis of desoxigenasa and oxygenase
enzymes, Pseudomonas putida genes
encoding the taurine dioxygenases family (
PP0229, PP0169, PP4466) and 15 genes
encoding monooxygenases, and these strains
were streaked on nutrient agar with
gentamicin and a concentration of HCB in the
middle, so it was determined that the two
strains were transformed with the plasmid
inserted. Finally implemented in the
degradation of contaminated oil in a
terrarium.
Key words: bioremediation,
cloning,
Escherichia coli, Pseudomona putida KT2440,
Bacillus cereus CMB-50 strain.

NTRODUCCION

marrco_polo@hotmail.com;
contrerascj@hotmail.com;
3
oriel89@hotmail.com;
4
colombian_girl.tata@hotmail.com;
yulicorredor06@hotmail.com5;
6
dianita_0909@hotmail.com
2

*Estudiantes Universidad Colegio Mayor de

Cundinamarca

Las operaciones de exploracin y

produccin de la industria petrolera
conllevan a una generacin de desechos
orgnicos, as mismo como una
contaminacin
por
derrames
de
hidrocarburos. En Colombia, se ha
registrado que durante los ltimos
quince aos algunos oleoductos han
sufrido ms de novecientos atentados

terroristas lo que ha generado

contaminacin del medio ambiente
debido al derramamiento de ms de 450
millones de litros de petrleo creando un
impacto ambiental no solo en territorio
colombiano debido a la contaminacin
de ros, quebradas y dems corrientes
hidrogrficas, que con el pasar del
tiempo constituye un problema de
ambiental de escala mundial. Los
derrames de petrleo en suelo generan
una serie de cambios fsico-qumicos
como evaporacin y penetracin que de
acuerdo a la casa de hidrocarburo
pueden ser ms lentos, lo que genera
mayor
toxicidad,
incrementa
las
concentraciones salinas impidiendo el
ptimo desarrollo de microorganismos
que contribuyen al tratamiento de aguas
y suelos contaminados. Por otro lado,
cuando los derrames suceden en fuentes
hdricas, se generan grandes daos en la
fauna marina. La manera en la que el
ecosistema acutico se ve afectado es
que el hidrocarburo forma una pelcula
que evita que los rayos solares penetren
en el fondo y se produzca la fotosntesis;
la falta o disminucin de plantas
fotosintticas reduce el aporte de
oxgeno y alimento al ecosistema. Sin
embargo a pesar de la contaminacin en
suelos por este hidrocarburo los suelos
siguen manteniendo una gran cantidad
de microorganismos como bacterias y
hongos que son capaces de utilizar el
petrleo hasta el punto de encontrar ms
microorganismos que en los suelos no
contaminados (Fig 1).

Figura 1: diversidad microbiana en una muestra

contaminada por petrleo, fotografa del Centro de
Investigaciones Microbiolgicas

En respuesta a esto se han generado

tcnicas que implementan la relacin

existente entre la diversidad de
microorganismos; la biorremediacin es
una tcnica que explota la diversidad
gentica y la versatilidad metablica de
los
microorganismos,
para
la
transformacin de contaminantes en
productos finales menos peligrosos, los
que son de este modo incorporados a los
ciclos biogeoqumicos naturales.
El principio bsico del proceso de
biorremediacin
consiste
en
la
destruccin de la estructura de los
hidrocarburos para convertirlos en los
componentes no txicos de bixido de
carbono, agua y biomasa (Fig. 2).

Hidrocarburo
1. Microorganismos
2. Nutrientes
3. Oxgeno

H2O+CO2+Biomasa
Figura 2: Principios de la biorremediacin

Bsicamente

es
el
uso
de
microorganismos como hongos, plantas,
bacterias modificadas genticamente; la
biorremediacin se clasifica de acuerdo
al organismo implementado en la
transformacin
de
sustancias,
encontrando la fitorremediacion, con el
uso de plantas para disminuir o eliminar
la contaminacin de suelos y aguas
producida por metales pesados, tambin
encontramos animales que poseen en su

interior flora bacteriana capaz de eliminar

metales pesados; sin embargo para este tipo
de tcnica las ms empleadas son las
bacterias empezando esto hasta hace ms
de dos dcadas en los lugares afectados por
este tipo de catstrofes, en los cuales
merecen una total atencin los procesos de
degradacin biolgica basados en la accin
de los microorganismos sobre los productos
contaminantes, entre los microorganismos
que pueden llevar a cabo este proceso
encontramos: Alcalinivorax, o Planococcus,
Acinetobacter
lwoffii,
Pseudomonas
alcaligenes,
Comamonas
testosteroni,
Alcaligenes xilosoxidans, Klebsiella oxytoca,
Escherichia
coli,
Marinobacter,
Staphylococcus, Micrococcus, Sphingomonas
o Geobacillus y otros como Lactobacillus,
Bacillus, Spirillum
y hongos como
Aspergillus, Penicillium, Cndida que son
utilizados en procesos de biorremediacin
gracias a que en su genoma tienen genes que
codifican para varias enzimas con actividad
peroxidasa y oxigenasa que permiten la
oxidacin de algunas fracciones de petrleo.
Esta oxidacin cambia las propiedades de los
compuestos hacindolos susceptibles a
ataques secundarios y facilitando su
conversin a dixido de carbono y agua,
adems, lo utilizan como fuente de energa,

reduciendo as de esta manera la

contaminacin de suelos y aguas por
hidrocarburos.

a que la utilizacin de
microorganismos en la biorremediacin
es limitada, se ha optado por utilizar
bacterias transgnicas que sirvan de
utilidad en este proceso. El objetivo
principal es llevar a cabo la insercin de
plsmidos en la Escherichia. coli, los
cuales contenan la informacin gentica
del Bacillus cereus cepa CMB-503 y la
Pseudomona putida KT2440 los cuales
codificaban
para
las
enzimas
desoxigenasa y oxigenasa, que son las
encargadas
de
descomponer
hidrocarburos; esta manera se generaba
una
E. coli transgnica capaz de
degradar hidrocarburos, abriendo de
esta
manera
puestas
para
la
implementacin
de
otros
microorganismos.
Debido

Bacillus cereus cepa CMB-503

Es un microorganismo gram positivo en

los cultivos jvenes y a medida que
envejece puede verse como gram
variable o gram negativo. Las esporas
aparecen claras en la tincin de gram y
verdes con la tincin de esporas estas
pueden estar dentro de la pared
bacteriana o puede deformar la pared.
Las temperaturas de crecimiento:
mnima estn entre 15C a 20C y la
mxima es entre 40C a 45C con una
ptimo de 37C.
La cepa CMB-503 identificada como

Bacillus cereus (Fig.3) produce sustancias

que reducen la tensin superficial del
agua hasta valores de 28mN/m
denominados biotensioactivos cuyas

propiedades son la emulsificacin y

reduccin de viscosidad de aceites
crudos como el petrleo adems de las
enzimas desoxigenasa y oxigenasa.
Presentan un amplio espectro de
biomolculas donde se incluyen cidos
grasos, glicolpidos, entre otros.

1981 el comit de ADN recombinante de

los Institutos de la Salud de EEUU
certific que la cepa P. putida KT2440
curada del plsmido TOL no es patgena
para animales y plantas, y se puede
considerar como un hospedador seguro
en la clonacin de genes de bacterias del
suelo. El genoma completo de P. putida
KT2440
ha
sido
recientemente
secuenciado y se encuentra disponible en
bases de datos de libre acceso, lo que
constituye una herramienta muy valiosa
para el anlisis funcional de la
informacin
gentica
del
microorganismo.
La cepa

Figura 3: Genoma Bacillus cereus cepa CMB-503

Fuente: http://wishart.biology.ualberta.ca
Pseudomona putida KT2440

P. putida, es una de las cepas de mayor

inters industrial entre las bacteria del
gnero Pseudomonas, ya que unido a su
potencial de degradacin de compuestos
aromticos y xenobiticos, presenta la
capacidad de colonizar el sistema
radicular de plantas, formar biopelculas
y de ser manejable desde el punto de
vista gentico. La cepa P. putida KT2440
(Fig. 4) es un mutante deficiente del
sistema de restriccin de ADN de la cepa
P. putida mt-2 aislada originalmente en
Japn. Esta ltima porta el plsmido TOL:
pWW0, que codifica una ruta de
degradacin de tolueno y xilenos que es
una de las mejor caracterizadas en el
mbito de la biodegradacin atendiendo
a los aspectos bioqumico y gentico. En

KT2440 revela las rutas

metablicas para la transformacin de
una variedad de compuestos aromticos,
varios de estos compuestos aromticos
son derivados de la lignina y puedan
surgir durante la descomposicin de
plantas, la P. putida modifica las diversas
estructuras de estos compuestos
aromticos. El genoma revela 18
dioxigenasas; se encuentran tres genes
homlogos que codifican para la familia
taurina dioxigenasas (PP0229, PP0169,
PP4466) y genes que codifican 15
monooxigenasas, en su mayora de
origen desconocido Aunque la P. putida
KT2440 ha sido aprobada como una cepa
de seguridad biolgica, la bacteria
comparte una estrecha relacin evolutiva
con los oportunistas humanos patgeno
P. aeruginosa y otros Pseudomonas que
son patgenos de plantas.

2. Digestin del Plsmido y ligacin

En este paso se realiza la
introduccin del fragmento de DNA
(paso anterior) en un plsmido
vector INC M de 78 KB fig (6)
codificante para la resistencia a
antibiticos pues posee dos genes
AAC 3 V que le confiere resitencia a
la gentamicina y el gen AAC 3 II gen
de resistencia a la amikacina como
vehculo de clonacin y como un
marcador de seleccin.
Figura 4: Genoma Pseudomona putida KT 2440
Fuente: http://wishart.biology.ualberta.ca

ATERIALES Y MTODOS

Para realizar la insercin y clonacin de

plsmidos con el genoma del Bacillus

cereus cepa CMB-503 y Pseudomonas
putida KT2440 en la Escherichia coli se
realizaron los siguientes pasos:
1. Extraccin del DNA plasmdico y
obtencin secuencia especifica
del Gen de inters.
Se realiza lisis celular de Pseudomonas
putida KT2440 y Bacillus cereus cepa
CMB-503 luego se utilizan enzimas de
restriccin para el corte del segmento
deseado, con la caracterstica que en sus
extremos la secuencia queden cadenas
monocatenarias que permita la fcil
cohesin del segmento a la nueva cadena
recombinante; para esto utilizaremos
enzimas como la EcoR1, Hind III, Sma I,
entre otras, caracterizadas por realizar un
corte de tipo cohesivo en secuencias
especificas.

Recordemos que los plsmidos son

crculos
pequeos
de
DNA
bicatenario independientemente del
cromosoma
bacteriano,
que
contiene un segmento capaz de
llevar a cabo la funcin de
replicacin de el mismo; esto es
fundamental para la clonacin o
replica de DNA recombinante. Este
es igualmente cortado por una
enzima de restriccin que genere un
corte cohesivo, para formar un
fragmento lineal. (Fig. 6)
A este fragmento le son introducidos
tres genes homlogos (PP0229,
PP0169, PP4466) de la Pseudomona
putida y gen del Bacillus cereus; por
la unin de los fragmentos por sus
extremos
cohesivos
(complementariedad
de
bases)
incubadas en presencia de un ADN
ligasa. (Fig. 7)

(1, 2) las cuales posteriormente van a

ser clonadas con el plsmido y
sembradas en agar nutritivo preparado
con
una
concentracin
mnima
inhibitoria (1ug/ml) de Gentamicina que
normalmente impide el crecimiento de
esta cepa.

Figura 6. Vector de clonacin INC M con

gen AAc(3) V, de resistencia a la Gentamicina

A continuacin del aislamiento de las

clulas transformadas de Escherichia
coli, se hace una resiembra en el medio
de cultivo HCB, para ver la expresin de
los genes insertados.

Figura. 8 Imagen de una clula transformada

RESULTADOS
Siembra en agar nutritivo con 1ug/ml de
Gentamicina (Tabla 1).
MICROORGANISMO
Figura 7. Plasmido recombinante
3. Transformacin y clonacin
En este paso se realiza la insercin del
plsmido
que contiene el DNA
recombinante a la bacteria E. coli. Se
realiza una incubacin de el plsmido
junto con las dos cepas puras de E. coli
para que este sea introducido en la
clula. (Fig. 8)
La investigacin se llevo a cabo utilizando
dos cepas diferentes de Escherichia coli

E. coli (1)
E. coli (2)

SENSIBILIDAD A
LA
GENTAMICINA
Resistente
Resistente

Tabla 1. Crecimiento en el agar nutritivo con la

concentracin inhibitoria mnima de gentamicina

Resiembra en agar HCB (Tabla 2).

MICROORGANISMO

CRECIMIENTO
AGAR HCB

E. coli (1)

Positivo

E. coli (2)

Positivo

Tabla 2. Crecimiento en agar HCB

EN

ISCUSIN

El conocimiento de la diversidad
microbiana y su utilizacin en la
biorremediacin es la respuesta biolgica
al abuso ambiental constituyndose
como una muy buena estrategia de
limpieza
de
ciertos
tipos
de
contaminacin, como en este estudio la
contaminacin por hidrocarburos. Por
ser el Bacillus cereus cepa CMB-503 y
Pseudomona putida KT2440 capaces de
biodegradar hidrocarburos gracias a su
codificacin gentica, es interesante
llevar a cabo un procedimiento mediante
el cual sean insertados los genes
codificantes para la produccin de
enzimas de degradacin a bacterias que
no las producen, as por medio de
plsmidos llevar a cabo el proceso de
transformacin a otras bacterias, para
que tambin sean utilizadas en la
biotecnologa
como
bacterias
remediadoras en la contaminacin de
suelos y aguas por petrleo.
En este proyecto de investigacin se
implementaron
fundamentos
de
diferentes tcnicas de Biologa molecular
con el fin de elaborar un plsmido
genticamente modificado para la
insercin de genes codificantes para
diferentes
enzimas;
genes
que
inicialmente son extrados de bacterias
(ya mencionadas) donde naturalmente se
encuentran en su componente gnico,
para finalmente ser insertados en cepas
de E. coli; con el fin de que esta pueda
degradar el petrleo. En este proceso la
utilizacin de un vector tiene dos
funciones que son servir como vehculo

del gen y adems comprobar que clulas

poseen el gen.
En primera instancia el plsmido por
propiedades
de
autorreplicacin
permitir que al ocurrir divisin celular,
el gen insertado no solo lo posea la
bacteria a la cual fue insertado sino toda
su descendencia; en segunda instancia
para evidenciar esta realidad este
plsmido contiene un gen que funciona
como marcador de seleccin, este es
codificante para crear resistencia a la
aminoglucosido gentamicina.
La
identificacin de las clulas con ADN
recombinante, como ya se haba
mencionado, se utiliz el agar nutritivo
con la concentracin inhibitoria mnima
(1ug/ml) de gentamicina. En el cual se
obtuvo que los microorganismos
empleados sean resistentes (Tabla 1), es
decir estas cepas contienen el plsmido
insertado.
Adems de comprobar que si fue
insertado el plsmido exitosamente se
requiere evaluar la expresin de los
genes con tal propsito se utiliz el agar
HCB (Extracto de hidrocarburos 10g/ml
Agar tripticasa soya 10 g/ml) el cual no
contiene ningn otro tipo de nutriente,
ms que el nombrado, por lo tanto el
crecimiento de la bacteria nos planteara
que esta posee las enzimas oxigenasa y
dioxigenasa que codifican para la
degradacin de los hidrocarburos, el no
crecimiento bacteriano nos indica que no
posee el plsmido recombinante; de esta
manera corroboramos la sntesis de
enzimas en ambas cepas (Tabla 2).
Los microorganismos a los cuales se les
insert
el
plsmido
para
su
transformacin fueron introducidos en
un ecosistema controlado simulando la
orilla de un ro de ambiente tropical con

ptimas condiciones de humedad y

temperatura en el cual se derram una
cantidad de petrleo, esto sirvi para
evidenciar que las cepas haban sido
transformadas y por lo tanto contenan la
informacin gentica necesaria para la
degradacin del hidrocarburo (Fig. 9)

1)

2)

3)

Figura 9. Biodegradacin de petrleo. 1)

Ambiente contaminado con hidrocarburo. 2)
Inoculacin de cepa transformada. 3)
Biodegradacin de petrleo por accin de
las enzimas

ONCLUSIN

Las prcticas de biorremediacin

consisten en el uso de microorganismos
como
plantas,
hongos,
bacterias
naturales o modificadas genticamente
para neutralizar sustancias toxicas,
transformndolas en sustancias menos
txicas o convirtindolas en inocuas para
el ambiente y la salud humana. En este
caso utilizamos cepas de microorganismo
Escherichia coli, caracterizada por ser una
bacteria muy verstil, ya que su genoma
y sus caractersticas microbiolgicas
permiten la aceptacin de plsmidos sin
verse afectada.
Al llevar a cabo la transformacin de
cepas de Escherichia coli, mediante la
insercin de un plsmido que contena la
informacin gentica proveniente del
Bacillus cereus cepa CMB-503 y de
Pseudomona putida KT2440, el cual
codificaba para las enzimas dioxigenasa
y oxigenasa que son las responsables de
la degradacin de hidrocarburos,
concluimos que esta cepa transgnica o
genticamente modificada es apta para
la degradacin de hidrocarburos como el
petrleo, ya que como se probo
anteriormente esta versin mejorada
de la E. coli est en la capacidad de
romper compuestos aromticos de gran
complejidad molecular por la sntesis de
las enzimas necesarias para tal proceso.

Referencias
1. Biorremediacin
de
suelos
contaminados con hidrocarburos

derivados del petrleo. Joaqun

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Gladis Quintero Msc, Andrea
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con
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Camargo, Jos Javier Higuera,
Emilio
Fernndez
Reyes,
Departamento de Bioqumica y
Biologa
Molecular,
Campus
Universitario de Rabanales.