Está en la página 1de 12

Determinacin de glucgeno heptico

Introduccin:
El glucgeno es un polisacrido el cual est presente en casi todos los rganos y
tejidos presenta una forma globular, tiene la propiedad de ganar o perder molculas
de glucosa con gran facilidad, es la forma de almacenamiento de a glucosa en los
animales.
El glucgeno presenta varias unidades de -D-glucosa, las cuales estn unidas por
enlaces glucosdicos ( 1 4) y ( 1 6). Es imprtate mencionar que el glucgeno
se deposita principalmente en el hgado (2 a 5 %/Kg) y en los msculos (0.5 a 2
%/Kg) de donde se toma cuando es necesario (glucogenlisis).
Objetivos:
Cuantificar el contenido de glucgeno heptico.
Relacionar la presencia de glucgeno con la glucognesis.
Material:
4 tubos de ensaye
2 pipetas de 5 mL
4 tapones de plstico
1 embudo
Bao Mara (95 C)

Centrifuga
Refrigerador
Tijeras
Papel filtro

Material biolgico:
Hgado de rata recin sacrificada.
Reactivos:
KOH 30 %
Etanol absoluto
Fenol 80 %
H2SO4 concentrado
Glucgeno solucin estndar 5, 10, 20, 40 mg/2 ml
Desarrollo:
1. Pesar 1 g de hgado de rata recientemente sacrificada.
2. Colocar el hgado en un tubo de ensaye que contenga 4 mL de KOH al 30 %.
3. Con las tijeras cortar el tejido (dentro del tubo).
4. Tapar el tubo con un tapn de caucho e introducirlo en un bao Mara a 95 C,
dejar hidrolizar durante 30 minutos.
5. Retirar el tubo del bao y adicionar 1:2 volmenes de etanol absoluto,
(aproximadamente 3 mL) dejar en refrigerador durante 20 minutos.
6. Retirar del refrigerador y centrifugar durante 15 minutos a 3000 rpm. Deseche
el sobrenadante.
7. Adicione 10 mL de etanol, tape, agite en el vortex y guarde en el refrigerador.
8. Filtre y colecte en un tubo de ensaye limpio.
9. Coloque en dos tubos de ensaye alcuotas de 2 mL del filtrado.

10.
Adicione a cada tubo 0.1 mL de fenol al 80 % y 2 mL de H 2SO4
concentrado TENGA CUIDADO, esta operacin debe realizarse en no ms de 5
segundos.
11.
Leer en espectrofotmetro a 490 nm.
Curva patrn:
Numero de tubo
Glucgeno
1
2
3
4
5 mg
2.0 mL
------10 mg
--2.0 mL
----20 mg
----2.0 mL
--40 mg
------2.0 mL
Fenol 80 %
0.1 mL
0.1 mL
0.1 mL
0.1 mL
H2SO4
2.0 mL
2.0 mL
2.0 mL
2.0 mL
Leer en absorbancia a 490 nm
Los valores obtenidos del filtrado de hgado se interpolan en la curva patrn, la
concentracin as determinada e multiplica por 12.5 que es el factor de dilucin.
Cuestionario:
1. Cul es la funcin del KOH?
2. Cul es la relacin que se realiza en el filtrado al adicionar fenol y H2SO4?
3. Podra detectar almidn con esta tcnica?
4. Cmo se relaciona el glucgeno con las vas metablicas de
carbohidratos?

Determinacin de la actividad de la enzima versin 1


Succinato deshidrogenasa
Introduccin:
La enzima succinato deshidrogenasa o deshidrogenasa de cido succnico es una
oxidorreductasa que cataliza la oxidacin del succinato para formar fumarato siendo
la coenzima el FAD. Esta enzima e localiza en eucariotas en la membrana
mitocondrial interna.

El H2 cedido por el succinato puede ser transferido del FADH 2 a un colorante


susceptible como el azul de metileno que al cambiar su estado rdox pasa de
coloreado a incoloro o violeta.

Objetivo:
Que el alumno aprecie la actividad de la enzima succinato deshidrogenasa mediante
una reaccin colorimtrica.
Material:
2 tubos de ensaye
2 pipetas de 5 mL
Reactivos:
NaOH al 10 %
cido succnico al 3 %
Neutralizado con NaOH al 10
% hasta pH = 7.4

Bao Mara a 50 C
Pinzas para tubos de ensaye

Fenol al 90 %
Azul de metileno al 0.1 %
Aceite mineral

Reactivos biolgicos:
Hgado de rata
Desarrollo:
1. Pesar 1 g de hgado de rata recientemente sacrificada.
2. En el mortero molerlo con 3 o 4 mL de cido succnico hasta obtener una
masa.
3. Trasferir en partes iguales a 2 tubos y proseguir segn la siguiente tabla:
Nmero de tubo
Reactivo
1
2
Fenol al 90 %
1.0 mL
--Azul de
2 gotas
2 gotas
metileno
Mezcla de cada tubo
Aceite mineral
0.5 mL
0.5 mL
4. Incube ambos tubos 10 minutos en el bao Mara a 50 C.

5. Observe los cambios.


Cuestionario:
1. Cules son los colores del azul de metileno en sus estados oxidado y
reducido?
2. Cul es la funcin del fenol de la reaccin?
3. En qu va metablica est involucrada la enzima succinato deshidrogenasa?

Determinacin de la actividad de la enzima versin 1


Material
Reactivos
8 tubos de ensaye
Azul de metileno 0.002 M
5 pipetas de 5 mL
Succinato de sodio 0.1 M
Malonato de sodio 0.1 M
Agua destilada
Suspensin de hgado o corazn
Sobrenadante de hgado o
corazn

Accin de la amilasa sobre el almidn


(durante la germinacin)
Introduccin:
La germinacin se presenta cuando las semillas realizan una serie de cambios
dando como resultado el desarrollo de una plntula. Para que esto suceda, al
alimento que fue almacenado en la semilla, es empleado como fuente de energa.
En las semillas, el alimento de reserva es el almidn, polisacrido formado por 15
20 % de amilosa y 80 85 % de amilopectina.
Para que la energa guardada sea aprovechada interviene una enzima que degrada
el almidn a carbohidratos ms simples. Esta enzima es una amilasa que hidroliza
los enlaces a (1 4) tanto de la amilosa como de la amilopectina.
Objetivo:

Demostrar la actividad de la amilasa en semillas de frijol alubias durante la


germinacin.
Material:
1 pipeta de 10 mL.
3 cajas de Petri.
1 vaso de precipitados.
1 estufa de incubacin a 25 C.
Material biolgico:
Los alumnos debern traer 10 a 12 frijoles alubias (de preferencia grandes
de tamao homogneo) limpias y sin germinar.
Material que deben traer los alumnos:
1 gotero.
3 alfileres.
de pliego de papel
Navaja o bistur.
Un lpiz graso.
manila.
1 regla trasparente.
20 g de algodn absorbente.
3 frascos gerber de 100 mL
para iniciar la germinacin.
Reactivos:
Agar nutritivo adicionado con almidn. (200 mg de almidn/100 mL de medio)
Solucin reveladora: Lugol.
Desarrollo:
1. En cada frasco gerber se coloca algodn completamente mojado (con agua de
la llave) en el fondo. Se colocan 3 4 frijoles o alubias, bien lavadas, en cada
frasco distribuyndolos de la mejor manera, de modo que su ombligo (mancha
central) quede orientando hacia la pared del frasco.
2. Con el papel manila envolver los frascos cerrados sin que la tapa este
apretada, escribindole a dicha envoltura los siguientes datos: materia,
semestre y grupo al que pertenecen, seccin de laboratorio, nombre del
responsable del equipo, contenido, y fecha en que se inicia y termina la
incubacin (incluyendo hora).
3. Se incuban los frascos de 3 a 4 das en la estufa de incubacin cuidando que
la temperatura sea de 25 30 C.
4. Para realizar la practica deber contar con tres cajas Petri numeradas.
5. El da de la prctica se eligen 8 semillas y se les elimina el embrin y la raicilla
(si las tienen) con la navaja o bistur y adems se abren a lo largo colocando
hacia arriba su ombligo, obtenindose as 16 mitades. De preferencia la
cascara se quita despegndola antes o despus de obtener las mitades.
A 8 mitades (mitades A) se les cortaran las orillas colocndolas con la parte plana
hacia debajo de modo que su forma ya no sea elptica sino rectangular.

Las otras 8 mitades (mitades B) seran sometidas a un corte muy delgado de la


cara plana para eliminar los pequeos bordes naturales. A todas las mitades se les
pica con el alfiler en tres partes de manera perpendicular a la cara plana.

6. Dividir las placas de Petri en cuadrantes usando un plumn por la parte


exterior.
7. Inmediatamente despus de los cortes, en cada placa (calculando la mitad de
cada cuadrante) se colocan dos mitades A con la cada plana hacia abajo, y se
presionan ligeramente para marcar el agar, se retira y a continuacin con la
navaja se corta el agar para hacer un hueco sobre la forma que dejo impresa
la semilla (cuidado no llegar hasta el fondo de la caja) y luego se coloca la
mitad, de modo que por lo menos dos de sus costados toquen el agar.
Tambin en cada placa se colocan mitades B con la cara plana hacia abajo y
se presionan ligeramente para fijarlas cuidado de no romper el agar.
8. Una vez colocadas todas las mitades en las placas se coloca una pequea
gota de agua por un costado de cada mitad para mojar las partes de contacto
entre las semillas y el agar. Esta agua puede ser de la llave, pero debe de
estar atemperada a 25 30 C. Se mojarn las semillas mximo cada 20
minutos o menos, controlando que no se sequen las zonas de contacto y
acomodando las semillas A o presionando las semillas B, si es necesario Las
placas se incuban a 25 30 C segn la siguiente tabla:
Nmero de placa
Tiempo de incubacin
1
30 min.
2
45 min.
3
60 in.
9. Despus de transcurrido el tiempo de incubacin, se revelan las placas con
lugol, de la siguiente manera: A cada placa se agrega gota a gota el revelador
(lugol) necesario para cubrir ligeramente toda la placa y se deja actuar por 2
minutos. Despus, se elimina el revelador por vertido y se enjuaga la placa
con agua de la llave cuidando de que no se desprenda el agar de la placa. Se
miden las zonas translcidas con la regla.
Tabla de resultados:
Tiempo de revelado

30 min.
45 min.
60 min.

Promedio de las zonas traslcidas de las


semillas
A
B

Cuestionario:
1. Cul es el fundamento de la presencia o ausencia de almidn al momento de
revelar?
2. Qu indican las zonas traslcidas?
3. Por qu a mayor tiempo es mayor la zona traslcida?
4. hay almidn en la zona traslcida? si no lo hay, en que se trasform?

Oxidaciones biolgicas
Oxidacin por perdida de electrones
Material
Reactivos
2 matraces
0.5g de granalla de
Erlenmeyer de 250
fierro.
H2SO4 al 10 %.
mL.
Tapn con vlvula
Agua destilada.
Bunsen.
K3[Fe(CN)6]
Pipeta de 10 o 15
(ferrocianuaro de
mL.
potasio) 0.5 %.
Pipeta 1 mL.
KSCN (sulfocianuro
2 capsulas de
de potasio) 0.5 %
KMnO4 0.1 M.
porcelana.
1 probeta de 50
mL.

Desarrollo:

1. Coloque en un matraz provisto de tapn con vlvula de Bunsen abierta, 0.5 g


de fibra de Fe y 15 mL de H 2SO4 al 10%; mezcle enrgicamente para tratar de
disolver el hierro (lo ms posible), antes de calentar.
2. Caliente a ebullicin hasta la disolucin del Fe, evitando que se evapore
completamente la mezcla. Si es necesario aada ms cida.
3. Enfre al chorro del agua en la tarja; disuelva el residuo de FeSO 4 (sulfato
ferroso), en 50 mL de agua destilada.
4. Prueba para sales ferrosas. Se coloca en una cpsula de porcelana 1 mL de
solucin de FeSO4 y unas gotas de K3[Fe(CN)6] 0.5%. La obtencin de una
coloracin precipitado azul indicar la presencia de sales ferrosas.
5. Prueba para sales frricas. En otra cpsula de porcelana, coloque 1 mL de la
solucin de FeSO4 y unas gotas de solucin de KSCN 0.5%, un color rojo es
indicio de la presencia de sales frricas.
6. Oxidacin de la sal ferrosa a sal frrica. Coloque en un matraz Erlenmeyer 10
mL de la solucin de FeSO 4 y 3 mL de H2SO4 1 N, caliente a ebullicin
(evitando que se evapore) y en caliente, agregue gota a gota KMnO 4 0.1M
hasta que persista un color rosa muy plido.
7. Para comprobar el paso de sal ferrosa a sal frrica, repita las reacciones de los
incisos (4) con K3[Fe(CN)6] 0.5% y (5) con KSCN 0.5%.
Evidencia de aprendizaje
1. Anote sus resultados en la siguiente tabla:
Soluciones de:
FeSO4
Fe2(SO4)3
Sales ferrosas
Sales frricas
2. Qu gas es el que escapa durante la dilucin del hierro?
3. Escriba las reacciones qumicas en cada caso.
4. Si el KMnO4 es capaz de oxidar al FeSO4 Qu compuestos se reduce?
5. Escriba la reaccin de xido reduccin efectuada.

Oxidacin por deshidrogenacin


Material
Reactivos
7 tubos de ensaye
Azul de metileno
3 pipetas de 5 mL
diluido.
Na2S2O4
(hidrosulfito de
sodio).
Vaselina
H2O2 al 0.4 %.
FeCl3 al 1 %.

Desarrollo:
1. Prepare una serie de 7 tubos de ensaye y numrelos.
2. Aada a cada uno, 5 mL de la solucin de azul de metileno diluido.

3. Agregue a cada uno de los tubos, gota a gota una solucin recin preparada
de Na2S2O4, no debe estar turbia; cuente el nmero de gotas necesario para
decolorar completamente la solucin de azul de metileno.
4. El tubo 1 es el testigo en reposo; a temperatura ambiente mida el tiempo que
tarda en recuperar el color azul
5. e) Los tubos 2, 3, 4 y 5 se someten a los tratamientos indicados en la tabla
siguiente. Mida el tiempo que tarda cada tubo en recuperar el color azul.
Tubo
1
2
3
4
5
Tratami Repos
0.5 mL
Bao
Bao Agitac
ento
o
vaselina
de
Mara
in
estratific hielo
a
ando
ebullic
in
6. A los tubos 6 y 7, sin agitarlos y a temperatura ambiente, agrega los reactivos
indicados en la tabla siguiente, contando el nmero de gotas necesario para
que recuperen el color azul.
Tubo
6
7
Tratamiento
H2O2 al 0.4 %
FeCl3 al 1 %
Evidencia de aprendizaje:
1. Anote en la tabla, el tiempo necesario para que cada tubo recupere el color
azul.
Tubo
1
2
3
4
5
Tiemp
o (seg)
2. Anote en la tabla, el nmero de gotas necesario para recuperar el color de
cada tubo
Tubo
6
7
No. De
gotas
3. Escriba la reaccin qumica que se ha efectuado.

Rutas metablicas
Introduccin:
Las rutas metablicas comparten varias caractersticas comunes, por ejemplo, la
mayora requiere de ATP como fuente fundamental de energa.
La glucosa que entra a las clulas se puede degradar para producir energa. La ruta
por la cual la glucosa se degrada se denomina glucolisis; si la clula no tiene una
demanda de energa, la glucosa se almacena en las molculas del glicgeno. La ruta
por la cual se produce el glicgeno se denomina glicognesis. Lo opuesto de la
glicognesis es la glicogenlisis. En el citosol la glucosa inicialmente es activada
utilizando la clula 2ATP, posteriormente en el proceso se generan 4ATP por un
proceso denominado: fosforilacin a nivel de sustrato, que es una forma primaria de
sintetizar ATP a nivel citoplasmtico. Simultneamente durante la degradacin de la
glucosa se liberan hidrgenos citoplasmticos en un proceso conocido como des
hidrogenacin los cuales son retenidos por la coenzima NAD+ que tras recibir 2H,

reduce a NADH+H. El cido piruvico producido, es una molcula clave que puede
continuar a travs de dos vas citoplasmticas
Va anaerbica.
Se da cuando hay escasez o ausencia de oxigeno citoplasmtico, tambin se llama
va fermentativa de la cual se conocen dos formas. Fermentacin lctica y
alcohlica.
Objetivos:
Material:
Corcho con dos
agujeros
pH metro
Rallador
Manguera
Botella de vidrio

Matraz 100 mL
Termmetros
Varillas de vidrio
Vaso
de
precipitados 150
250 mL
Mortero

Reactivos:
Agua destillada 500 mL
Muestras:
Azcar 50 gr
Pia 50 gr
Levadura 50 gr
Agua 250 mL (corriente)
Desarrollo:
1. Armar

el

instrumento

como

en

el

diseo

2. Preparacin de un fermento son aire.


3. Aplicar en el envase un caldo de cultivo conformado por:
50 g de pia
50 gr de azcar
250 mL de agua destilada

de

la

imagen

25 gr de levadura
Cuestionario: