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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS

ESCUELA DE QUIMICA DE ALIMENTOS

MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL

“AISLAMIENTO, SELECCIÓN, IDENTIFICACIÓN Y


PRESERVACIÓN DE CEPAS QUERATINOLITICAS PARA LA
DEGRADACIÓN DE PLUMAS DE POLLO”

INTEGRANTES:

- BUSTIILLOS MA. BELÉN


- CARTUCHE DIANA
- ESPINOSA CAROLINA
- ESTRELLA MIGUEL
- FEIJOÓ TATIANA
- PORRAS DIEGO

NOVENO SEMESTRE ALIMENTOS

2009 - 2010
INDICE

1. TEMA ........................................................................................................................................ 3
AISLAMIENTO, SELECCIÓN, PRODUCCION DE BIOMASA Y PRESERVACIÓN DE
CEPAS QUERATINOLITICAS DE BACILLUS SPP. PARA LA DEGRADACION DE
PLUMAS DE POLLO ................................................................................................................ 3
2. PROBLEMA .............................................................................................................................. 3
3. ANTECEDENTES ..................................................................... ¡Error! Marcador no definido.
4. JUSTIFICACION ....................................................................... ¡Error! Marcador no definido.
5. OBJETIVOS ............................................................................................................................... 4
6. HIPOTESIS ................................................................................ ¡Error! Marcador no definido.
7. MARCO TEORICO .................................................................................................................... 4
7.1 Plumas de Pollo ..................................................................................................................... 4
7.1.1 Características ................................................................................................................ 4
7.1.2 Usos ............................................................................................................................... 4
7.2 Microorganismos .................................................................................................................. 5
7.2.1 Características: ............................................................................................................... 5
7.2.2 Metabolismo de las bacterias queratinolíticas ................................................................. 5
8. MARCO METODOLOGICO ..................................................................................................... 6
8. 2.1 Selección del Medio de Cultivo ..................................................................................... 6
8.2.2 Aislamiento y Enriquecimiento de Cepas Degradadoras de Plumas ................................ 7
8.2.3 Selección de Cepas Queratinoliticas de Bacillus spp ....................................................... 7
8.2.4 Producción de Biomasa .................................................................................................. 7
9. FACTIBILIDAD ........................................................................ ¡Error! Marcador no definido.
10. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS ..................................................................................... 11
1. TEMA

“AISLAMIENTO, SELECCIÓN, IDENTIFICACIÓN Y PRESERVAC IÓN DE CEPAS


QUERATINOLITICAS PARA LA DEGRADA CION DE PLUMAS DE POLLO”

2. INTRODUCCIÓN

Es normal que en la mayoría de plantas avícolas, los subproductos obtenidos del procesamiento de
carne no son debidamente aprovechados, constituyendo un alto porcentaje de desechos que
producen daños al medio ambiente debido al aumento de la carga microbiana presente en los suelos,
constituyendo una fuente potencial de enfermedades que afectan tanto a los animales de granja como
a los humanos obreros y consumidores.

Generalmente las plumas, uno de estos subproductos, son destinadas a la elaboración de harinas
utilizadas como suplemento alimenticio para aves y otros animales de abasto. Este producto es
obtenido mediante la combinación de tratamientos térmicos (cocción a altas presiones) con
tratamientos químicos (ácidos o alcalinos); procesos que no solo impiden la fragmentación de los
enlaces disulfuro presentes en la queratina de la pluma, convirtiéndola en una proteína muy
resistente que dificulta la degradación enzimática por parte de las aves, sino que también
disminuyen el valor proteico de la harina a un 45% por la destrucción de algunos aminoácidos.

La producción nacional de aves de corral es de 19,595.058, de los cuales un 44% corresponde a la


producción de pollo. El rendimiento de carne obtenido por el procesamiento de esta ave es de
aproximadamente 75 %, lo que indica que el 25% restante pertenece a desperdicios o subproductos,
en donde las plumas constituyen la mayor parte.

Dadas las tendencias actuales dirigidas hacia la búsqueda de procesos biotecnológicos aplicables al
tratamiento de los residuos agroindustriales y a la existencia de un alto potencial microbiano en la
naturaleza capaz de utilizar una amplia variedad de sustratos orgánicos, se sostiene que la
producción de harina de plumas puede ser llevada a cabo por medio de métodos más meticulosos a
través de tratamientos fermentativos con microorganismos queratinolíticos capaces de degradar la
queratina presente en la pluma, mejorando así la digestibilidad de este producto y la calidad
nutricional en un 67% debido a su enriquecimiento con proteína microbiana.

Aproximadamente, el total de plumas procesadas en el mundo es de 50,000 Ton/año, en donde Perú


es el principal exportador para Sudamérica, siendo uno de sus principales compradores el Ecuador.
La venta de 1Ton de harina de plumas cuesta aproximadamente 320 dólares, sin embargo,
comparando con las harinas que actualmente se comercializan en el mercado existe una marcada
diferencia en cuanto al costo; teniendo la harina de soya un costo de 450 dólares/Ton y la harina de
pescado 900 dólares/Ton.

Por estas razones se desea conseguir una harina de plumas de alta calidad proteica y que a la vez
posea bajo costo, capaz de competir a nivel industrial con los diferentes tipos de harinas ya
mencionadas.
3. OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GENERAL

· Aislar, seleccionar, identificar y preservar cepas queratinolíticas para la degradación de


plumas de pollo.

3.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS

· Obtener muestras de plumas blancas de pollo y muestras de suelo de los galpones avícolas.
· Seleccionar el medio de cultivo más adecuado para el crecimiento óptimo de los
microorganismos degradadores de queratina a partir de plumas de pollo.
· Aislar las cepas queratinoliticas utilizando el medio de cultivo adecuado.
· Seleccionar la cepa con mayor capacidad de degradación queratinolítica.
· Realizar pruebas bioquímicas para identificar género y especie de la cepa con mayor
velocidad de transformación.
· Realizar la medición del crecimiento de biomasa, y determinar los parámetros cinéticos.
· Realizar las gráficas de ln de biomasa (ln X), biomasa (X), velocidad específica (µ) y
velocidad instantánea (rx), para la cepa seleccionada en el medio seleccionado.
· Preservar las cepas puras mediante la técnica de crioconservación.

4. MARCO TEORICO

4.1 Plumas de Pollo

4.1.1 Características
Las plumas son estructuras queratinosas de la piel de la aves. Son fundamentales en el vuelo aviar,
pues forman la superficie sustentadora del ala. El conjunto de todas las plumas de un ave recibe el
nombre de plumaje, y forma una capa densa, aislante, que protege al animal frente al agua y el frío.

COMPONENTES %
Materia Seca 88.5
Proteína Cruda 54,5
Grasa 26
Fibra Cruda 1,0
Cenizas 4,5
Calcio 1,0
Fósforo 0,7

4.1.2 Usos

Las plumas pueden ser procesadas y utilizadas en decoración, acolchado y adornado, haciendo uso
de sus características de retención de calor y peso ligero. Pueden se tratadas en las manufactureras
de chaquetas, bolsas de dormir, colchas, almohadas, colchones, etc. Además se las emplea como
harina de plumas (HP) que sustituye a la harina de pescado en alimentos acuícolas.
4.2 Microorganismos

4.2.1 Degradadores Queratinolíticos

BACTERIAS HONGOS
Bacillus spp Rhizopus oryzae
Bacillus licheniformes Arthroderma
Kocuria rosea Ctenomyces
Streptomyces fradiae Chrysosporium
Aphanoascus
Sporothrix

Los microorganismos citados son aquellos que presentan la mayor capacidad de degradación de
queratina. Sin embargo el grupo de las bacterias presentan una velocidad de transformación más alta
en comparación con los hongos.

Estudios realizados anteriormente demuestran que la cepas de Bacillus spp. degradan con mayor
eficiencia el sustrato queratina en comparación con el resto de bacterias ya indicadas.

4.2.2 Características Microbiológicas

Nivel de Bioseguridad 1
Bacterias / Firmicutes / Bacilos / Bacillales / Bacillaceae /
Taxonomía
Bacillus spp.
Tipo de Cepa Degradador de Queratina
Tipo de Enzima Queratinasa
Condiciones Aeróbicas Aerobio Estricto o Anaerobio Facultativo
Forma Bastón
Pared Celular Tinción Gram (+)
Movilidad Positiva - Flagelación perítrica
Esporulación Positiva
Temperatura: 4 – 55ºC Óptima: 26ºC
Condiciones de Vida
pH óptimo: 4,3 – 9,3 Óptimo: 7-7,5
Categoría Nutricional Quimioautótrofo
Fuente C, N, S, y Queratina
Energía

4.2.3 Metabolismo de las Bacterias Queratinolíticas

El proceso de Degradación de la Queratina se basa en el proceso de Sulfitólisis el cual provoca la


ruptura del enlace disulfuro presente en la cisteína, dando lugar al ácido cisteinsulfónico y a otro de
cisteina. A pH ácido puede tener lugar la reformación de un nuevo enlace disulfuro.

4.2.4 Pares Oxido – Reducción


-
Donador : NAD + / NADH ® E0 (- 0 .32 ) 2 e
-
Aceptor : NO3- / NO2- ® E0 (+ 0.42 ) 2 e
4.2.5 Reacción de la Fermentación de Queratina

3C 6 H 8 O4 N 2 S 2 + 3O2 ® 2C 6 H 8 O7 + 6CO 2 + 6 NO3 + 6 SO4 + 4 H 2 O

5. MARCO METODOLOGICO

5.1 METODOS GENERALES DE ANALISIS

5.1.1 Muestreo

El muestreo es no probabilístico intencionado; es decir que las plumas y suelo serán recogidos
de distintas plantas avícolas. Los criterios para obtener la muestra fueron:

} Las plumas seleccionadas debían presentar características similares (blancas, tamaño).


} Lugares: Las muestras se tomaron de tres avícolas ubicadas en la Provincia de Pichincha.
} El suelo tuvo que ser tomado de los mismos galpones de donde se tomaron las plumas.

5.2 METODOS ESPECIFICOS DE ANALISIS

5.2.1 Diseño del Medio de Cultivo para Aislamiento y Selección de Cepas Queratinolíticas

FUENTE COMPONENTE CANTIDAD (g)/L agua

Carbono y Energía Queratina


20
Nitrógeno y Azufre (Pluma de Pollo)

K2HPO4 1
MgSO4.7H2O 200mg
Nutrientes Inorgánicos
FeSO4.7H2O 10mg
(base mineral)
CaCl2 10mg
MnSO4.4H2O 20mg
Elementos Traza Mn, Mo, Cu, Co, Zn 0.02 – 0.5 mg/cada uno

5. 2.2 Selección de un Medio de Cultivo Prediseñado

El medio prediseñado es el Medio Basal (MBS) Salino descrito por Williams y Shih, el cual
contiene por litro de agua:

COMPONENTE CANTIDAD
Extracto de levadura 0.5
NH4CI 0.5
NaCI 0.3
K2HP04 0.4
MgCI2.6H20 0.1

A esta solución salina se debe ajustar el pH a 7,5 con KOH al 10%.


5.2.3 Aislamiento y Enriquecimiento de Cepas Degradadoras de Plumas

Se toman muestras de suelo de diferentes áreas de los galpones de cría de pollos de engorde y se
inoculan en tubos de ensayo que contienen caldo nutritivo como medio de transporte. Después de 24
horas de incubación, se someten a un proceso de pasteurización a 80°C/15min a fin de seleccionar
los microorganismos esporulados. Alícuotas de estos medios se utilizan para inocular tubos
contentivos de una pluma entera y el Medio Diseñado. Estos tubos se incuban a 45°C por 72 h.

Para el enriquecimiento de los microorganismos queratinolíticos y los ensayos cinéticos, se utiliza el


el mismo medio previamente diseñado y la presentación de las plumas varía dependiendo del tipo de
ensayo a ser realizado (enteras o troceadas con tijeras). Se utilizarán plumas enteras para visualizar
el proceso de degradación. Para ello, se introducen las plumas en tubos que contienen 5 mL del
medio.

5.2.4 Selección de Cepas Queratinoliticas

Se realizan aislamientos en Agar Nutritivo y se seleccionan colonias morfológicamente diferentes.


Cada una de ellas se inoculará en tubos que contienen el medio diseñado fresco con plumas enteras e
incubadas a 40°C para evaluar su capacidad queratinolítica. Observaciones periódicas del estado de
las plumas permitirán conocer el grado de desintegración alcanzado y seleccionar la cepa que
produce la mayor degradación en el tiempo más corto.
Al mismo tiempo, en estos ensayos se realizará un control, consistente en un tubo con medio
diseñado y pluma entera que no será inoculado.

5.2.5 Producción de Biomasa

5.2.5.1 Propagación y Cultivo de las cepas Queratinoliticas

Inocular un medio precultivo en fiolas Erlenmeyer con 30ml de medio de plumas troceadas (5 g/L) e
incubar a 40°C/48h en el shaker orbital, con una velocidad de agitación de 75 rpm.
Para los ensayos cinéticos, los cultivos se realizaran durante 48h con una concentración de plumas
de 20g/L y una agitación de 75 rpm, que serán las condiciones óptimas para lograr una mejor
homogeneidad y baja viscosidad del medio.

5.2.5.2 Determinación de la Medida de Biomasa Microbiana

El contenido de un cultivo en Erlenmeyer con medio de plumas troceadas, se filtra a través de un


micropore y, con la suspensión celular obtenida, se prepararan diluciones seriadas de 30 mL en
tubos con agua destilada. Una fracción de 25 mL de cada una de estas diluciones se coloca en tubos
(prepresados) y se centrifuga a 3000 rpm/40 min. El sobrenadante obtenido se descarta y el
sedimento celular se resuspende con 25 mL de agua destilada (repetir dos veces).
Finalmente, los tubos con el sedimento se colocan a 100°C/12h y, transcurrido este tiempo, se dejan
a temperatura ambiente por 1h antes de ser pesados nuevamente. Con los 5 mL restantes del filtrado,
se determina la absorbancia a 600 nm. Estos valores se correlacionan con la diferencia de peso
obtenido en cada caso para construir la curva de calibración.
Para la determinación de la biomasa en los caldos de fermentación, se sigue el procedimiento antes
descrito y se realiza diluciones de los filtrados de las muestras, para luego ser leídas a 600 nm contra
un blanco de agua destilada.
5.2.6 Preservación de los Microorganismos

La conservación de las cepas aisladas se realiza a 40°C en estrías (cuñas) de medio sólido
previamente diseñado para cepas con actividad queratinolítica y suplementado con 20 g/L de agar y
20 g/L de harina de plumas, previamente inoculadas e incubadas a 40°C.

6. ANEXOS

6.1 Aislamiento, Enriquecimiento y Selección de Cepas Queratinolíticas

Inocular < 0.5 g de


muestra de suelo estéril

10 ml de caldo
nutritivo

Incubar por 24 horas Pasteurizar a 15 min.


Por 80 º C

Microorganismos
esporulados

Inoculación

Pluma entera y
Medio Diseñado
(5 ml)
45 º C por 72 horas
Pluma entera y
Medio Diseñado
(5 ml)
Incubadas 45 º C por
72 horas

Aislamiento en
Agar nutritivo
Selección de colonias morfológicamente diferentes

Pluma troceada y
Medio Diseñado
(5 ml)
Incubadas a 40 º C

Cepa que produce la mayor degradación en el tiempo más corto.

6.2 Producción de Biomasa

6.2.1 Propagación y Cultivo de las cepas Queratinoliticas

Medio Precultivo

30 ml de medio de
plumas troceadas,
40º C/ 48h

Shaker orbital, con una velocidad de agitación de 75 rpm

Ensayos Cinéticos, 48
horas con 20g/L de
medio de plumas y una
agitación de 785 rpm

Condiciones óptimas para lograr para lograr homogeneidad y baja viscosidad del medio
6.2.2 Determinación de la Medida de Biomasa Microbiana

Medio de plumas troceadas

Filtrar

Diluciones
seriadas de 30 ml
con agua
destilada
Centrifugar a 6000 rpm/20 min.
Sedimento celular se resuspende con 25 mL de agua destilada

Incubación 100º C
/12h

(por duplicado)

Realizar Pruebas de Cuantificación

6.2.3 Preservación de los Microorganismos

Cepas a 40ºC por


estriado en Medio
Diseñado con Agar y
Medio de Plumas
CEPAS SELECCIONADAS (20g/L)
7. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

1. http://www.sica.gov.ec/cadenas/maiz/docs/produc_avicolamod.html
2. http://www.atcc.org/ATCCAdvancedCatalogSearch/ProductDetails/tabid/452/Default.aspx
3. http://es.wikipedia.org/wiki/Bacillus
4. http://www.saber.ula.ve/bitstream/123456789/27333/2/articulo7.pdf
5. http://www.bioone.org/doi/abs/10.1642/0004-
8038(2004)121%5B0656:BDOBAW%5D2.0.CO%3B2
6. http://es.wikipedia.org/wiki/Pluma
7. http://turnkey.taiwantrade.com.tw/showpage.asp?subid=137&fdname=MISCELLANEOUS&pa
gename=Planta+procesadora+de+plumas+de+aves+de+corral
8. http://www.zoetecnocampo.com/foro/Forum35/HTML/000018.html
9. http://docs.google.com/gview?a=v&q=cache:lY6o3A2EPGcJ:www.saber.ula.ve/bitstream/1234
56789/27623/2/articulo10.pdf+produccion+hidrolizado+fermentacion+plumas&hl=es&gl=es&s
ig=AFQjCNHE46ESqEy-hhGsS5T4sYkHjI2FPw
10. http://www2.uah.es/mapa/seminarios/activos/Seminarios%20biologia/aa10.pdf
11. http://www.rpp.com.pe/2009-03-28-peru-exporto-mas-de-1329-tm-de-harina-de-plumas-el-
2008-noticia_172583.html