Relaciones filogenticas de

tres especies bacterianas a

partir de tcnicas
moleculares

Natalie Espinosa Montagut, estudiante

de Microbiologa e Ingeniera
Biomdica de la universidad de Los
Andes. Juan Miguel Prez Alvarez,
estudiante de Medicina de la uiversidad
de Los Andes, Esteban Masmela Gomez,
estudiante de Medicina de la uiversidad
de Los Andes. Marco Aurelio Chica
Mora, estudiante de Medicina de la
uiversidad de Los Andes

RESUMEN
Este artculo presenta las relaciones
filogenticas entre tres especies distintas
de bacterias y tres cepas de una misma
especie, para llegar a establecer estas
relaciones debimos realizar un proceso de
extraccin y purificacin de protenas a
partir de diferentes especies de bacterias
con el proceso de electroforesis mediante
la tcnica SDS-PAGE (Sodium dodecyl
sulfate-polyacrylamide
gel
electrophoresis),
lo
que
permiti
comparar el contenido proteico de las
muestras. Para realizar este proceso fue
necesario denaturar las protenas para
obtener la informacin sobre el peso

molecular, ya que esta influir en la

movilidad electrofortica de las protenas
a migrar.

PALABRAS CLAVE
Protenas,
cladograma,
SDS,
electroforesis, bacterias, aminocidos,
peso molecular, cepas, Coomassie.

INTRODUCCION
Las
protenas
son
estructuras
fundamentales para la vida, ya que
dirigen casi todos los procesos vitales en
el organismo y adems son las encargadas
de sintetizar y renovar los tejidos del
cuerpo. La suma de todas las protenas
expresadas por una clula especfica se
denomina proteoma, y la ciencia que se
encarga de identificar y clasificar las
protenas de acuerdo a su funcin se
llama protemica. Este artculo se enfoc
principalmente en el estudio de ciertas
protenas pertenecientes a diferentes
cepas bacterianas: E.coli C600, E.coli W,
E.coli
K12,
Proteus,
Yersinia
enterocoltica y Salmonella Typhi. Es
necesario separar las protenas para su
correcto estudio, para esto existen ciertos
mtodos que lo permiten, en este caso se
realiz una electroforesis SDS-PAGE, el
cual consiste en separar las protenas por
su peso molecular. Luego de realizar este
proceso y de obtener las secuencias de
los aminocidos, se pueden determinar las
caractersticas fenotpicas que comparten
las
diferentes
cepas
bacterianas.
Posteriormente, se procede a hacer un

cladograma que cumplir la funcin de

disear las relaciones fenotpicas que
existen en las bacterias.

MATERIALES Y MTODOS

MATERIALES
-

Tubos eppendorf
Hipoclorito diluido
Buffer
Plancha trmica
Gel
Solucin de persulfato de amonio
Beakers
Solucin de poliacrilamida
TEMED
Agua desionizada
Cmara de electroforesis
Botella de vidrio
Etanol
cido actico
Esptulas
Campana de extraccin
Metanol
Azul de coomassie
Protenas bacterianas
Extraccin de protenas bacterianas
La bacteria se crece ON (Over Night) en
caldo LB a una agitacin de 250 rpm.
Posteriormente se marc en eppendorf
con cada uno de los nombres de las cepas
a trabajar, se realiz la medicin de 1 ml
de medio de cultivo y se aadi al
eppendorf correspondiente. Se centrifugo

por 5 min a 13000rpm. Se descart 800ul

de sobrenadante en hipoclorito diluido. Se
us vortex para resuspender. Se agreg la
mitad del volumen de Buffer de muestra
(que deba estar en bao de mara), es
decir se tiene 200ul de muestra y
agregamos 100ul de Buffer de muestra.
Se coloc las muestras en la plancha
trmica a 100C y se le hicieron
perforaciones a las tapas de los tubos
eppendorf) por 5 minutos. Se centrifug
13000 rpm por 5 minutos. En el
sobrenadante quedaron las protenas (Se
observaban como un Moco)

Electroforesis
poliacrilamida

en

geles

de

Preparacin del gel de separacin

Para separar protenas de 60 a 200 kDa

usamos un gel del 5%, y luego para las
protenas de 16 a 70 kDa usamos uno de
10% y uno de 15% para separar protenas
de 12 a 45 kDa. Se prepar una solucin
de persulfato de amonio (fresca
diariamente) al 10 % (50 mg en 0.5ml
H2O o 25 mg en 0.25ml H2O). Medimos
1 cm por debajo de los peines en el
montaje.
En un beaker de 50ml se mezcl 2ml de
solucin de poliacrilamida 1,25 ml de
solucin pH 8.8 1,75 ml de H2O.
Adicionamos 50ul de Persulfato de
Amonio al 10% preparado en fresco y 8ul
de TEMED. Al haber alcanzado el nivel
mximo marcado, se cubri la solucin

rpidamente con agua desionizada. Una

vez polimerizado (+/- 30-45 minutos) se
removi el agua volteando todo el
montaje.
Preparacin del gel de stacking (o gel
de agrupamiento)
En un beaker de 50 ml se mezcl 325 l
de mezcla de poliacrilamida 625 l de
solucin pH 6.81 l de H2O, luego
adicionamos 25l de Persulfato de
amonio 10% y 5l de TEMED. Despus
de esto, se dej polimerizar y se realiz el
corrido de extractos de protena celular
bacteriana en electroforesis denaturante
SDS-PAGE Se realiz el montaje de la
cmara de electroforesis, llenamos la
cmara
interna
con
buffer
de
electroforesis 1X hasta que se cubrieron
los pozos y el resto en la cmara externa.
Se sembr 8l de cada una de las
muestras. Se cerro la cmara de
electroforesis y se conect a la fuente de
poder. Luego programamos el corrido de
electroforesis a 150V por 90 minutos.
Fijado
En una botella de vidrio con tapa y en
campana de extraccin se prepar 100 ml
de la solucin de fijado, agregando los
reactivos en el orden establecido:
50% de etanol (50 ml) 10% de cido
actico (10 ml) 40% de agua des ionizada
(dH2O; 40ml). Una vez terminada la
electroforesis, se verti la solucin de
fijado en las cubetas de tincin
suministradas. Se apag y se desconect
la cmara de electroforesis vertical de la

fuente de poder. Paso seguido, se retir el

montaje de los vidrios y a continuacin,
los vidrios, teniendo siempre presente el
pozo nmero uno de sembrado. Con la
ayuda de las esptulas verdes de plstico
previamente humedecidas con la solucin
de fijado, se separaron los dos vidrios,
procurando que el gel quedara en el vidrio
ms delgado. Se separ y se descart el
gel de stacking, e hicimos un pequeo
corte en la esquina superior del gel de
separacin en el lugar correspondiente del
primer carril de sembrado. Se deposit el
gel en la cubeta con la solucin de fijado,
lo cual guardamos en la cubeta en una
bolsa Ziplock a 4oC hasta por 15 das
para la tincin.
Tincin con Azul de Coomassie
Al igual que la tincin con plata, el
mtodo de Azul de Coomassie consto de
3 pasos bsicos: fijado, tincin y
destincin. En cada paso se utiliz
diferentes soluciones.
la tincin se realiz en una botella de
vidrio con tapa y en campana de
extraccin se prepar 100 ml de la
solucin de tincin, agregando los
reactivos en el orden establecido: 50% de
Metanol (v/v; 15ml)10% de cido actico
(v/v; 3 ml)40% de agua desionizada (v/v;
12ml) Coomassie 0.05% (w/v; 0.015g).
Posteriormente se agit aproximadamente
60 rpm a 37C por 45 min.

Destincin

Se prepar 100 ml de solucin de

destincin agregando los siguientes
reactivos:
50% de metanol (v/v; 50ml)10% de cido
actico (v/v; 10 ml) cido actico 40% de
dH2O (v/v; 40 ml), se descart la
solucin de tincin en un recipiente de
vidrio con tapa. Se hizo un enjuague con
Agua des ionizada. Se agreg 30 ml de la
solucin de destincin. Dejamos el gel en
agitacin constante de aprox. 50 rpm a
37oC por 10 minutos.

A partir de los resultados observados en la

Figura 1, subrayando las bandas que eran
distintas a otras se realiza una matriz
(Figura 2) que servir para el desarrollo
de los fenogramas con el fin de analizar la
similitud de la expresin proteica de las
bacterias.

RESULTADOS
En esta seccin se muestran los resultados
que se pudieron obtener en el laboratorio,
comenzando con el resultado de la
electroforesis de las protenas de las
bacterias y el teido con azul de
Coomassie.

Figura 1: Resultado de separacin de protenas

por electroforesis.

Figura 2: Resultado cuantitativo de la separacin

de protenas por electroforesis, presencia de
protena representado con 1 y ausencia con 0.

Los cladogramas (Fg. 3 y 4) fueron

construidos a partir de los resultados
usando programas como PAUP y
Windclad. Estos muestran la cercana la
expresin protemica de las bacterias.

Figura 3: cladograma mostrando relacin

bacteriana empleando algoritmo de neighbor
joining en PAUP y editado en FIGTREE.

Figura 5: Cladograma obtenido del artculo por

C.S. Hulton et al.(1991). ERIC sequences: a
novel family of repetitive elements in the genomes
of Escherichia coli, Salmonella typhimurium and
other enterobacteria. Molecular Microbiology.
pg. 825-834.

Figura 4: cladograma mostrando relacin

bacteriana empleando algoritmo de UPGMA en
PAUP y editado en FIGTREE.

DISCUSION
Los fenogramas son la agrupacin de
diversos organismos clasificados por sus
diferencias fenotpicas derivadas de un
ancestro en comn, debido que stas se
realizan con base a hiptesis por relacin
de caractersticas taxonmicas existen
diversos algoritmos que simulan la
relacin de cada especie y emplearemos
para obtener un resultado certero de las
protenas separadas en electroforesis. Para
hacer una comparacin, se busc las
relaciones evolutivas de los distintos
gneros que analizamos:

El algoritmo empleado en el fenograma

para la figura 3 llamado neighbor
joining tiene en cuenta los parmetros
de agrupamiento de especies por nodos,
sin embargo no tiene en cuenta que la
divergencia en evolucin de las distintas
especies se halla dado en cantidades
poblacionales iguales.
En el fenograma por algoritmo de NJ
(Figura 3), se puede apreciar las
similitudes para la familia de las E. Coli,
con mayor relacin de las derivaciones
K12 y W alejadas de C600 ya que sta
ltima no posee el plsmido F el cual
permite la recombinacin de secuencias
de DNA por medio de conjugaciones
bacterianas.
Por otra parte, el algoritmo del fenograma
para la figura 4 llamado Unweighted
Pair Group Method with Arithmetic
Mean (UPGMA) se basa nicamente en
las relaciones entre secuencias de DNA en
los organismos estudiados.
En el fenograma por algoritmo de
UPGMA (Figura 4), se puede apreciar
que la relacin en la familia de las E. coli

cambia respecto al algoritmo anterior,

ahora la derivacin K12 es alejada de la
relacin C600 y W ya que K12 posee el
genotipo lambda el cual hace que todas
las secuencias de DNA poseen extremos
(cos) de cadena sencilla complementarios
con el extremo adyacente con el fin de
replicar dicha secuencia en una clula
husped.
A primera instancia se puede determinar
la diferencia entre el fenograma de NJ y
UPGMA caracterizando las especies por
divergencias de nodos y semejanzas en
secuencias de DNA respectivamente.
Luego del resultado obtenido con la
separacin de protenas, y comparndolo
con el cladograma hecho por C.S. Hulton
et al., podemos establecer que el
fenograma ms a fin con los datos
obtenidos es el presentado por el
algoritmo NJ. El fenograma solo difiere
en la divergencia entre Salmonella typhi y
Yersinia enterocolitica, ya que las pone
como grupos hermanos. Se cree que esto
se debe a que estas bacterias son
principalmente patognicas para la flora
intestinal, entonces poseen una diferencia
mucho mayor en cuanto a funcin de las
otras
bacterias
mencionadas
anteriormente como resistir ante los
ataques de anticuerpos del sistema
inmunolgico del individuo husped.

Las E.coli estn ms estrechamente

relacionadas, con respecto al corrido de
protenas realizado, porque las tres no
tienen una protena presente en
Salmonella typhi, Yersinia enterocolitica
y Proteus spp, por lo que probablemente
su ancestro perdi ese carcter. Se
entiende del mismo SDS-PAGE, que
tanto
Salmonella
typhi,
Yersinia
enterocolitica y Proteus spp difieren
porque todas muestran una protena que
no concuerda con ninguna otra especie
analizada.
REFERENCIAS

L. (2016, Febrero 26). Prcticas 3 a 5,

Extraccin de Protenas, Visualizacin en
Gel de Poliacrilamida y Tincin. Prcticas 3
a 5, Extraccin de Protenas, Visualizacin
en Gel de Poliacrilamida y Tincin
Sandra Acero, ALGORITMO PARA ANLISIS
FILOGENTICO: UPGMA. Recuperado el 4 de
septiembre de 2015:
http://manglar.uninorte.edu.co/bitstream/handle/1
0584/2108/55305377.pdf?sequence
Lambda Phage DNA, Methylated from Escherichia
coli host strain W3110. Recuperado el 4 de
septiembre de 2015:
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sig
ma/d3779?lang=en&region=CO