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INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLGICAS

Laboratorio de Mtodos de Anlisis


DETERMINACIN DE RIBOFLAMINA POR
FLUOROMETRIA.

Alumno: Hernndez Toral Leonardo Jain


Grupo: 4IM1
Seccin 2
Profesor:
Luis Francisco Vzquez Flores
10 de diciembre del 2015

Introduccin.
La espectrometra de fluorescencia es una tcnica de espectroscopia atmica.
Esta se basa en las transiciones de electrones de los tomos que se producen
cuando una radiacin electromagntica de cierta energa incide con el material
en estudio, produciendo una excitacin del tomo, el cual pasa de un estado
basal (estable) a otro de mayor energa (inestable) de lo que resultan
transiciones en diferentes estados energticos en el tomo, los cuales son
nicos para cada tomo en particular. Esta caracterstica se utiliza para la
identificacin de los analitos o compuestos que queremos analizar, por lo que
es de gran utilidad en el anlisis cualitativo. La cuantificacin o anlisis
cuantitativo de diferentes elementos o compuestos se puede llevar acabo
utilizando mtodos espectroscpicos de absorcin y emisin. 1
Objetivo
Conocer por que surge cambio de la fluorescencia de la riboflavina a diferentes
valores de pH de acuerdo a distintos disolventes.

Resultados
Tabla 1. Resultados de la curva de calibracin de riboflavina en diferentes
medios.
Riboflavina
(ppm)

Intensidad de
fluorescencia
en H2O

Intensidad de
fluorescencia
en HCl 0.1M

Intensidad de
fluorescencia
en
CH3COOH
0.9 M

Intensidad de
fluorescencia
en NaOH 0.1 M

0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
10.0
50.0

4,92
5,81
6,67
7,48
7,90
8,87
11,82
17,85

4,91
5,09
5,17
5,28
5,38
5,47
5,87
6,69

4,92
5,62
6,30
6,89
7,48
8,03
10,23
14,62

4,93
4,93
4,94
4,95
4,96
4,97
4,99
5,03

pH

13

Figura 1. RFU vs Concentracion.


Intensidad de fluorescencia en H2O

20
15
RFU

Intensidad de fluorescencia en HCl 0.1M

10
Intensidad de fluorescencia en CH3COOH 0.9 M

5
0
0

10
30en NaOH 0.1
40 M
Intensidad
de20
fluorescencia

50

60

Concentracion(PPM)

de fluores cencia
fig.Intens
2 idad
Curvas
deen H2O
calibracion

10

Linear (Intens idad de fluores cencia en H2O)

9
f(x) = 0.77x + 4.26
R
f(x)==0.99
0.62x + 4.37

Linear (Intens idad de fluores cencia en H2O)

R = 1

Intens idad de fluores cencia en HCl 0.1M

6
RFU

f(x)(Intens
= 0.11x
Linear
idad+de4.84
fluores cencia en HCl 0.1M)

f(x)==0.99
0.01x + 4.92
R
R = 0.96

Intens idad de fluores cencia en CH3COOH 0.9 M

3
2

Linear (Intens idad de fluores cencia en CH3COOH 0.9 M )

1
Intens idad de fluores cencia en NaOH 0.1 M

0
0

Linear (Intens idad de fluores cencia en NaOH 0.1 M)

Concentracion

Tabla 2. Datos de regresin lineal.


Disolvente

Agua

0.76

4.2587

0.995

cido actico

0.6206

4.368

0.998

HCl

0.108

4.8387

0.992

NaOH

0.0086

4.9167

0.981

Discusin.
Como se observa en la figura 1 las pendientes de las
rectas a bajas concentraciones tienden a ser ms altas
que en concentraciones mayores con lo cual podemos
afirmar que existe
una mayor sensibilidad a
concentraciones bajas. Esto se debe gracias al
autoapagamiento de las molculas en el cual hay ms
choques entre ellas y con ello una mayor transferencia
de la energa de radiacin y de acuerdo a lo reportado en la el
autoapagamiento aumenta con la concentracin.2
Una vez mencionado lo anterior se tiene que en la misma figura tenemos un
comportamiento de H2O, CH3COOH, HCl, NaOH l cual fue el esperado
La mayora de los compuestos que contienen anillos aromticos proporcionan
emisin fluorescente. Ciertos compuestos carbonlicos alifticos y alicclicos y
estructuras de dobles enlaces tambin lo hacen. Sin embargo, su nmero es
pequeo en comparacin con el nmero de compuestos fluorescentes que
contienen anillos aromticos. La mayora de los hidrocarburos aromticos no
sustituidos fluorescen con una emisin fluorescente creciente con el nmero de
anillos y con su grado de condensacin. Los anillos heterocclicos ms
sencillos (piridina, furano, pirrol,...) no fluorescen pero las estructuras de anillos
fusionados con ms de dos anillos (quinolina, isoquinolina, indol) lo hacen con
frecuencia.3
De acuerdo a lo anterior a un pH acido la riboflavina se encontrar en su forma
aninica, y con ello se tiene un cambio en el nmero de estructuras resonantes
lo que disminuye la estabilidad de su estado exitado. 4
En el caso contrario a pH alcalino un factor que ocasiona que la fluorescencia
se apague, es que ah la riboflavina hidroliza al compuesto lo que hace que se
pierda la estructura de su grupo funcional y con ello no tenga fluorescencia.
Por supuesto, la relacin de mrito entre el mtodo de fluorescencia y el de
absorcin depender de varios factores, entre ellos: la eficiencia cuntica de
fluorescencia del analito en cuestin, su absortividad molar, la precisin (en
miliabsorbancias) del espectrofotmetro disponible, la sensibilidad del
fluormetro.5
Cuestionario.
1 Por qu se deben conocer las longitudes de onda de mxima
excitacin y de mxima emisin?

Se debe determinar a que longitudes de onda se va a trabajar por eso se


asegura que se tenga la mxima sensibilidad tomando en cuenta las
longitudes de onda de excitacin y emisin.
2 Diga cules son las formas coenzimticas de la riboflavina y cul es su
papel en el metabolismo celular.
La vitamina B2 o riboflavina al fosforilarse se convierte en su forma
activa o coenzimtica: dinucletido de flavina y adenina (FAD), coenzima
que transfiere tomos de hidrgeno; interviene en las oxidorreducciones,
para la produccin de energa. 6
3 Qu es la fosforescencia?
La fosforescencia es un fenmeno similar al de fluorescencia, en el cual
ciertos electrones son excitados por la luz, pasando a una rbita de
mayor energa, y cuando vuelven a su estado de reposo, liberan parte
de esta energa en forma de luz. La diferencia entre ambos fenmenos
es que en la fosforescencia la liberacin de energa por medio de
fotones sucede con retraso, aun cuando la fuente estimulante ya no est
presente, al contrario de la fluorescencia, en el cual la liberacin de
fotones es casi inmediata a su absorcin.7

Conclusiones
De acuerdo al pH del medio se tendrn distintas intensidades de fluorescencia.
A bajas concentraciones se tiene una mayor sensibilidad del mtodo.
La fluorescencia est en funcin de las estructuras de anillos fusionados de las
molculas.
Bibliografa:
1) http://www.uach.mx/extension_y_difusion/synthesis/2009/08/20/espectro
metria_de_flourescencia_de_rayos_X.pdf
2, 5) http://www.qi.fcen.uba.ar/materias/ai/laboratorio/Fluorometria_2011.pdf
3,4)http://repositorio.innovacionumh.es/Proyectos/P_22CursoMateriales/Mig
uel_Angel_Sogorb/Wimba/Espectroscopia_06.htm
6) http://www.lincargentina.org/tratamiento-coenzim%C3%A1tico/
7) http://quimica.laguia2000.com/conceptos-basicos/fosforescencia