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Electroforesis protica

Qu es?
Es un mtodo de laboratorio en el que se
utiliza una corriente elctrica controlada
con la finalidad de separar las protenas y
otras biomolculas segn su tamao y
carga elctrica a travs de una matriz
gelatinosa.

Fue empleado por primera vez en 1937 por Arne


Tiselius, un bioqumico sueco que lo utiliz para estudiar
el plasma sanguneo.

Fundamento de la tcnica
Cuando una mezcla de molculas ionizadas y con carga neta son colocadas en un campo elctrico,
experimentan una fuerza de atraccin hacia el polo que posee carga opuesta.
El movimiento se ve afectado por:
- La friccin con el solvente.
- La energa cintica de difusin.
Mayor temperatura = mayor movimiento = menor homogeneidad
Para reducir el movimiento aleatorio de las protenas se usa un gel:
Un polmero soluble de alto peso molecular que atrapa molculas de agua y forma un tamiz que
dificulta el movimiento.
Consecuentemente, la migracin ser ms lenta, pero el desorden se ver reducido tambin.

Fundamento de la tcnica
La carga de las protenas, por su naturaleza anfotrica, depende del pH del medio:
- Cuando en un campo elctrico el pH del medio es igual al punto isoelctrico (PI)
de la protena, no hay migracin.
- Para pH por debajo del PI, predominan las cargas positivas y las protenas migran
hacia el ctodo (polo negativo).
- Para pH superiores al PI, las protenas estn cargadas negativamente y migran hacia
nodo (polo positivo).

el

Procedimientos: electroforesis de zona


Es el ms comn en separacin de muestras
complejas.
Se aplica una pequea muestra a una zona
estrecha pero de largo recorrido, con lo que hay
mayor resolucin.
La separacin se hace a pH alcalino, en el que
la mayora de las protenas presentan una
carga global negativa.
Tambin se puede trabajar a pH cido, pero no
demasiado bajo, ya que las protenas se
precipitan en medio cido.

Procedimientos: electroforesis de zona


Como medio de soporte se puede usar:
Papel, acetato de celulosa, agarosa,
poliacrilamida y electroforesis capilar.
La muestra se inserta en el medio de soporte y
se aplica una diferencia de potencial durante
un tiempo determinado para separar las
protenas.
Cada protena migrar ms o menos en
funcin de su carga y su tamao.
Mayor carga y menor tamao = Mayor
velocidad de migracin.

Procedimientos: por tamao


Se utiliza un compuesto llamado SDS (Sodio dodecil sulfato) para obtener un cambio en
la carga de las protenas, volvindola negativa para que puedan adherirse al nodo (polo
positivo).

Se hace en medios de soporte en el que se ha creado un tamiz molecular (matriz) que


hace que las protenas ms pequeas corran ms rpido que las ms grandes.

Procedimientos: bidimensional
Es una sucesin de 2 electroforesis distintas, o de un
mismo proceso bajo diferentes condiciones sobre una
misma muestra.
Primera dimensin:
Se separan los componentes de la muestra segn
tamao, carga o punto isoelctrico. Generalmente se
usa el isoelectroenfoque.
Segunda dimensin:
La misma muestra se somete a una prueba diferente o
con parmetro distinto del anterior. Puede ser por SDSPAGE.
La aparicin de una sola mancha indica una muestra
homognea.

Procedimientos: Isolectroenfoque
Se emplea parar separar molculas cargadas.
Debido a que una protena tiene grupos cargados de ambas polaridades, tiene un
punto isoelctrico (PI), donde su carga neta es cero.
- Se establece un gradiente de pH en el gel de poliacrilamida por adicin de
anfolitos.
- Las protenas se distribuyen a lo largo del gel de acuerdo con sus valores de PI.

Procedimientos: Isolectroenfoque
VENTAJAS:
- Un anfolito siempre se detiene en la
zona en la que el pH coincide con su
punto isoelctrico.
- Los resultados no estn sujetos a
variaciones debidas a las condiciones
experimentales.
- La muestra se puede colocar en
cualquier zona del medio de soporte.

Visualizacin
Se tien si no son estudios especficos.
De caso contrario primero deben fijarse
con anticuerpos y luego teirse
(inmunofijacin).
Para muestras procesadas con
poliacrilamida (depende del objetivo de
estudio):
Tincin con plata.
Tincin con Azul de Coomassie.
Tincin Blue Silver o
Coomassie G250.
Tincin fluorescente.

Desventajas
La electroforesis es una tcnica muy sensible por
su gran resolucin, pero fcilmente se ve afectada
por:

Temperatura durante la polimerizacin.


Velocidad de la polimerizacin.
Consistencia del gel.
Nivel del catalizador.
Pureza del reactivo.
Tiempo de corrida.
Preparacin de la muestra.

Aplicaciones
- Estructura y funcin de las protenas:
Con muestras de sangre y orina se
comparan los parmetros establecidos y se
detectan enfermedades.

Anlisis de ADN: Las secuencias especficas de


ADN pueden ser analizadas, aisladas y clonadas.
El ADN analizado se puede utilizar en
investigaciones forenses y pruebas de
paternidad.

Aplicaciones
Anlisis de antibiticos: No slo es posible
sintetizar nuevos antibiticos, sino que tambin
se puede analizar qu tipos de bacterias son
resistentes a los antibiticos.

Anlisis de vacunas: Hay varias vacunas que


han sido purificadas, procesadas y analizadas a
travs
de
la
electroforesis,
como
la vacuna contra la influenza, la hepatitis y contra
la polio.