ENZIMOLOGA VEGETAL

Enzimologa vegetal. Problemas propios del manejo de las enzimas vegetales. Cintica
enzimtica utilizando los principios del cuasi-equilibrio o equilibrio rpido. Regulacin del
metabolismo en la clula vegetal.
Las enzimas son sustancias que poseen una extraordinaria capacidad cataltica (1), tienen
un alto grado de especificidad por sus sustratos (2), aceleran reacciones qumicas
especficas (3) y funcionan en soluciones acuosas bajo condiciones suaves de temperatura y
pH (4). Las enzimas, actuando en secuencias organizadas, catalizan los cientos de
reacciones que ocurren en una va metablica mediante la cual un nutriente es degradado o
biosintetizado asegurando la supervivencia y proliferacin celular. Algunas de las enzimas
son reguladoras, esto es, que pueden responder a varias seales metablicas cambiando de
acuerdo a stas su actividad cataltica. A travs de la accin de las enzimas reguladoras, los
sistemas enzimticos estn altamente coordinados para formar un conjunto armnico entre
las diferentes actividades metablicas y de esta manera sostener la vida.
PRINCIPALES CARACTERSTICAS DE LAS ENZIMAS
Las enzimas, son protenas con excepcin de un pequeo grupo de molculas de ARN que
tambin poseen actividad cataltica (ribosimas). En el caso de tratarse de protenas su
actividad cataltica depende de la integridad de la conformacin nativa, es decir, de las
estructuras primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria (Esquema 1).

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Estructura primaria

Estructura secundaria (tipo hlice)

Estructura secundaria (hoja )

Estructura terciaria

Estructura cuaternaria

Esquema 1: Estructura de las proteinas

La estructura tridimensional de una protena prov una discriminacin precisa en el

reconocimiento de los ligandos -la molcula que interacta con la protena-. Una molcula
de protena est compuesta de varios dominios de masas moleculares de alrededor de 104
daltons. El sitio activo de una enzima- que es la regin donde el sustrato se liga y la
reaccin cataltica ocurre- est localizado en la interfase entre dos dominios.
Si la enzima es desnaturalizada o disociada en sus subunidades, en general, la actividad
cataltica se pierde. Por otra parte, las enzimas, al igual que otras protenas, tienen un peso
molecular que oscila desde aproximadamente 12.000 hasta ms de 1.000.000. Algunas
requieren cofactores que pueden ser uno o ms iones metlicos como por ejemplo Fe2+,
Mg2+, Mn2+,Zn2+ o bien una molcula orgnica o metaloorgnica llamada coenzima. A
veces ambos, es decir, una coenzima y uno o ms iones metlicos para su actividad. Una
molcula de enzima catalticamente activa con su coenzima y/o iones metlicos se llama
holoenzima. La protena de esa enzima se llama apoenzima o apoprotena. La coenzima
funciona como un transportador transitorio de grupos funcionales especficos.

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Tabla 1: Elementos inorgnicos (cofactores) necesarios para la actividad enzimtica.

Iones

Enzimas

Fe2+ o Fe3+

Citocromo oxidasa
Catalasa
Peroxidasa

Cu2+

Citocromo oxidasa

K+

Piruvato quinasa

Mg2+

Hexoquinasa
Glucosa-6-fosfatasa
Piruvato quinasa

Tabla 2: Transportadores transitorios de grupos de tomos o grupos funcionales

(coenzimas).
Coenzima
Pirofosfato de tiamina

Grupo Transferido
Aldehdo

Coenzima A

Grupo acilo

Piridoxal fosfato

Grupo amino

Flavina adenina dinucletido

Electrones

Nicotinamida adenina dinucletido

In hidruro (:H-)

CLASIFICACIN DE LAS ENZIMAS

Con el objeto de sistematizar el estudio de las enzimas, las mismas fueron clasificadas por
el tipo de reaccin que catalizan en 6 grupos. Cada uno de esos grupos tiene subclases
basadas en el tipo de reaccin que catalizan. A cada enzima se le ha dado un nmero de
clasificacin de cuatro dgitos y un nombre sistemtico que identifica la reaccin catalizada
y un nombre trivial. Se las denomina con el sufijo asa aadido al nombre de su sustrato o
con una palabra o frase que describe su actividad.

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Nomenclatura:

Nmero clasificatorio de 4 dgitos (E.C.)

Nombre sistemtico

Nombre trivial

ATP + D-Glucosa

ADP + D-Glucosa-fosfato

Nmero clasificatorio: E.C. 2.7.1.1.

2. Clase: Transferasa
7. Subclase: Fosfotransferasa
1. Fosfotransferasas con OH como aceptor
1. D-glucosa como aceptor del fosfato
Nombre sistemtico: ATP:glucosa fosfotransferasa
Nombre trivial: hexoquinasa
Por acuerdo internacional se las ha clasificado en 6 clases principales.
Nro
Clase
Grupo.

Tipo de reaccin catalizada

Oxidorreductasas

Transferencia de electrones

Transferasas

Reac. de transferencia de grupos

Hidrolasas

Reac. de hidrlisis
funcionales al agua)

Liasas

Adicin de grupos a enlaces dobles o formacin de

enlaces dobles por eliminacin de grupos.

Isomerasas

Transferencia de grupos dentro de una molcula para

dar formas isomricas.

Ligasas

Formacin de uniones C-C, C-S, C-O y C-N por

reacciones de condensacin acopladas a la ruptura de
ATP

(transferencia

de

grupos

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PRINCIPALES PROBLEMAS EN EL MANEJO

(EXTRACCIN Y PURIFICACIN DE ENZIMAS)

DE

LAS

ENZIMAS

El primer paso en la obtencin de una enzima es la degradacin del rgano, tejido o clulas
que la contienen. Para ello el rgano o tejido vegetal es desintegrado en licuadora, molido,
o exprimido en juguera. Estos procesos deben ser efectuados siempre en frio
(corrientemente entre 0-4C), pero pueden hacerse a temperaturas inferiores como en el
caso del molido del material vegetal verde que suele llevarse a cabo en morteros enfriados a
-20 C o en presencia de N2 lquido. Cuando se homogeneiza un tejido fresco es necesario
utilizar una cierta cantidad de lquido. Este lquido o medio de homogeneizacin debe tener
una composicin adecuada para proteger la enzima que queremos extraer de posibles
desnaturalizaciones.
As, si una enzima es sensible a los metales pesados podemos agregar un quelante (por ej.
EDTA) al medio de homogeneizacin, evitando prdidas de actividad por ste tipo de
factor. Igualmente si la enzima es sensible a la oxidacin, el medio de homogeneizacin
puede llevar agentes reductores tales como la cistena, mercaptoetanol u otros compuestos
antioxidantes. Por lo general los tejidos vegetales tienen elevados niveles de enzimas
proteolticas y de compuestos fenlicos, por ello en el medio de extraccin se agregan
inhibidores de proteasas o sustancias que precipitan los polifenoles como la
polivinilpolipirrolinona (PVPP). Adems se buscar un buffer cuya composicin, pH y
concentracin (fuerza inica) mantenga lo mejor posible los niveles de la actividad
enzimtica en estudio. Por otra parte, debern controlarse otros factores tales como la
temperatura, ya que las protenas son, generalmente, termolbiles y sin este control
podramos inactivar la enzima a extraer, o bien obtener rendimientos muy bajos que no
reflejen los niveles de la actividad in vivo. En vegetales, generalmente se trabaja entre 04C y a pH 7-7,5, ya que a este pH se consiguen mejores extracciones de protenas. Una
vez extrada la enzima debemos contar con una forma de cuantificarla. Como, en general, la
nica propiedad caracterstica que le conocemos es su actividad sobre un cierto sustrato al
que convierte en uno o ms productos, utilizamos esta caracterstica para detectar y medir
la enzima. Es, sin embargo necesario, que antes de proceder a medir la enzima se eliminen
molculas pequeas que pudieran estar presentes en el preparado. Ello puede realizarse por
varios mtodos, pero uno de los ms utilizados es la dilisis o ultrafiltracin a travs de
membranas de diferente tamao de poro.
De acuerdo a lo expresado la enzima va a ser detectada a travs de la reaccin que cataliza,
por espectrofotometra o por otro mtodo que resultare conveniente, la desaparicin de
sustrato o la aparicin de productos.
PURIFICACIN ENZIMATICA
El homogenato obtenido contiene todos los metabolitos solubles de la clula as como una
gran cantidad de enzimas diferentes. Esta mezcla impide estudiar algunas caractersticas de
las enzimas y, adems, puede modificar el comportamiento de muchas de ellas. Por esto es
que en la mayora de los casos se procura purificar las enzimas, esto es, separarlas de la

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compleja mezcla de protenas, lpidos, azcares y otras sustancias que se encuentran en el

homogenato.
Existen numerosas tcnicas basadas en las propiedades de las distintas protenas que
pueden aplicarse para la purificacin de enzimas. Entre las tcnicas aplicadas
mencionaremos:
1- Los mtodos basados en la solubilidad de las protenas, a saber: precipitacin con
sales, precipitacin con solventes, etc.
2- Mtodos basado en fenmenos de adsorcin: los adsorbentes empleados pueden ser,
entre otros: gel de fosfato de calcio, almina, hidroxiloapatita, etc. Estos mtodos
pueden aplicarse directamente sobre la solucin de la enzima o bien aplicando la
solucin de enzima a estos materiales colocados en columnas. En este ltimo caso
los adsorbentes son preparados de modo que sean retenidos por las columnas:
cromatografa de adsorcin.
3- Mtodos basados en las cargas de las protenas: cromatografa de intercambio
inico, electroforesis de poliacrilamida con y sin dodecilsulfato de sodio.
4- Mtodos basados en el tamao de las protenas: diversos tipos de filtracin por gel
(mtodos de exclusin molecular) o electroforesis preparativa.
5- Mtodos basados en la especificidad de las enzimas: cromatografa de afinidad.
6- Mtodos basados en el puntos isoelctrico: isoelectroenfoque, cromatoenfoque.
7- Mtodos mixtos: cromatografa de intercambio inico (catinico o aninico),
electroforesis en geles de poliacrilamida u otro soporte, etc.
Cuando se intenta purificar una enzima por primera vez no hay regla sobre el mtodo a
utilizar ni sobre la secuencia de mtodos necesarios para lograr la purificacin. Hay que
decidir qu mtodos se aplicarn de acuerdo con las posibilidades del laboratorio. Se
ensaya el mtodo elegido y se lo incorpora al protocolo de purificacin en elaboracin o se
lo desecha segn los resultados que se obtengan. Es casi imposible que un nico mtodo
sea suficiente para logar una purificacin elevada de una protena. La nica regla general
aplicable a las purificaciones es la utilizacin de mtodos suaves que no alteren las
estructuras de las enzimas y protocolos de purificacin cortos (Tabla 3).

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Tabla 3: Principales tipos de cromatografa

Fase mvil
Lquida

Fase
estacionaria
Lquida

Clase

Slida

Adsorcin

Reparto

Tipo
(propiedad)
Tamao

Nombre

Ejemplo

Exclusin

Interacciones
electrosttica

Intercambio
inico

Filtracin por
gel
Intercambio
aninico
Intercambio
catinico
Interaccin
hidrofbica
Afinidad

Hidrofobicidad Interaccin
hidrofbica
Interacciones
Afinidad
por
afinidad
biolgica
Interacciones
Adsorcin
inespecficas

Hidroxilapatita

Cromatografa de filtracin en gel

La cromatografa de filtracin en gel se realiza empleando unas matrices formadas
por unas esferas porosas. El volumen de los poros es muy elevado y su dimetro est
determinado. Cuando penetran en el lecho de la columna dos protenas de tamaos tales
que una penetra en los poros de las esferas de gel y la otra no, la primera se reparte entre el
espacio entre las esferas y el interior de los poros, reducindose la concentracin en la fase
libre entre las esferas. La segunda protena, por su tamao, slo puede encontrarse entre las
esferas. El flujo de solvente es ms elevado entre las esferas que en el interior de los poros

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de stas, por lo que el efecto neto es el de acelerar el desplazamiento de las protenas de

mayor peso molecular respecto a las de menor peso molecular. En esta cromatografa se
eluyen primero las protenas mayores, y en segundo lugar las menores, y tiene una gran
influencia en el resultado la longitud de la columna y el volumen de la misma. Columnas
largas aseguran separaciones de mayor calidad. La filtracin por gel se emplea para
determinar el peso molecular de protenas desconocidas mediante el uso de patrones de
peso molecular de protenas conocidas.
Cromatografa de intercambio inico
La cromatografa de intercambio inico se realiza sobre matrices que tienen una carga neta,
positiva o negativa. La carga de la matriz de la columna as como la carga de las protenas
depender del pH del solvente y de su fuerza inica (proporcional a la concentracin de
iones). En unas condiciones determinadas sern retenidas en la columna las protenas que
tengan una carga complementaria a la de la matriz del gel (las protenas cargadas
negativamente sern retenidas por una matriz cargada positivamente), siendo eluidas las
restantes. Para eluir las protenas retenidas se pueden variar la carga inica del solvente o su
pH de forma que se alcance el punto isoelctrico de la protena de inters o el de la matriz,
neutralizando de este modo la fuerza que retiene a las protenas en la columna
Cromatografa de afinidad y de inmunoafinidad
En la cromatografa de afinidad las esferas de gel que conforman el lecho de la
columna presentan unido en su superficie un ligando, una molcula ante la que tiene
afinidad una o ms de las protenas presentes en la mezcla a separar. Al atravesar la
columna el ligando secuestra sobre la superficie de las esferas de gel la protena afn, y deja
pasar el resto. La elucin de la protena afn se puede conseguir modificando las
propiedades de carga del ligando (variando el pH hasta alcanzar su punto isolctrico,
variando la fuerza inica del solvente, etc.) con lo que se reduce la intensidad de la
interaccin hasta anularla.
La naturaleza del ligando es muy variada, puede ser un receptor (protena) unido a
las esferas, que seleccionar su/s ligando/s de una mezcla compleja, o un antgeno (usado
en una inmunizacin) que recubre las esferas y que retendr aquellos anticuerpos que lo
reconocen (anticuerpos purificados por afinidad), o en el caso concreto de la
inmunoafinidad el ligando que recubre las esferas son anticuerpos que retienen en la
columna a aquellas protenas que contienen los epitopes que reconocen.
En ocasiones la cromatografa de afinidad se realiza incubando el gel recubierto con
el ligando directamente con la solucin que contiene las protenas a purificar.
Posteriormente se empaqueta la columna y se procede a la elucin, primero de las protenas
no unidas y posteriormente de las retenidas (eluido especfico).
Expresin de los resultados de la purificacin:

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Luego de cada paso de purificacin de una enzima es necesario expresar los resultados de
esa purificacin en forma tabulada. La tabla debera contener los siguientes datos
agrupados en columnas:
Procedimiento

Vol.

Actividad

Unidades

Protena

Actividad

Rendimiento

(ml)

(Unid./ml)

Totales

(mg/ml)

Especfica

Grado
de
Purificacin

Unidades de enzima:
Se define una unidad internacional de enzima (UI) como la cantidad de la enzima que
cataliza la transformacin de 1 mol de sustrato por minuto bajo condiciones definidas de
medida (temperatura, pH, concentracin de sustrato o sustratos y cofactores).
Si se logra obtener una enzima pura y se conoce su peso molecular se puede definir la
actividad molecular o molar, o nmero de recambio como el nmero de molculas de
sustrato transformados por minuto y por molcula de enzima en condiciones en que se mida
la velocidad mxima de la enzima.
Actualmente la Unin Internacional de Bioqumica recomienda el uso del Katal (Kat) que
se define como la cantidad de enzima que transforma 1 mol de sustrato en producto en 1
segundo. As:
1 Katal= 6 x 107 UI
Actividad especfica:
La actividad especfica est dada por el cociente entre el nmero de unidades de enzima y
los mg de protena del preparado. Esta unidad es muy usada en los estudios de purificacin
enzimtica.
Aplicaciones del concepto de actividad especfica:
1- Permite calcular la purificacin de una enzima.
2- Sirve para diferenciar dos enzimas o actividades contenidas en un mismo extracto.
PRINCIPIOS GENERALES DE LA ACCIN CATALTICA DE UNA ENZIMA
Las enzimas proveen un entorno especfico llamado sitio activo en que est
energticamente favorecida una determinada reaccin. Es as como las enzimas pueden ser
modificadas dentro de ciertos lmites sin que pierdan su actividad biolgica. En algunos
casos se logr eliminar uno o ms aminocidos sin prdida de actividad. Tambin se han
efectuado digestiones enzimticas parciales de algunas enzimas con los mismos resultados.
Esto nos indica que no toda la protena enzimtica participa en la catlisis sino que slo

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parte de ella es la que intervienen en la unin (sitio de ligamiento del o de los sustratos) y
transformacin de los sustratos (grupos catalticos).
Una reaccin enzimtica simple puede escribirse:
E+S

ES

EP

E+P

donde: E: enzima libre

S: sustrato libre
ES: complejo enzima-sustrato
EP: complejo enzima-producto
P: producto
La funcin del catalizador biolgico (E) es aumentar la velocidad de la reaccin sin
afectar el equilibrio de la reaccin. Para visualizar ambos conceptos estudiemos la
representacin de la reaccin anterior en un diagrama en que la variacin de la energa libre
(G) de la reaccin se representa en funcin de la coordenada de reaccin, es decir, del
curso de la reaccin (Figura 1). En el equilibrio la energa libre del estado fundamental de P
es menor que de S, por tanto la reaccin est favorecida (G < 0). Como se puede apreciar
el equilibrio entre S y P no es afectado por el camino que haya seguido S para convertirse
en P, es decir, por cualquier intermediario que haya podido formar S con el catalizador.

Figura 1: Variacin de la energa libre (G) de la reaccin en funcin de la coordenada de

reaccin, es decir, del curso de la reaccin

Existe una barrera energtica entre S y P que representa la energa necesaria para el
alineamiento correcto de los grupos reaccionantes, la formacin de intermediarios
transitorios, reordenamiento de enlaces y otras transformaciones necesarias para que la
reaccin se produzca en uno otro sentido. Esto significa que la o las sustancia/s
reaccionantes adquieren una cierta energa (energa de activacin) y pasan del estado

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fundamental a un estado de transicin. Una vez en este nivel energtico (estado activado) la
probabilidad de que el compuesto vuelva a S o se transforme en P es la misma.
La velocidad de la reaccin es un reflejo de esta energa de activacin pues cuanto mayor es
la barrera tanto menor ser la velocidad de la reaccin. Por tanto la funcin de los
catalizadores biolgicos es disminuir esta barrera y de este modo aumentar la velocidad de
la reaccin. Merece destacarse que si bien los catalizadores no afectan el equilibrio de la
reaccin hacen que este equilibrio se alcance ms rpido aumentando la velocidad de la
reaccin.
En presencia de un catalizador la transformacin de S en P, puede describirse mediante la
formacin de varios intermediarios de transicin. El paso que incluye la formacin de uno
de tales intermediarios con mayor energa de activacin ser el limitante de la velocidad de
la reaccin.
La relacin entre la variacin de energa libre (Go) y la Keq de dicha reaccin es:
Go= - RT ln K eq
lo que indica que la Keq est relacionada directamente con el Go de la reaccin. Por otra
parte, para la transformacin de S
P la v = k [S] donde:
v= velocidad de la reaccin
K= constante de la reaccin

FACTORES QUE INFLUYEN EN LA VELOCIDAD DE LAS REACCIONES

ENZIMATICAS.
El estudio de los factores que tienen influencia sobre la actividad de las enzimas permite
una mejor comprensin de los mecanismos involucrados en el proceso cataltico.
La mejor metodologa a emplear para el anlisis del progreso de una reaccin enzimtica es
el estudio del efecto de la variacin de uno de los factores que tienen influencia sobre la
misma mientras los dems se mantienen invariables. En la figura 2 se puede observar la
variacin de la concentracin de cada uno de los componentes de la reaccin descripta ms
arriba en el transcurso del tiempo.

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Figura 2: Variacin de la concentracin de cada uno de los componentes de la reaccin en el

tiempo de reaccin

A excepcin de la fase inicial de la reaccin, las pendientes de las curvas de progresin

para [E] y [ES] son esencialmente cero siempre que la [S] sea mucho mayor que la [E]
hasta que el S est prcticamente agotado. En consecuencia la velocidad de sntesis de ES
debe ser igual a la velocidad de descomposicin de ES. En otras palabras ES se mantiene
en un estado estacionario y la [ES] puede tratarse como si se mantuviera constante.
Para evitar posibles perturbaciones en las determinaciones de las velocidades de las
reacciones es aconsejable hacer las mediciones en los primeros instantes de la reaccin, es
decir, determinar velocidades iniciales en las que hay proporcionalidad directa entre la
cantidad de enzima utilizada, el tiempo y la cantidad de sustrato transformado y en la que
hay exceso de sustrato. Operando en esta zona y en presencia de gran exceso de sustrato la
reaccin enzimtica puede considerarse como una reaccin de orden 0, es decir, que la
cantidad de producto formado por unidad de tiempo (velocidad de la reaccin) es
independiente del tiempo. Estas son, tambin, las condiciones que deben emplearse para la
medicin de unidades de enzima.
Los principales factores que afectan la velocidad inicial de una determinada reaccin
son:
Temperatura, pH, concentracin de enzima, concentracin de sustrato y la presencia de
activadores o inhibidores

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Efecto de la temperatura:
Las reacciones enzimticas suelen comportarse como reacciones qumicas ordinarias ya que
su velocidad aumenta como consecuencia de un aumento de la temperatura. Sin embargo
con las enzimas se alcanza un punto en que todo nuevo aumento de la temperatura provoca
una disminucin de la velocidad de la reaccin (Figura 3). Esto se debe a que a
temperaturas relativamente altas las enzimas se desnaturalizan.

Figura 3: Efecto de la Temperatura sobre la velocidad de la reaccin catalizada por enzimas.

Segn la Figura 3 parecera existir una temperatura en que la actividad enzimtica es

ptima. Sin embargo este ptimo no es constante ya que depende de una serie de factores
tales como la presencia de activadores, inhibidores, agentes desnaturalizantes, proteasas,
etc. presentes en el preparado.
En condiciones definidas (pH, fuerza inica, concentracin de sustrato) la velocidad de una
reaccin enzimtica vara con la temperatura debido a que la constante especfica de la
velocidad es funcin de la temperatura. Arrhenius expresa una relacin entre el logaritmo
de la constante K de velocidad y la temperatura absoluta T:
Log k= log C- Ea/2,3 R x 1/T
En donde: R=constante de los gases
Ea= energa de activacin
C= constante
De donde se puede calcular Ea de la pendiente de la curva (Figura 4).

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La mayor parte de las reacciones enzimticas siguen la ecuacin de Arrhenius en la zona

fisiolgica de temperaturas. La ecuacin tiene la misma forma que la ecuacin de Vant
Hoff con la diferencia de que en este caso se utilizan constantes de velocidad en lugar de
constantes de equilibrio. Es asi como a una concentracin constante de reaccionantes las
constantes de velocidad se pueden sustituir por velocidades ya que la velocidad es
proporcional a K. En la Figura 4 podemos estimar la Ea de la pendiente de la recta

Figura 4: A) Actividad enzimtica a diferentes temperaturas de incubacin. B) Grfico de

velocidad en funcin de la inversa de la temperatura de reaccin enzimtica.

Efecto del pH sobre la actividad enzimtica:

Los enzimas poseen grupos qumicos ionizables (carboxilos -COOH; amino -NH2; tiol -SH;
imidazol, etc.) en las cadenas laterales de sus aminocidos. Segn el pH del medio, estos
grupos pueden tener carga elctrica positiva, negativa o neutra. Como la conformacin de
las protenas depende, en parte, de sus cargas elctricas, habr un pH en el cual la
conformacin ser la ms adecuada para la actividad cataltica. Este es el llamado pH
ptimo. La mayora de los enzimas son muy sensibles a los cambios de pH. Desviaciones
de pocas dcimas por encima o por debajo del pH ptimo pueden afectar drsticamente su
actividad. As, la pepsina gstrica tiene un pH ptimo de 2, la glucosa 6-fosfatasa lo tiene a
pH 7,5 y la arginasa lo tiene a pH 10, Figura 5.

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Figura 5: Efecto del pH sobre la velocidad de una reaccin enzimtica.

Para eliminar efectos destructivos del pH sobre la enzima es necesario hacer una curva de
tiempo a cada pH, a fin de medir la velocidad inicial correspondiente. El efecto del pH
sobre las afinidades se elimina utilizando, concentraciones suficientemente altas de sustrato
como para mantener siempre saturada la enzima cualquiera sea el pH utilizado (Figura 6).
Para conocer cul es la cantidad de sustrato necesaria es imprescindible obtener V M y KM a
cada pH.

Figura 6: Actividad enzimtica a diferentes pH y en diferentes condiciones de concentracin de

sustrato

Efecto de la concentracin de enzima:

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Cuando representamos la velocidad de la reaccin en funcin de la concentracin de

enzima podemos obtener curvas como las ilustradas en la figura 7 en que a es la curva
normal, b es la curva obtenida en presencia de un inhibidor reversible y c es la curva
obtenida en presencia de un activador disociable.
Figura 7: Efecto de la concentracin de enzima sobre la velocidad de la reaccin enzimtica

Efecto de la concentracin de sustrato:

Ya vimos que para ocurra una reaccin enzimtica debe haber una interaccin entre enzima
y el o los sustratos. En el caso ms simple la reaccin enzimtica estar descripta por la
ecuacin qumica en que un sustrato es transformado en un producto:

K1

k2

E+S

ES
k-1

E+P
k-2

en donde las constantes K son las constantes de velocidad.

La ecuacin propuesta supone la formacin del complejo enzima-sustrato (ES) y fue la base
que utiliz V. Henri en 1903 para explicar la catlisis enzimtica. En fundamento de esta
idea fue la observacin del efecto de la concentracin de sustrato sobre la velocidad inicial
de una reaccin enzimtica.
Posteriormente, en 1913, L. Michaelis y M. Menten desarrollaron una teora general en la
que postularon que la enzima se combina con el sustrato en forma reversible y rpida para
formar el complejo enzima-sustrato:
K1
E+S

ES
k-1

y que ese complejo luego d origen a la formacin de producto y liberacin de la enzima en

un proceso ms lento que el primero:
k2
ES

E+P
k-2

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por tanto la segunda reaccin es la que determina la velocidad de la transformacin.

Si se considera que slo los componentes tempranos de la reaccin estn en equilibrio,
estas condiciones se conocen como suposicin de cuasi-equilibrio o equilibrio rpido. As
la ecuacin anterior la podemos escribir:
K1
E+S

kcat
ES

E+P

k-1

donde kcat es la constante cataltica de velocidad y en las condiciones de cuasi-equilibrio

corresponde a K2.

La velocidad de la reaccin est dada por:

V=kcat [ES] (ecuacin 1)
en que [ES] representa al complejo enzima-sustrato y la velocidad mxima de la
reaccin (VM) ser:
VM = kcat [Et] (ecuacin 2)
en donde [Et]= [ES] + [EL]
La velocidad de la reaccin estar dada por la variacin de la concentracin del complejo
ES en funcin del tiempo que en el equilibrio es igual a cero, y podemos escribir:
k1 [EL] [S] = K-1 [ES] + kcat [ES]
y como [EL] = [ET] [ES]
luego K1 ([ET] [ES]) [S] = [ES] (k-1 + kcat)
resolviendo la ecuacin para [ES] y agrupando:
[ES] = ([ET][S])/ [S]+ (k-1 + kcat)/k1 ecuacin 3
dado que v= kcat [ES] (ecuacin 1)
y reemplazando en la ecuacin (1) podemos expresar la velocidad de la reaccin

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v= kcat ([ET][S])/ [S]+ (k-1 + kcat)/k1

y como VM = Kcat [ET]
luego: v=Vmax[S])/ [S]+ (k-1 + kcat)/k1
El segundo trmino del denominador es una relacin de constantes que se denomina
constante de Michaelis-Menten (Km)
Km = (k-1 + kcat)/k1
v= Vmax[S])/ [S]+ km
que es la expresin conocida como de Michaelis-Menten y que representa una ecuacin de
velocidad de una reaccin enzimtica. En ella se relaciona la velocidad de la reaccin con
la velocidad mxima que puede alcanzar la misma, la concentracin de sustrato y una
constante (Figura 8).

Figura 8: Efecto de la concentracin de sustrato sobre la velocidad de una reaccin enzimtica

Significado del KM: Si analizamos el grfico anterior veremos que el K m es la

concentracin de sustrato necesaria para alcanzar la mitad de la velocidad mxima. En
efecto, si tomamos una concentracin de sustrato idntica al valor del Km y reemplazamos
en la ecuacin de Michaelis-Menten tenemos:
v= Vmax[S])/ [S]+ [S])= Vmax/2
Por otra parte cuando Km es mucho menor que la concentracin de sustrato empleada se
alcanza la velocidad mxima de la reaccin:
v= Vmax[S])/ [S]+ Km = Vmax

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y tenemos una reaccin independiente de la concentracin de S, la velocidad es de orden

cero. Se admite que este es el caso cuando se trabaja con concentraciones de sustrato del
orden de 10 veces el valor de Km. Esto es particularmente importante cuando se procura
valorar una enzima ya que slo en estas condiciones estar trabajando la totalidad de la
misma.
A su vez cuando trabajamos con concentraciones muy bajas de sustrato:
v= (Vmax/ Km) [S]
Es decir que en estas condiciones la velocidad de la reaccin enzimtica es proporcional a
la concentracin del sustrato, consideracin de importancia cuando se desea analizar el
efecto de un metabolito mediante reacciones enzimticas.
Debe recordarse que para la mayora de las enzimas Kcat es del mismo orden de magnitud
que K-1, es decir, que en la mayora de los casos no se cumplen las suposiciones de base de
la cintica de equilibrio rpido. En esos casos definimos la K m como:
Km = (k-1 + kcat)/k1
En donde queda expresado que en esas situaciones Km es una constante dinmica o de
equilibrio que expresa la relacin entre las concentraciones reales del estado estacionario
ms que las concentraciones de equilibrio.
Por el contrario cuando Kcat es la reaccin que limita la velocidad del proceso global, es
decir que Kcat << K-1, entonces:
Km = k-1 /k1
que se define como la constante de disociacin, Ks, del complejo ES
Ks= [E] [S]/ [ES]
Cuando se verifican estas condiciones Km representa una medida de la afinidad de la
enzima por su sustrato en el complejo [ES].
Importancia del Km:
1- La constante de Michaelis-Menten es un elemento de juicio importante para
caracterizar una enzima, por lo que siempre que se purifica una enzima se trata de
conocer este valor.
2- El Km indica la afinidad de la enzima por el sustrato. Si una enzima tiene un Km
muy bajo con un determinado sustrato, significa que se requiere esa pequea
concentracin de sustrato para lograr la saturacin de la mitad de las molculas de
enzima y, por lo tanto, alcanzar la mitad de la VM con esa cantidad de enzima.

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3- El Km indica cual es el sustrato preferido de una enzima cuya especificidad es

relativamente amplia.
4- Dando valores a los trminos de la ecuacin de Michaelis-Menten se puede conocer
la concentracin de sustrato que se debe elegir para hacer el ensayo de una enzima
en condiciones de reaccin de orden cero, o sea sin que influya la concentracin de
sustrato.
5- El estudio de Km y de sus modificaciones frente a variaciones de medio de reaccin
(pH, presencia de otro sustrato, del producto, de activadores o inhibidores) es un
elemento de juicio importante para interpretar el mecanismo de una reaccin
enzimtica.
Transformaciones lineales de la ecuacin de Michaelis-Menten:
La determinacin de Km y VM en diferentes condiciones experimentales es un elemento
importante para caracterizar una enzima y su posible mecanismo de trabajo. Con el fin de
realizar estas determinaciones con exactitud Lineweaver y Burk realizaron
transformaciones lineales de la ecuacin de Michaelis-Menten y obtuvieron la ecuacin:
1/v = 1/[S] x km/Vmax + 1/Vmax
Representando grficamente 1/v= f (1/[S]) se obtiene una recta que proporciona
informacin importante respecto de los parmetros cinticos de una reaccin enzimtica tal
como se puede observar en la Figura 9:

Figura 9: Efecto de la concentracin de sustrato sobre la velocidad de una reaccin enzimtica.

Grfico de dobles recprocas de 1/v en funcin de 1/S

Efecto de inhibidores:

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Se define como inhibidores a cualquier sustancia capaz de reducir la velocidad de una

reaccin enzimtica. Los inhibidores enzimticos se clasifican en dos grandes grupos:
reversibles e irreversibles de acuerdo a que la enzima recupere o no su actividad original
una vez eliminado el inhibidor. En el primer caso el inhibidor interacta en forma
reversible con algn grupo esencial de la enzima formando un complejo enzima-inhibidor.
Se establece, entonces, un equilibrio entre este complejo y la enzima libre y el inhibidor
libre, equilibrio del mismo tipo que el observado para el complejo ES:
E+I

EI

Los inhibidores irreversibles, por otra parte, modifican o destruyen algunos grupos
esenciales para la actividad de la enzima.
Los grupos principales de inhibiciones reversibles son: competitiva, no-competitiva y
acompetitiva.
Inhibicin competitiva:
Se puede esquematizar:

El inhibidor se combina reversiblemente con el sitio activo de la enzima, en el mismo lugar

donde se une el sustrato, impidiendo de esta manera el ligamiento de este ltimo. Se
denomina competitiva porque tanto el inhibidor como el sustrato compiten por el mismo
sitio. Este tipo de inhibicin puede ser analizada aplicando los principios estudiados del
cuasi-equilibrio o equilibrio rpido. Las fijaciones de sustrato e inhibidor son mutuamente
exclusivas. A muy altas concentraciones de sustrato desaparece la inhibicin. El inhibidor
es tan especfico como el sustrato. Por lo general, el inhibidor competitivo es un anlogo
qumico del sustrato. La inhibicin competitiva es utilizada teraputicamente para tratar
pacientes que han ingerido metanol. Este compuesto se convierte en metaldehdo por
accin de la enzima alcohol deshidrogenasa. El metaldehdo produce dao permanente en
muchos tejidos y ceguera. La terapia para los pacientes intoxicados con metanol es la
inyeccin, intravenosa, de etanol que es sustrato de la misma enzima y compite con el
metanol. La Figura 10 muestra el grfico de doble-recprocas de la reaccin de la E con su
S en presencia de diferentes concentraciones de I donde se puede observar que la V M de la
reaccin permanece inalterada mientras que el Km aumenta en presencia del inhibidor.

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Figura 10: Grfico de doble-recprocas de la reaccin de la E con su S en presencia de diferentes

concentraciones de un inhibidor competitivo

Inhibicin no-competitiva:
El inhibidor se une a la enzima en un sitio diferente al sitio activo. La enzima es inactivada
cuando se une el inhibidor, ya sea que el sustrato se encuentre unido a la enzima o no. El
inhibidor se fija indistintamente a la enzima libre o al complejo enzima- sustrato ES. Se
forma un compuesto ternario que es catalticamente inactivo y que no puede escindirse para
formar producto y complejo enzima-inhibidor. El equilibrio sera:

en donde la VM medida = VM aparente es menor que la VM de la reaccin en ausencia del

inhibidor. La Figura 11 muestra el grfico de 1/v= f (1/[S]) en presencia de diferentes
concentraciones de inhibidor . La afinidad de la enzima por su sustrato no es alterada por la
presencia del inhibidor.

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Figura 11: Grfico de doble-recprocas de la reaccin de la E con su S en presencia de diferentes

concentraciones de un inhibidor no-competitivo

Inhibicin acompetitiva:
Un sistema unirreaccionante se puede representar por el equilibrio:

en el que el inhibidor se une reversiblemente a un sitio de la enzima diferente al sitio de

ligamiento del sustrato. A diferencia de la inhibicin no-competitiva, en la inhibicin
acompetitiva el inhibidor se une, nicamente, al complejo ES y forma un complejo ternario
ESI no productivo. En la Figura 12 podemos ver el grfico de 1/v = f (1/[S]) a distintas
concentraciones de inhibidor donde se puede apreciar que tanto VM como Km estn
afectado por la accin del inhibidor.

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Figura 12: Grfico de doble-recprocas de la reaccin de la E con su S en presencia de diferentes

concentraciones de un inhibidor acompetitivo

Estos principios generales se pueden aplicar a reacciones ms complejas.

Los inhibidores irreversibles se combinan y/o destruyen grupos funcionales de la enzima
que son esenciales para su actividad. Un caso comn es la formacin de uniones covalentes
entre un inhibidor irreversible y una enzima. Es por este motivo que la utilizacin de
inhibidores irreversibles es muy frecuente para estudiar mecanismos de reaccin. Un grupo
especial de inhibidores irreversibles son los llamados inhibidores suicidas que tienen la
caracterstica de reaccionar con la o una de las primeras enzimas de una va metablica
unindose irreversiblemente a ella interrumpiendo la secuencia de reacciones. Este tipo de
inhibidores se est aplicando en la industria farmacutica por su capacidad de actuar,
nicamente, en el sitio activo de una determinada enzima, es inocuo para las dems y, por
tanto, posee muy pocos efectos secundarios.
Activacin enzimtica:
Los activadores son modificadores que incrementan la velocidad de una reaccin catalizada
por enzimas. Se consideran dos tipos principales a saber: esenciales y no esenciales.
Activacin esencial: En estos casos no hay actividad enzimtica en ausencia del activador.
El verdadero sustrato de la enzima es un complejo sustrato-activador. Este fenmeno es
comn en reacciones que involucran intermediarios fosforilados, especialmente
nuclesidos. Casi todas las reacciones que involucran ATP requieren Mg 2+. Lo mismo
ocurre con las pirofosfatasas, enzimas que tiene pirofosfato complejado con Mg 2+ como
sustrato. Los estudios cinticos de reacciones que involucran un complejo enzima-activador
son bastante complicados y an ms complicaciones surgen cuando estn involucrados ms

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de un complejo metal-sustrato en la reaccin y cada sustrato tiene una afinidad diferente

por el metal.
Activacin no esencial: la reaccin puede ocurrir en ausencia del activador y su velocidad
es aumentada por la presencia de ste.
REGULACIN DE METABOLISMO VEGETAL
Normalmente, la maquinaria celular se mueve con el mayor ahorro posible de la energa y
esto es posible por la presencia de mltiples mecanismos de regulacin que aseguran a la
clula la formacin de cada producto que le sea necesario en un momento determinado.
La actividad de las enzimas reguladoras es modulada a travs de varios tipos de molculas
seales que generalmente son pequeos metabolitos o cofactores. Existen dos clases
principales de enzimas reguladoras,
1: las enzimas alostricas que funcionan a travs de la unin reversible y no covalente de un
metabolito regulador llamado modulador.
2: las enzimas reguladoras que funcionan por modificacin covalente reversible.
Ambas clases de enzimas reguladoras tienden a tener varias subunidades y en algunos casos
los sitios reguladores y activos se encuentran en diferentes subunidades.
Existen, por lo menos, dos mecanismos adicionales de regulacin de la actividad
enzimtica.
3: Algunas enzimas son activadas o inhibidas por protenas de control que se les unen y
afectan su actividad.
4: Otras son activadas por ruptura proteoltica que, a diferencia de otros mecanismos, es
irreversible.
Modulacin de la actividad enzimtica por pequeos metabolitos:
Un importante mecanismo de regulacin de una va metablica por pequeos metabolitos
es la regulacin por producto final. En una va metablica regulada por producto final en
que un metabolito A es convertido a travs de varios pasos en el metabolito Y, por accin
de las enzimas E1, E2, E3, etc y, ocurrir que el metabolito Y inhibir a la enzima inicial de
la va metablica. La enzima E1 es conocida como enzima reguladora.
E2
A

E3
C

E1

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Generalmente el producto final es estructuralmente distinto al sustrato inicial, de donde se

dedujo que las enzimas correspondientes al tipo E1 de esta secuencia, es decir, las enzimas
reguladoras, tiene sitios distintos para el ligamiento del sustrato y para la unin del
inhibidor. Estos inhibidores han sido llamados alostricos por Monod y Col. (1963), y los
sitios a que se unen fueron llamados alostricos. Por esta misma razn tambin suelen
denominarse enzimas alostricas. La unin de los inhibidores a estos sitios producira
cambios en el estado conformacional de la molcula enzimtica producindose
modificaciones en el sitio activo. Un inhibidor alostrico puede decrecer la afinidad por el
sustrato, lo que se traducira por un aumento del Km, o bien puede afectar la eficiencia
cataltica de la enzima produciendo una disminucin de la V M. Tambin es posible la
produccin simultnea de ambos tipos de fenmenos.
La retroinhibicin es un modo muy efectivo de control puesto que al regular la primera
etapa de una va metablica regula la totalidad del flujo metablico que transcurre por la
misma. Esto evita la acumulacin de cada uno de los metabolitos intermediarios de la va.
En la medida en que el metabolito final sea utilizado, la inhibicin va desapareciendo y el
flujo de metabolitos se reinicia.
Los moduladores de las enzimas alostricas pueden ser activadores o inhibidores. Un
activador, a menudo, es una molcula de sustrato y en este caso las enzimas reguladoras en
las que el sustrato y el modulador son iguales se llaman homotrpicas. Por otra parte
cuando el modulador es una molcula diferente del sustrato la enzima es heterotrpica.
Algunas enzimas tienen dos o ms moduladores.
Merece destacarse que las propiedades de las enzimas alostricas son significativamente
diferentes de las enzimas no reguladoras. Algunas de estas diferencias son estructurales, es
as como las enzimas alostricas, adems de los sitios de ligamiento de sustrato tienen uno
o ms sitios alostricos o reguladores para la unin del modulador. Los sitios de ligamiento
son especficos para cada uno de esos componentes y, adems, las enzimas con
moduladores diferentes tienen diferentes sitios de unin para cada uno de ellos. Es de hacer
notar que en las enzimas homotrpicas los sitios activos y reguladores son iguales.
Estructuralmente, las enzimas reguladoras son en general ms complejas que las enzimas
simples. La mayora de ellas tienen ms de una cadena polipeptdica o subunidad. Otra
diferencia radica en las propiedades cinticas. Las enzimas alostricas muestran relaciones
entre Vi y [S] que difieren del comportamiento de Michaelis-Menten. An cuando se
observa saturacin con concentraciones de S suficientemente altas en los grficos de V i= s
([S]) se obtiene una curva de saturacin sigmoidal
Inhibidores y activadores
alostricos
1.0

0.8

0.6

0.4

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0.2

s
0.0
0

10

12

Figura 13: Efecto de la concentracin de sustrato sobre la velocidad de una enzima alostrica.

En esa curva se puede encontrar un valor de [S] para el que V i= VM, en este caso no
podemos referirnos al valor de Km porque la enzima no sigue la cintica de MichaelisMenten. En esos casos se utiliza S0,5 o K0,5 para representar la concentracin de sustrato
para la cual se alcanza la mitad de la VM de la reaccin catalizada por una enzima
alostrica.
Un comportamiento sigmoideo de la curva de Vi= f ([S]) significa que existe interaccin
cooperativa entre las subunidades de la protena, es decir, que cambios en la estructura de
una subunidad producidos por unin de un ligando se transmiten a las subunidades
adyacentes. Este efecto est mediado por interacciones no-covalentes en la interfase de las
subunidades. Las enzimas alostricas homotrpicas, generalmente, poseen varias
subunidades. Frecuentemente el mismo sitio de unin de un sustrato en una subunidad se
comporta como un sitio regulador. As para una enzima alostrica homotrpica la unin de
una molcula de sustrato altera la conformacin de la enzima y como consecuencia la
afinidad del mismo por los otros sitios (frecuentemente acta como activador). Este
comportamiento contribuye para la sigmoidicidad de la curva ms que para el aumento
hiperblico en Vi con el aumento de [S].
En el caso de las enzimas heterotrpicas en las que el modulador es un metabolito diferente
del sustrato es difcil generalizar el aspecto de la curva de saturacin del sustrato. As un
activador puede generar una curva de saturacin ms cercana a una curva hiperblica con
una disminucin de K0,5 y sin cambio en V M, resultando, de esta manera, un aumento en la
velocidad de reaccin a una concentracin fija de sustrato. Otras enzimas alostricas
responden a un activador aumentando la VM y con una muy poca alteracin del K0,5. Un
modulador negativo (inhibidor) puede producir una curva de saturacin ms sigmoidea con
un aumento de K0,5.
Las enzimas alostricas muestran diferentes tipos de respuestas en sus curvas de actividad
versus concentracin de sustrato. Los moduladores que para alguna de ellas son
activadores, de otras son inhibidores y en algunos casos se presentan ambos tipo de
moduladores simultneamente.
Retroinhibicin secuencial:
Este tipo de inhibicin se produce en vas metablicas ramificadas en que, por lo tanto, hay
ms de un producto final. Sea la secuencia metablica:

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Ea
A

Ec
B

C
Ee

En esta secuencia, cuando se acumula el producto E, la primera enzima responsable de la

ramificacin que lleva a la produccin de E, es decir Ec, ser inhibida sin que por eso deje
de funcionar la conversin de C en G. A su vez, cuando tambin se haya acumulado G se
producir la inhibicin de la enzima Ee. Si ambos productos, E y G estn acumulados, esto
ocasionar la acumulacin de C, el efecto alostrico de Ea, con lo que, eventualmente, se
paralizar el flujo de metabolitos por la va metablica.

Retroinhibicin concertada:
Se trata de un caso de retroinhibicin en que cuando hay ms de un tipo de producto final
ninguno es capaz, por si solo, de inhibir la enzima, o bien la inhiben en muy baja
proporcin pero cuando se acumulan simultneamente todos los productos finales stos
actan concertadamente inhibiendo significativamente a la enzima. La inhibicin
concertada no equivale a la suma de las inhibiciones producidas por cada inhibidor, sino
que es mucho mayor, por ejemplo, si el metabolito inhibidor E inhibe un 20 % y el G
inhibe tambin un 20 %, la inhibicin concertada puede alcanzar valores del 90 %. Como
en el caso anterior, adems del mecanismo descripto suele observarse retroinhibicin por
cada producto final sobre la primera enzima de la ramificacin correspondiente.

Ea
A

Ec
B

C
Ee

Ejemplos en el metabolismo vegetal

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Antranilato

corismato

prefenato

arogenato

Corismato mutasa

Triptofano

Fenilalanina

La corismato mutasa es activada por triptfano para aumentar la produccin de

fenilalanina. Altas concentraciones de fenilalanina inhiben a la corismato mutasa
Regulacin por modificacin qumica:
Estas enzimas son reguladas por la unin qumica de grupos especficos, unin que es
catalizada enzimticamente.
La ribulosa 1,5 difosfato carboxilasa oxigenasa (RUBISCO), enzima que lleva a cabo la
fijacin fotosinttica del CO2, es regulada por modificacin qumica. Esta involucra la
carbamilacin de un residuo de lisina. Cuando la concentracin de CO 2 es alta una reaccin
de carbamilacin ocurre, espontneamente. Es de hacer notar que el sustrato de la enzima,
es decir, la ribulosa 1,5 difosfato, es un inhibidor de la transformacin y que esta inhibicin
es prcticamente completa en condiciones fisiolgicas del CO 2. Sin embargo existe una
enzima, la rubisco activasa, que promueve la activacin de la RUBISCO dependiente de
ATP. El mecanismo es desconocido y tampoco es claro el papel que juega el ATP (Figura
14).

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Figura 14: Reaccin de carbamilacin de la Enzima RUBISCO

Adems, la carbamilacin est favoreca por pH alcalino y altas concentraciones de Mg 2+

que favorecen la formacin del complejo (estas condiciones aumentan durante la
iluminacin).
Otro ejemplo es el de una enzima clave en la sntesis de la sacarosa, la sacarosa fosfato
sintetasa, cuya actividad est regulada por la fosforilacin proteica de la enzima (Figura
15). En efecto sobre la enzima acta una quinasa transformndola de una forma de baja
afinidad por los sustratos en otra de alta afinidad. Sobre esta forma de alta afinidad acta
una fosfatasa que da origen a la forma de baja afinidad.

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Figura 15: Regulacin de la actividad de una enzima por fosforilacin-defosforilacin

Modulacin redox de la actividad enzimtica:

Se conoce un cierto nmero de enzimas vegetales que son activadas o inhibidas por su
estado de oxidacin o al menos por la presencia de ciertos oxidantes o reductores en sus
soluciones.
Para mayor claridad consideremos por una parte a aquellas enzimas que son reguladas por
un sistema compuesto por la ferredoxina y la tiorredoxina, que comprende algunas enzimas
de los cloroplastos, y por exclusin tenemos otro grupo cuyas enzimas son sensibles a
ciertos compuestos redox.
Enzimas reguladas por el sistema ferredoxina-tiorredocina: como ya se indic estas
enzimas estn localizadas en el cloroplasto. El estmulo bsico regulador de esas enzimas
proviene de la luz. La accin de la luz se efecta a nivel del fotosistema I. El flujo de
electrones ocasionado por la luz pasar el aceptor P430 y de all a la ferredoxina soluble
(Figura 16).
Por accin de la NADP-tiorredoxina reductasa, enzima cuya estructura corresponde a una
flavoprotena, el electrn de la ferredoxina es utilizado para reducir la tiorredoxina. La
tiorredoxina es una protena de bajo peso molecular capaz de transportar electrones.
Contiene un grupo cisteina que sufre reduccin reversible a la forma de sulfhidrilo. Adems
de la reduccin enzimtica a nivel fisiolgico, la ferredoxina puede ser reducida
qumicamente por DTT (ditiotreitol). Finalmente hay una reduccin de las enzimas del
grupo por la tiorredoxina.
Las enzimas activadas por este sistema son: fructosa-1, 6-bisfosfatas, sedoheptulosa-1, 7bisfosfatasa, NAD-gliceraldehdo, 3-fosfato deshidrogenasa, ribulosa-5-fosfato quinasa que
forman parte del ciclo del Calvin (fotosntesis). Adems, este mecanismo tambin activa la
NADP-malato deshidrogenasa y la fenilalanina amonio liasa. Normalmente se considera

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que el ciclo de Calvin est situado en lo que se denomina la fase oscura de la fotosntesis,
sin embargo, algunas enzimas del ciclo prcticamente no son funcionales en la oscuridad,
por tanto, la diferenciacin tradicional entre fase oscura y luminosa de la fotosntesis carece
de validez.
Mecanismo de desactivacin enzimtica en la oscuridad: no habra un nico mecanismo de
desactivacin de este grupo de enzimas. Se pueden clasificar en tres tipos considerando sus
mecanismos de desactivacin. El primer tipo, a los que pertenece la fructosa-1, 6-bisfosfata,
la ribulosa-5-fosfato quinasa y la fenilalanina amonio liasa, es desactivado por un oxidante
soluble como el glutatin oxidado (GSSG) o por el cido dehidroascrbico.
En el segundo tipo tendramos, nicamente, la NADP-malato deshidrogenasa, que
requerira un oxidante ligado a membranas. Las enzimas del tercer grupo, tales como
NADP-gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa, no poseen mecanismos conocidos de
desactivacin.
Tanto la desactivacin de las enzimas activadas por tiorredoxina, como su activacin se
hacen a una velocidad menor a la de la catlisis, es decir, se tratara de enzimas histerticas.

Figura 16: Modulacin redox de la actividad enzimtica

Enzimas no dependientes de la tiorredoxina:

Han sido descriptas varias enzimas vegetales que son activadas por oxidantes y
desactivadas por reductores. Estas enzimas parecen estar situadas fuera de los plstidos. La

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nitrato reductasa, por ejemplo, es activada por ferricianuro y desactivada por NADPH. Sin
embargo, no se conoce el oxidante fisiolgico de la enzima. Las fosfatasas cidas no
especficas de hojas y tubrculos son activadas por GSSG y por cido deshidroascrbico
con corrimiento del pH ptimo de modo que las enzimas son activas a pH neutro y cido. A
pH neutro la activacin producida por GSSG es revertida por GSH. La modulacin redox
de fosfatasas cidas de cianobacterias tambin ha sido comunicada.
CONTROL METABLICO POR LA CARGA ENERGETICA DEL ADENILATO
Atkinson ha sugerido que la relacin entre ATP, ADP y AMP debe estar regulada contra
fluctuaciones demasiado grandes a fin de que la clula permanezca en estado operacional.
La produccin de ATP debera estar regulada de modo que sea igual a su velocidad de
movilizacin. Consecuentemente, con estas ideas se encontr que la existencia celular de
adenilado, esto es la suma del total de ATP, ADP y AMP contenida en la clula es
constante. Por tanto la utilizacin de ATP producira cantidades equivalentes de AMP y
ADP segn el tipo de reaccin con que se est consumiendo el ATP. Por otra parte, hay una
enzima que interrelaciona a los tres componentes del adenilado, posibilitando un equilibrio
directo entre ellos. Esta enzima es la adenilato quinasa que cataliza la reaccin:
ATP + AMP

2ADP

Adenilato quinasa
Atkinson y Walton (1967) propusieron el trmino de carga energtica para expresar el
estado energtico del adenilato:
Carga energtica = ATP + ADP/ ATP + ADP+ AMP
La carga energtica del adenilato ser igual a 1 cuanto todo el adenilato est como ATP, y
ser igual a 0 si est totalmente convertido en AMP. Las enzimas que forman ATP (por ej.
la fosfofructoquinasa) son activas a bajos valores de carga energtica y poco activas a altos
valores. Las enzimas que utilizan el ATP (por ej. la ADP-glucosa pirofosforilasa) con fines
biosintticos, en cambio, son menos activas a bajos valores de carga energtica y muy
activas a altos valores.
Ambos tipos de enzimas son altamente sensibles a variaciones de la carga energtica en la
zona de 0,8.
Se constat que un considerable nmero de clulas tienen valores de carga energtica entre
0,8 y 0,95. Se piensa que las enzimas reguladas por la carga energtica estn diseadas para
mantener constante el nivel de carga energtica de la clula.
Enzimas de vegetales superiores moduladas por la carga energtica del adenilato:
La 3-fosfoglicerato quinasa de cloroplastos y de citoplasma de hojas de arveja son
reguladas por cambios de la carga energtica del adenilato. El AMP inhibe tanto la
actividad de formacin del 3-fosfoglicerato (reaccin de formacin de ATP) como la de

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formacin de 1,3-difosfoglicerato (reaccin de consumo de ATP). En cambio el ATP inhibe

la formacin de 3-fosfoglicerato. La regin de mayor sensibilidad a los cambios energticos
est entre 0,8 y 1 para ambas reacciones. A alta carga energtica la actividad de formacin
del 1,3-difosfoglicerato se acenta, acentuando con ello la sntesis de carbohidratos,
mientras que a baja carga energtica (menor que 0,8) se formara, preferencialmente, 3fosfoglicerato, es decir, se favorece la gliclisis.
Estudios efectuados con cloroplastos y citoplasma de Elodea demostraron que a la luz, la
carga energtica es muy alta (mayor que 0,9), mientras que es baja en la oscuridad (del
orden de 0,67 en cloroplastos y de 0,76 en el citoplasma), lo que sugiere que la direccin de
la reaccin de la 3-fosfoglicerato quinasa puede estar siendo regulada durante la fotosntesis
y en la oscuridad.
Estudiando la fosfofructoquinasa vegetal se encontr que ni el ADP ni el AMP son
inhibidores de la enzima. El ATP y el citrato son inhibidores, y sus inhibiciones son
parcialmente suprimidas por el Pi. Adems, el Pi es un potente inhibidor de las ADPglucosa pirofosforilasas de algas y plantas superiores, por lo cual tambin debera
considerarse el Pi en el estudio de los efectos de la carga energtica del adenilato en las
plantas.

Regulacin por compartimentalizacin

Existen dos tipos de compartimentalizaciones que interviene en la regulacin de la
actividad enzimtica. Una es la compartimentalizacin por membranas que hacen las veces
de tabiques aislando compartimientos, otra es la efectuada por complejos enzimticos.
Compartimentalizacin efectuada por complejos multienzimticos:
Los sistemas multienzimticos han sido descriptos como agregados de enzimas diferentes
pero funcionalmente relacionadas, unidas por fuerzas no covalentes en una estructura
altamente organizada. Estos sistemas pueden ser solubles o asociados a membranas, pero
puesto que las fuerzas que unen a estas enzimas entre s o a estructuras citoplasmticas
pueden ser muy laxas, los procesos de extraccin son capaces de separar las enzimas
individuales y existe la posibilidad de que muchas secuencias metablicas que se cree son
ejercdas por enzimas solubles, fsicamente independientes, sean artificios de los procesos
de obtencin.
Los complejos multienzimticos poseen una eficiencia cataltica aumentada con respecto a
la accin que tendran sus enzimas componentes si estas estuvieran libres en la solucin. La
mayor eficiencia cataltica de las enzimas complejadas sera debido a la canalizacin del
flujo de metabolitos los que pueden ser directamente transferidos en el complejo de enzima
a enzima o bien puede deberse al decrecimiento del perodo de difusin de los
intermediarios, el que estar esencialmente limitado al microambiente del complejo. En las
enzimas solubles los intermediarios deben equilibrarse con el medioambiente en que se

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encuentran las enzimas. Los sistemas multienzimticos tambin presentan un potencial

mayor para la captacin afinada de controles coordinados de activacin o inhibicin,
cambios del pH, etc. Debido a que hay ausencia o limitaciones de intermediarios libres los
productos intermediarios inestables estn protegidos. Los sistemas transportadores de
electrones de las mitocondrias y de los cloroplastos son ejemplos de este tipo.
Criterios para la deteccin de sistemas multienzimticos complejados: Para la deteccin de
un sistema multienzimtico complejado debe establecerse, ante todo, que la transformacin
de un compuesto sucede por pasos mltiples. Se determinan las condiciones ptimas del
proceso global y, si es factible, la de cada paso. Al purificar el sistema se presentar
copurificacin, la que puede demostrarse por una relacin constante entre la actividad
global y por lo menos una reaccin parcial. Adems, el aadido de intermediarios, con una
concentracin limitante del metabolito inicial no debe aumentar la velocidad de la reaccin
global. Finalmente puede compararse la razn 3H/14C del producto y de los intermediarios
luego de una incubacin con cantidades limitantes del sustrato inicial marcado con 3H e
intermediario exgeno marcado con 14 C. Razones mayores que 1 indican que no hay
intercambio entre el intermediario exgeno y el endgeno del sistema.
Ejemplos especficos: un ejemplo de este tipo de regulacin en vegetales ha sido descripto
para un alga y para plantas superiores, ejemplo localizado en una secuencia de dos etapas
ubicadas en la via metablica del fenilpropano. En esta secuencia la fenilalanina es
convertida en el cido P-cumrico e involucra dos enzimas, la fenilalanina amonio liasa
(PAL) y la cinamato-4-hidroxilasa (C4H).
En esta secuencia el cido P-cumrico es formado a mayor velocidad a partir de la
fenilalanina que cuando se parte del cido cinmico. Esto se cumple cuando el cido
cinmico es utilizado a una concentracin equivalente a la producida por la actividad de la
PAL.
Fenil alanina
Fenilalanina amonio liasa (PAL)
Cinamato

cido p-cumarico

cido cafeico

cido ferlico

Dra Mara Ins Isla

Estos datos indican la existencia de una canalizacin de los sustratos intermediarios.

Utilizando la tcnica descripta de la doble marcacin se confirm la presencia de una
canalizacin de sustratos. Para ello se incub una mezcla de enzimas con el sustrato de
partida (Fenilalanina marcada con 3H) y el intermediaro exgeno (cinamato 14C). Luego de
cierto tiempo de incubacin se aislaron los cidos cinmico y P-cumrico, determinndose
la relacin 3H/14C de cada producto. Luego se determina el cociente de las razones del
producto respecto al intermediario:
3

H/14C cido p-cumrico/3H/14C cido cinmico

Si el cociente es menor que 1 el sistema est compuesto por enzimas solubles

independientes, pero si es mayor que 1 demuestra la presencia de un complejo con
canalizacin de metabolitos. Cuanto ms alto que 1 resulte el cociente tanto ms
estrechamente estar unido el complejo. La tabla muestra los resultados obtenidos con
varios vegetales.
Recientemente se ha comunicado la existencia, en tilacoides de algas, de un complejo
multienzimtico que lleva desde la fenilalanina al ac. Cafeico, y de steres del ac. Ferlico
que completa an ms la va biosinttica del fenil-propano que acabamos de describir.
Otros complejos enzimticos descriptos en plantas actuando con compartimentalizacin son
el de la durrina (Glicsido cianognico) cuya sntesis se inicia con la tirosina, la que es
transformada en N-hidroxitirosina, y esta a su vez es la oxima correspondiente (phidroxifenilacetaldoxima), la que luego pasa a nitrilo (p-hidroxifenilacetonitrilo), el que se
descompone espontneamente a 4-hidroxibenzaldehido por ausencia de los pasos que faltan
en el sistema aislado para la formacin de la durrina. Hay otros complejos multienzimticos
descriptos en plantas pero los estudios correspondientes an no fueron completados.

Compartimentalizacin por membranas: El metabolismo vegetal se muestra regulado por la

existencia de compartimentos en un grado muy superior al del organismo animal. Es bien
conocida la ocurrencia de la fotosntesis en el cloroplasto de los vegetales, un rganulo
celular y como tal previsto de membranas. La biosntesis de cidos grasos es
exclusivamente cloroplastdica y la bio sntesis de estos compuestos en tejidos no verdes
parecera, tambin, efectuarse en plstidos. Otras enzimas que se encuentran en los
plstidos son las enzimas sintetizantes de los terpenos y las de varios pigmentos, as como
las enzimas que llevan al N de los nitratos a nivel de los aminocidos.
Se acepta que los cloroplastos contienen las enzimas del ciclo reductor de las pentosas
fosfato, pero debemos considerara que hay enzimas citoslicas que catalizan reacciones
similares a las del ciclo en la gliclisis y en la via oxidativa de las pentosas fosfato. Por

Dra Mara Ins Isla

ejemplo, se han descripto las siguientes enzimas localizadas tanto en citosol como en
cloroplastos: ribosa-5-fosfoisomerasa, fosfoglicerato quinasa, fructosa-1, 6-difosfato
aldolasa y triofosfato isomerasa. Las enzimas homlogas de ambos compartimentos son
isoenzimas (es decir enzimas con la misma funcin cataltica pero con diferencias menores
o mayores en la estructura, que pueden conferirles diferentes propiedades fsicas, cinticas
o reguladoras). Sin embargo las propiedades fsicas y cinticas de estas isoenzimas estn
muy prximas.
Un caso particular es la compartimentalizacin de ciertas enzimas en vacuolas. Entre ellas
parece particularmente importante la presencia de toda o casi toda la invertasa cida soluble
en la vacuola (la invertasa es la enzima que hidroliza la sacarosa a glucosa y fructosa).
Merece destacarse que los azcares de reserva ms importantes en las plantas superiores
son el almidn y la sacarosa y que es en forma de sacarosa como se transporta la mayor
parte del fotosintato en las plantas superiores. Se han hecho ensayos con un derivado
fluorado de la sacarosa, la 1-fluorosacarosa, que no es atacado por las invertasas pero si por
la sacarosa sintetasa (la sacarosa sintetasa, en una reaccin reversible, es capaz de convertir
la sacarosa y el UDP en UDPG y fructosa), enzima que lo convierte en UDPG y fructosa
fluorada. Suministrando este compuesto marcado con 14C a tejidos de vegetales superiores
la marcacin no se distribuye a ningn metabolito. Esto parece confirmar que la
degradacin de la sacarosa se hace, en los vegetales superiores, por la intervencin de la
invertasa. Ya se haba demostrado que algunos tejidos de la caa de azcar en los que no se
detect la presencia de sacarosa sintetasa pero s de invertasa, son capaces de metabolizar la
sacarosa. Por otra parte se demostr que en las vacuolas de las plantas superiores hay,
tambin sacarosa. Por tanto debe existir un mecanismo que, dentro del compartimento,
impida la rotura ilimitada de sacarosa. Hay, adems, isoenzimas de la invertasa localizadas
en la pared celular, las que actuaran en el transporte de la sacarosa.
CONTROL DE METABOLISMO POR INDUCCIN-REPRESIN ENZIMTICA.
Tanto en los organismos procariotas como en los eucariotas existen dos tipos de enzimas,
uno cuyo nivel se mantiene constante e independiente de los estados metablicos de la
clulas, denominadas enzimas constitutivas, y otro cuya presencia puede ser dbil, o
inclusive indetectable, y que segn los estados metablicos de la clula su concentracin
puede aumentar centenares de veces. La concentracin de estas ltimas enzimas suele
aumentar o disminuir frente a la presencia de determinados metabolitos, y se las conoce
como enzimas inducibles y al metabolito que provoca su aumento se lo denomina inductor.
A su vez el fenmeno por el cual se produce el aumento de la cantidad de enzima es
conocido como induccin.
Hay, adems, mecanismos adicionales en que ciertos catabolitos minimizan la cantidad de
enzima inducida an cuando en el medio celular haya un inductor. Este tipo de mecanismo
es conocido como represin por catabolito o represin catablica.

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Estos mecanismo se ejercen, segn se indic, por aumento o disminucin de la cantidad de

enzima y por tanto supone la sntesis, de novo, de protenas, es decir, que involucran la
expresin y regulacin gentica.
Induccin y represin en eucariotas: Hay varias diferencias importantes entre los
organismos procariotas y eucariotas. En efecto, a diferencia de los procariotas que slo
poseen un tipo de RNA polimerasa, los eucariotas poseen tres tipo de RNA polimerasas
DNA dependientes que se encuentran en los ncleos. La RNA polimerasa I, que transcribe
los genes de RNA ribosmico, est localizada en el nucleoplasma y su actividad elongante
es especficamente inhibida por la -amanitina (toxina de Amanita phalloides). La RNA
polimerasas I y II inician la transcripcin en regiones de DNA de cadena simple. La RNA
polimerasa III transcribe los tRNA y los 5S, estando localizada en el nucleoplasma. Esta
ltima enzima es capaz de trabajar tanto con DNA de cadena simple como doble.
Una diferencia notoria es el hecho de que el genoma procariota suele expresarse por genes
coordinados, esto es, por operones. El genoma eucariota, por el contrario, no slo no se
expresa de esta manera sino que las secuencias nucletidas del mRNA no se corresponden
con una nica secuencia del DNA sino con varias secuencias separadas a los largo del
genoma. Finalmente, los mRNA eucariotas necesitan un proceso de maduracin pues
poseen intercaladas secuencias no codificantes, intrones, y secuencias codificantes, exones,
siendo necesaria la eliminacin de los intrones. El conjunto de estos segmentos no
codificante del mRNA recibe el nombre de RNA heterogneo (HnRNA). Por tanto el
concepto de un gen una protena no corresponde a los organismos eucariotas. En
consecuencia no podemos hablar de cistrones sino de unidades de transcripcin. El proceso
de transcripcin es ms lento en los eucariotas y menos intenso.
Mtodos utilizados en el estudio de la induccin en plantas:
Los estudios de induccin en plantas estn largamente basado en anlisis genticos,
tecnologa de muy difcil aplicacin a los vegetales superiores. Por esta razn el enfoque de
esta cuestin en plantas superiores debe hacerse utilizando otras tecnologas.
Cuando la actividad de una enzima en un tejido u rgano vegetal aumenta rpidamente
como respuesta a un metabolito se agrega, al proceso, inhibidores de las sntesis proteca
capaces de actuar a diferentes niveles en el proceso biosinttico de las protenas. De este
modo se procura establecer si el cambio de la actividad en cuestin es debido a la sntesis,
de novo, o si se debe a la formacin de enzima a partir de protena preexistente. Es
necesario conocer el efecto del inhibidor empleado sobre la actividad in vitro de la enzima
en estudio a fin de asegurar de que cualquier registro de disminucin de la enzima no sea
causado por fenmenos de inhibicin de la actividad enzimtica del tejido.
Este mtodo ha brindado resultados positivos hasta el presente. Algunos autores utilizaron
el estudio comparado simultneo de varias enzimas que se estn sintetizando (actividad en
aumento) al mismo tiempo en el tejido, observando, en todas ellas el efecto de los
inhibidores de la sntesis proteca y de los probables metabolitos inductores. Segn los

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resultados que se obtengan es posible inferir cual es la base de los fenmenos observados.
La mejor recomendacin que se puede dar para estos y otros tipos de estudios es la de
aplicar ms de un tipo de tecnologa, cuando esto es posible, para el anlisis del problema,
y ver si no es posible, adems para mayor rigor, la aplicacin de mtodos propios.
Principales inhibidores de la sntesis proteica utilizados para el estudio de induccinrepresin en plantas: Ya indicamos que la sntesis de protenas puede ser inhibida a
diferentes niveles. As tenemos los inhibidores de las sntesis del RNA, entre los que se
utilizaron la actinomicina D y la 6-metilpurina. Como inhibidores de la traduccin del
cdigo tambin se utilizaron la cicloheximida (actidiona), que inhibe la formacin de la
unin peptdica y afecta la iniciacin de las cadenas polipeptdicas en sistemas libres de
clulas de embriones de trigo. Las cicloheximida slo acta en eucariotas, pero no en
procariotas. La puromicina tambin ha sido empleada en la inhibicin de la sntesis proteca
en tejidos vegetales y en sistemas libres de clulas. La puromicina interrumpe la elongacin
de la cadena polipeptdica provocando la liberacin de un derivado covalente peptidilpuromicina.
Se ha comunicado un efecto represor de la biosntesis de la invertasa cida soluble
(vacuolar) de tallos de caa de azcar por la glucosa y la fructosa. Esta interpretacin est
basada en que la velocidad mxima de prdida de actividad invertsica en presencia de
glucosa fue la misma que en presencia de inhibidores generales de la biosntesis de
protenas. Adems, la sntesis de peroxidasa no fue inhibida por la glucosa y por tanto, la
glucosa no parece alterar los niveles de sutratos, ribosomas ni enzimas requeridos para la
biosntesis de protenas.
Regulacin por protenas: Un ejemplo tpico de la regulacin enzimtica por protenas,
tomado de la literatura, es el de la invertasa cida soluble de tubrculos de Solanum
tuberosum (papa). Esta encima est regulada por un inhibidor proteico, el que ha sido
purificado, primero por Pressey (1967) y luego por varios otros investigadores. El peso
molecular del inhibidor es de 17.000, es decir que se trata de una protena relativamente
pequea. El producto purificado acta como un inhibidor no-competitivo irreversible,
llegando a suprimir completamente la actividad de la invertasa a cualquier pH. Sin
embargo, esta capacidad inhibitoria es mxima a pH 4,5 pero a medida que nos alejamos de
este pH, tanto hacia valores superiores como inferiores, las concentraciones de inhibidor
capaces de producir la inhibicin total va aumentando.
Otra caracterstica del inhibidor es que, cuando se utiliza a concentraciones moderadas
como efector de la invertasa cida soluble de papa, la actividad invertsica exhibe dos
ptimos de pH, uno a 5,5-6 y otro mayor por debajo de pH 3.
Sin embargo se demostr (Isla y col., 1991) que el inhibidor proteico de la invertasa cida
soluble de S. tuberosum es una lectina, las que por definicin pueden unirse,
especficamente, a ciertos azucares, estn o no libres en la solucin, o bien a secuencias
glicosdicas particulares para cada tipo de lectina. Como las invertasas son glicoprotenas
cualquier lectina capaz de reconocer los azcares o secuencias de azcares de sus cadenas

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glicosdicas pueden unirse a la invertasa, y por ende provocar cambios en las propiedades
de la enzima. Por esta razn podra ser completamente casual y no fisiolgico el efecto
inhibitorio producido sobre la invertasa. Estudios posteriores (Isla y col. 1992) mostraron
que el inhibidor proteico de los tubrculos de papa se localiza en la pared celular, mientras
que la invertasa cida soluble se encuentra en la vacuola junto con su sustrato, la sacarosa.
En consecuencia, es prcticamente improbable que el inhibidor proteico sea un inhibidor
fisiolgico, in vivo, de la invertasa cida soluble. Sin embargo, la pared celular de los
tubrculos de papa contiene otra invertasa, la que nunca fue tomada en cuenta para la teora
de una posible funcin fisiolgica del inhibidor. Esta invertasa de pared tambin es inhibida
por el inhibidor proteico y por consiguiente, en tanto no se tengan ms datos, no puede
excluirse que esta enzima sea un posible blanco fisiolgico del inhibidor.
Este inhibidor de papa acta sobre otras invertasas de hojas, pero hay tambin invertasas
que nos inhibidas como puede verse en la tabla anterior.
Adems, se han encontrado inhibidores proteicos para las invertasas de batata, remolacha
comn y azucarera y maz.

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