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Estudio de la actividad enzimática de la enzima polifenoloxidasa del mango en la

oxidación del catecol.
Montserrat Granados, Minerva Valencia, Esteban Vega
Universidad Nacional Autónoma de México, Facultad de Química. Laboratorio Unificado de Fisicoquímica.
Prof. Dr. Luis Fernando Olguín Contreras.
ABSTRACT
The process of enzimatic browning is a problem that mainly affects the agro-food industry, that is
why it is necessary the understanding of the kinetic behavior of this phenomenon. In this work the
affinity constant between the poliphenoloxidase (PPO) and the catechol was estimated using the
Michaelis-Menten equation(MME) and lineweaver-Bruk equation(LBE), finding the numbers of
3mM (MME) and . Besides it was found that the maximm speed of the substrate (catechol)
conversion by the PPO is of 9.707E-8M. However, to distinguish the complete kinetic profile the
number of rechange is needed, which in this moment it is not possible to be determined.
RESUMEN
El proceso de pardeamiento enzimático es un problema que afecta principalmente a la industria
agroalimentaria por lo cual es necesaria la comprensión del comportamiento cinético de este
fenómeno. En éste estudio se calculó con la Ecuación de Michaelis-Menten la constante de
afinidad de la polifenoloxidasa (PPO) por catecol (KM), encontrando un valor=3.40mM. Además
se encontró que la velocidad máxima de conversión del sustrato (catecol) por la PPO es de
9.707E-8M. Sin embargo para dar un perfil cinetico completo se requiere del número de
recambio, por el momento aun no se puede calcular.

ANTECEDENTES
México es uno de los países que exporta frutos como limón, naranja, plátano, aguacate y mango
a diferentes sectores de comercio en el extranjero, estos cultivos representan el 63 por ciento de
la producción nacional, detalló el organismo de la Secretaría de Agricultura, Ganadería,
Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación (SAGARPA). Cabe señalar que nuestro país es el
principal proveedor de mango, aguacate y limón a Estados Unidos, ya que cubre más de dos
terceras partes de su cuota de importación. [1]
Un fruto a primera vista puede ser enjuiciado, por ejemplo si este ha adquirido una variación de
color y tonalidad en comparación con uno recién cosechado, dicho color es consecuencia de la
descomposición estructural de las células de las frutas que en lo siguiente conlleve a un aspecto
poco agradable al consumidor, signo de la disminución del aporte nutricional e inocuidad del
mismo.
La causante de éste fenómeno es la acción de la enzima polifenoloxidasa (PPO) conocida
también como monofenol monooxigenasa) es una enzima tetramérica que contiene cuatro
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átomos de cobre por molécula, y posee sitios de unión para compuestos aromáticos y oxígeno [3].
La enzima cataliza la O-hidroxilación de monofenoles para convertirlos en O-difenoles. Esta
misma enzima puede, posteriormente, catalizar la oxidación de los O-difenoles para formar Oquinonas las cuales son muy reactivas y atacan a una gran variedad de componentes celulares.
La rápida polimerización de las O-quinonas produce pigmentos de color negro, marrón o rojo, lo
que a su vez es la causa del pardeamiento enzimático. Existe una mezcla de las enzimas
monofenol y catecol oxidasa en prácticamente todos los tejidos vegetales, y también pueden ser
encontradas en bacterias, animales y hongos. Los polímeros producidos por la reacción de las
quinonas son los responsables del oscurecimiento de tejidos vegetales cuando se dañan
físicamente.
Esto se observa fácilmente en plátanos, papas o mangos que tienen altos niveles de PPOs.
Cuando las células vegetales se encuentran sanas e intactas, las PPOs y sus sustratos
fenolicos, se encuentran en compartimientos separados (cloroplastos y vacuolas,
respectivamente). Sin embargo, cuando la célula se desorganiza al envejecer, o como resultado
de daño físico o infeccioso, las enzimas y sustratos se juntan y sucede la reacción descrita. El
oscurecimiento producido por estas enzimas causa grandes pérdidas a la industria agropecuaria.
Por esto, el contenido de polifenoloxidasas, y su nivel de actividad son muy importantes para
determinar la calidad de frutos y vegetales. Se ha utilizado a la tentoxina en recientes
investigaciones para eliminar la actividad polifenoloxidasa en algunas plantas superiores. [5] La
tropolona es un inhibidor de las polifenoloxidasas presentes en las uvas. [6] Y otro inhibidor de
esta enzima es el pirosulfito de postasio (K 2S2O5). [7] La presencia de PPO se ha podido
determinar y caracterizar utilizando hojas y frutos de numerosas especies vegetales como fuente
enzimática. Los niveles de PPO varían dependiendo de la especie, estado de maduración y
estado fenologénico [8].
Uno de los principales fenoles presentes en los frutos es el Catecol, también conocido como
pirocatecol o 1,2-dihidroxibenceno, es un compuesto orgánico con la fórmula molecular C 6H6O2.
Es el isómero orto de los tres bencenodioles isoméricas. Fue descubierto por primera vez por
destilación destructiva de la catequina extracto de la planta. Cerca de 20 millones de kg están
sintéticamente producidas anualmente como química orgánica básica, principalmente como un
precursor de los plaguicidas, sabores y fragancias, como antioxidante en las industrias del
caucho, química, fotografía, colorantes, grasas y aceites, así como en cosméticos y en algunos
productos farmacéuticos.[9]

Fig. 1 Estructura del
catecol

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Sustancias Catecol Marca: Sigma Aldrich Pureza: 99% F. 136.09 Lote: k26462 Presentación 500g Fosfato de potasio dibásico No presenta información Equipos Balanza Analítica Espectrofotómetro Marca: Thermo Scientific Modelo: Genesys 10S UV-Vis No. químicas y bioquímicas del fruto ya que.Baker Pureza: 99% F. De Serie: 840-20810 Centrifuga 3 | Página . 110. En el presente estudio de investigación se establecieron las condiciones de mayor velocidad de reacción de la PPO presente en el fruto del mango. dichas características se verán afectadas dependiendo de la fuente de donde es extraída la PPO.Para poder identificar la cinética de reacción de la PPO presente en el fruto del mango frente al catecol es necesario determinar sus características físicas.W.W.11 Presentación 100g Fosfato de potasio monobásico Marca: J.T. para evaluar el tiempo óptimo con el cual este producto puede ser exportado y vendido con cierta calidad al consumidor. MATERIALES Y MÉTODOS.

y posteriormente se añadieron 20 mL de agua destilada. Llevando un registro de su apariencia en el intervalo de conservación del mango.6 mg 1000 mL 1 mmol 139. Trasvasar a un matraz volumétrico de 25. sin marcas aparentes por golpes o por exposición al sol. o Disolución amortiguadora de fosfatos 0.0 mL y llevar al aforo con agua destilada. × C catecol= 0. pues después de un día ésta se oxida.La reaccion a estudiar es: Análisis preliminares: 1. o Volumen de pulpa: se midieron 60 mL. o Fecha de obtención: Los mangos analizados fueron adquiridos un día antes. o Coloración inicial y final: el extracto al inicio es un poco turbio. . Preparación de disoluciones.056 mM 25 mL Nota: si el trabajo experimental requiere de más de una sesión la disolución deberá ser fresca. Se estandarizará detalladamente el estado del fruto de mango a través del análisis de los siguientes parámetros: o Especie: mango manila.1 mg × =137.1 M. 2.5 M con fuerza iónica 0. con el paso de los días la turbidez en el extracto aumenta. o Disolución 0.05 M de Catecol Pesar 0. Características físicas de mango para análisis. ya que este servirá como parámetro de análisis de calidad en el mango.05 mmol 110.1 mg =0. 25 mL . o Apariencia inicial y final: Se obtendrán mangos con apariencia agradable.1376 g en balanza analítica y transferir cuantitativamente a un vaso de precipitados de 50 mL disolver en la mínima cantidad de agua destilada.

2. agregar volúmenes de catecol diferentes. Preparar otros 3 tubos de ensaye pero ahora adicione 2 . Esperar aproximadamente 2 min. Evaluación cualitativa de la presencia de PPO en la pulpa del mango manila o Lave y seque perfectamente el fruto. FI = +¿ 1 2 c i Zi ∑ 2 2 K ( +1 ) + c HPO (−2 ) 2 −2 4 2 −¿ H 2 PO 4 (−1 ) + c¿ c¿ 1 F I= ¿ 2 FI = 1 [ 0. Una vez transcurrido el tiempo deseche la parte sólida y vierta la fase liquida en un vaso de precipitados de 50 mL.5× 3 (+1 )2 +0. para asegurar una mezcla homogénea y la ruptura de la mayor cantidad de vacuolas. A 17000 rpm. retire la cáscara y con ayuda de una espátula retire la mayor cantidad de pulpa.4 y 6 mL a cada tubo de ensayo.Pesar 4. de extracto en 3 tubos de ensayo.0 mL y llevar al aforo con agua destilada. o En tubos Eppendorf colocar porciones iguales de la pulpa para posteriormente introducirlo en la centrífuga por 30 min.5 ( 1 ) +0. recolecte el extracto en un vaso de precipitados de 100 mL. repita el procedimiento mínimo 5 veces. Fig. Trasvasar a un matraz volumétrico de 100.1 Pulpa de mango centrifugada o Una vez obtenido el extracto colocar aproximadamente 5 mL. o Introducir la pulpa obtenida en el extractor de jugos y añadir aproximadamente 20 mL de agua destilada.5 ( 4 ) ]=2 2 3.402 g de KH2PO4 en balanza analítica y transferir cuantitativamente a un vaso de precipitados de 50 mL disolver en la mínima cantidad de agua destilada.3545 g de K2HPO4 y 3.

5. Fig. por lo que se deben realizar unos barridos cinéticos.5 mL 1mL 2. o Si se observa un cambio en la coloración. Volúmenes en mL utilizados en barridos cinéticos Extracto de Mango Catecol Agua Buffer Vol.5 mL 0.2 Coloración del jugo según la oxidación de Catecol 4.5 mL 1.7mL 1mL 2.1 mL 1mL 2.5 mL 08 mL 0. final 0mL 0.5 mL 0. de amarillo a marrón significa que la enzima está presente y se puede realizar la siguiente prueba. donde el método tendrá mayor sensibilidad y es la longitud de onda a la que se eligió trabajar.mL. verter las alícuotas en una celda para espectrofotómetro y medir absorbancias de 350nm700nm. según las siguientes condiciones.9 mL 1mL 2. de amortiguador. Comportamiento de presencia y ausencia de concentraciones de sustrato .5 mL 1.5 mL 1. la concentración del amortiguador es 10 veces mayor para asegurar un pH=7.2mL 0.5 mL 0.0. Tabla 1.4mL 0.6 mL 0.5 mL 0.5mL Los gráficos obtenidos nos permitirán ver un máximo de absorción.3 mL 1mL 2.5mL . Estandarización de parámetros de medición ideal en espectrofotómetro Se debe seleccionar la longitud de onda más adecuada para realizar las mediciones posteriores. tomar el volumen indicado en la tabla.

5 2. Volúmenes en mL utilizados en espectrofotometría Enzima (mL) Buffer (mL) Agua (mL) Catecol (mL) Volumen final (mL) 0.5 1 2. Se prepararán las siguientes disoluciones (tabla 2) en una celda de plástico para espectrofotómetro marca Thermo. En base a eso calcular los volúmenes necesarios de cada disolución para tener un total de 2.7 0.7 2.3 0.3 2.1 0. Utilice el modelo de Michaelis-Menten para calcular la cinética de esta reacción. Basándonos en el estado estacionario del complejo enzima-sustrato se deduce la Ecuación de Michaelís—Menten .5 1 2. el t 0 se considera como la adición de catecol. (Nótese que lo que se busca variar es la concentración de catecol presente en la disolución).5 1 2.5 0.5 1 1. transformando la absorbancia en concentración con la ecuación de Lambert-Beer Calculo de la concentración de O-Quinona en Celda Para el cálculo de la concentración de O-Quinona se hace referencia a la relación existente entre la concentración del analito (O-Quinona) y la absorbancia en el equipo espectrofotométrico tal relación está regida por la ley de Lamber-Beer denotada en la siguiente ecuación A=εlc Donde o ε= Coeficiente de absortividad molar (13.5 Trazar las gráficas concentración vs tiempo. manteniendo el volumen de buffer en 0.5 0.00 cm-1mM-1 para la O-Quinona) o L=paso óptico de celda (1 cm) o C=Concentración del analito (O-Quinona)    Elegir en base a estas la concentración ideal de acuerdo a la mayor absorbancia observada para la siguiente parte de la cinética.5 0.5 mL en cada celda.5 1 1.5 1 1.9 0.5 0 2.5 1 2.5 0.5 0.1 2. considere también que el volumen de enzima debe ser la misma para todos los casos.5 mL en cada caso. Muestra Blanco 1 2 3 4 5  Tabla 2.

9 0.0 1.5 Se realizó un gráfico de tiempo vs.7 0.5 2.5 1.2 0.5 2. Estandarización de parámetros de medición ideal en espectrofotómetro .5 0.6 0. Absorbancia para observar el comportamiento de la enzima.5 Volumen total (mL) 2.0 1.0 1. Volúmenes en mL utilizados en espectrofotometría Muestra Blanco 1 2 3 4 5   Catecol (mL) 0.v= V max ( S ) Km+ (S ) Donde o o o o V es la velocidad de conversión de la enzima Vmax es la velocidad máxima de conversión de la enzima Km es la constante de afinidad de la enzima por el sustrato S es la concentración de Sustrato. Dobles recíprocos Realizando un intercambio de orden en la ecuación de Michaelis-Menten se tiene la siguiente ecuación con un comportamiento lineal KM 1 1 = + v V max ( S ) V max 6.5 2. DISCUSIÓN Y RESULTADOS 1.3 1.4 0.5 0. De estas mediciones también se puede obtener la actividad específica enzimática.5 2.0 1.0 0.5 0.0 Enzima (mL) 0.8 1.5 0.5 2.1 0.0 1. Comportamiento de presencia y ausencia de concentraciones de enzima Tabla 3. según el día de extracción del jugo.5 0.5 Buffer (mL) 1.0 Agua (mL) 1.

.

.

Comportamiento de presencia y ausencia de concentraciones de enzima .2.

.

.

.

.

Actividad de la enzima .3.

.

Tratamiento de los resultados .4.

.

Al observar un cambio de coloración aparente en las pruebas cualitativas de Catecol en presencia de extracto de jugo. así como del Catecol en presencia del extracto se observa que las tres muestras no presentan una absorbancia considerable en la zona de mayor absorbancia de la O-Quinona. Del Catecol. por lo cual la longitud de onda seleccionada para esta fue de 390 nm. Prueba de la presencia de PPO en la pulpa de mango. Barrido de longitudes de onda Con base en los resultados del barrido de longitud de onda del amortiguador de fosfatos del extracto de pulpa. se obtuvo información de la presencia de la enzima PPO en la pulpa de mango. y la permanencia en el Catecol sin extracto de jugo.  Tipos de mango Con base en los perfiles cinéticos de la conversión de Catecol en O-Quinona para los diferentes mangos se puede afirmar que para mangos verdes o inmaduros la enzima PPO del mago no .

por lo cual. los polifenoles presentes en su composición tales como el Catecol pueden ser oxidados por esta enzima. CONCLUSIÓN Se logró observar la oxidación de Catecol a O-quinona gracias a la presencia de la enzima PPOen la pulpa del mango. propio de las enzimas.3999E-7 mM/s para la ecuación de Michaels – Menten y para la curva lineal de Km de 0.gob.01082mM y Vmax de 1. Así al realizar las regresiones de curva hiperbólica y de regresión lineal para las ecuaciones de Michaels mente y de la curva de dobles recíprocos respectivamente se puede observar que las Km y las Vmax son similares.aspx [2] http://www. lo cual es consistente con los perfiles de las ecuaciones de Michaels Menten y de Los doble recíprocos.htm . primeramente al realizar el análisis el mismo día de obtención se obtiene un perfil como el de la gráfica en donde se puede observar la actividad de la enzima al pasar el tiempo. así mismo.org/docrep/006/Y4893S/y4893s08. REFERENCIAS [1] http://www.está activa. Esto se puede deber además a los diferentes tipos de extracción de la enzima con el extractor de jugo y la licuadora ya que al molerlo más se liberan de las vacuolas celulares de los cloroplastos.84E-7 mM/s esto puede deberse a que los puntos de mayor concentración de Catecol fueron eliminados del estadístico de regresión lineal al encontrarse fuera de esta tendencia lineal. los valores de . por lo que e necesario romper estas estructuras para acceder a la enzima.843 nos indican que la enzima convierte fácilmente el Catecol en O-Quinona al ser de rápida evolución dicha transformación. al observarse el perfil recto hiperbólico característico. por una parte de tiene un valor de Km de 0.sagarpa.0861 mM de Km y Vmax= 5. y finalmente realizando el análisis 5 días después de su obtención la enzima posee mayor actividad enzimática.  Absorbancia de O-Quinonas con diferentes concentraciones de Catecol Con base en los resultados de C vs t se puede deducir que a mayores concentraciones de sustrato.fao.  Perfiles cinéticos de Michaels-Menten y recíprocos Como se puede observar el perfil cinético de la oxidación del Catecol con la PPO del mango sigue un comportamiento de Michaels –Menten.086 mM y Vmax de 5.mx/Paginas/default. convirtiendo más Catecol en menor tiempo. a diferencia de esta actividad cuando se tiene mangos maduros que al ser extraída tiene actividad. la enzima trabaja más rápido -pendientes de cada grafica-. la enzima sigue un perfil cinético tipo Michaels – Menten.

[6]Time-dependent inhibition of grape polyphenol oxidase by tropolone.et.com/TY/default. 36 [14] Prieto H.x. p 109 [12] http://es. Giaccio M (May 1997).1017/S0953756296003206. ESTUDIO DE LA LOCALIZACIÓN SUBCELULAR DE POLIFENOL OXIDASA DE Annona cherimola MEDIANTE LA EXPRESIÓN TRANSITORIA DE CONSTRUCTOS CON LA PROTEÍNA GFP.1399-3054.com/articulos-informativos/article_76258. Mycological Research 101 (5): 552–556.Facultad de Ciencias Químicas y Farmaceúticas. Universidad Veracruzana. Accessed 13 September 2011 [4] Sugumaran M. Trends in Food Science & Technology. R. O.(2003)..1982.1016/0014-5793(83)80210-5. Universidad de Alicante. Physiologia Plantarum 54 (4): 381–385. . Veracruz México [11] Guerrero L. «Lack of involvement of polyphenol oxidase in orthohydroxylation of phenolic compounds in mung bean seedlings». doi:10. 1991. pp 1043–1046. «Content of phenolic substances in basidiomycetes». Purificación y caracterización cinética de la polifenoloxidasa del tomate. Instituto Politécnico Nacional. Romeoa F. y Martin-Belloso. Ramon Varon and Francisco Garcia-Carmona. España p. (2009)Acciónn y efectos de la Polifenoloxidasaa en alimentos.net/jaimevalls/enzimas-polifenoloxidasa-9826854 [13]Juan C. FEBS Letters 155 (1): 65–68. Lipke H (May 1983).tb00696.slideshare. New advances in extending the shelf life of fresh-cut fruits: a review. [9] http://campodocs. «Quinone methide formation from 4-alkylcatechols: a novel reaction catalyzed by cuticular polyphenol oxidase». 39 (6). Edelmira Valero. C.1021/jf00006a007 [7] Del Signore A. Agric. doi 10.html [10] Hernández C.worthington-biochem. J.html Polyphenol Oxidase . Food Chem.Escuela Nacional de Ciencias biológicas. Universidad de Chile. México. Facultad de ciencias químicas. (2009) EFECTO DE LA PRESENCIA DE FENANTRENO SOBRE LA EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS Y LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA RADICAL DE CYPERUS HERMAPHRODITUS.1111/j.[3] http://www. al. [8] Soliva-Fortuny.Worthington Enzyme Manual. Manuela Garcia-Moreno. doi:10. 14:341-353. doi:10. Santiago de Chile. Vaughn KC (April 1982). [5] Duke SO.