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Saccharomyces cerevisiae “ Beer is proof that God loves us and wants us to be

Saccharomyces cerevisiae “Beer is proof that God loves us and wants us to be happy.” Benjamin Franklin

En algún momento entre 10.000 y 15.000 años atrás, un granjero en la mesopotamia (Irak) descubrió que el agua donde había dejado sus granos en remojo tenía un gusto raro. Al otro día se despertó habiendo realizado dos importantes descubrimientos:

- Cerveza

- Resaca

Los registros escritos más antiguos donde se habla de la producción de cerveza provienen de Sumeria hace 6.000 años. Las primeras recetas de pan levado son egipcias y datan de hace 5.000 años. Antes de eso, el pan era duro y seco. El pan hecho con levadura, en comparación era maravilloso, liviano y sobre todo, muy rico. El secreto?

Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae es un eucariota

Hongo, ascomicete

Unicelular pero puede formar pseudohifas

S. cerevisiae se divide por gemación (budding de ahí:

budding yeast)

Budding resulta en dos células de tamaño diferente, la madre (célula vieja) y la hija (célula nueva)

El número de divisiones no es in nito; las células madre envejecen y dejan de dividirse luego de 30-40 divisiones

La levadura tiene:

Pared celular, de glucanos, mananos y proteínas

Membrana plasmática

Núcleo con nucleolo

Aparato secretorio completo: ER, Golgi, etc.

Vacuola, como organela de almacenamiento e

hidrólisis

Peroxisomas

Mitocondria

   hidrólisis    Peroxisomas    Mitocondria Una levadura es alrededor de 4-7 µ

Una levadura es alrededor de 4-7µm largo

Genética en S.cerevisiae

S. cerevisiae posee 16 cromosomas nucleares Además, posee el genoma mitocondrial y un plásmido, el círculo de 2 micrones. Cada cromosoma posee centrómero y telómeros. El genoma haploide posee ~12 MB y se terminó de secuenciar en 1996 (el primer genoma eucariota secuenciado)

y telómeros. El genoma haploide posee ~12 MB y se terminó de secuenciar en 1996 (el
y telómeros. El genoma haploide posee ~12 MB y se terminó de secuenciar en 1996 (el
y telómeros. El genoma haploide posee ~12 MB y se terminó de secuenciar en 1996 (el
y telómeros. El genoma haploide posee ~12 MB y se terminó de secuenciar en 1996 (el

S.cerevisiae / Sch. Pombe

 

S.cerevisiae

Sch. pombe

 

Célula

 

cilíndrica

 

Elipsoide de revolución 5x4x4 µm

Elipsoide de revolución 5x4x4 µ m

(n)

(2n)

8-15

13-23

x 4 µm “

x 5

x 4 µ m “ x 5

Pared celular

Glucanos ( β1-3, 1-6), manan- proteina,quitina

 

Tamaño genoma (Mb)

12

13.8

N.Cromosomas

16

3

N° genes

6,034

4,824

 

Genes con intrones

5%

43%

Gen

1.5 Kb-1 exón

3 Kb- 3 exones

 

¿Por qué S.cerevisiae es un buen sistema modelo de biología celular y molecular?

Unicelular Funciones celulares conservadas (Yeast Human): complementacion interespecífica Cada célula es todo el organismo (a diferencia de los cultivos de células de mamíferos) Tamaño adecuado (diámetro ~5 µm) para microscopía de luz visible

Fácil de cultivar:

Medios sintéticos controlables Crece rápido (tiempo de duplicación 90 minutos): los experimentos son rápidos Se puede producir gran cantidad de biomasa

Manipulación genética fácil y desarrollada:

ciclos estables haploides y diploides fácil de transformar fácil de obtener mutantes y de clonar los genes mutados muy alta eficiencia de recombinación homóloga: knock-outs, knock-ins, mutagénesis dirigida, etc. Enorme disponibilidad de recursos y técnicas

Genoma secuenciado (1996) y compacto:

~12 10 6 pares de bases, con ~6000 genes ~5% genes con intrones Promotores cortos! Entre 200 y 1000 pb (el más largo es el del gen FLO11, que es de 2.8 kb).

Bioquímica muy desarrollada.

S.cerevisiae en el árbol de los eucariotas

S.cerevisiae
S.cerevisiae

P.falciparum (agente de la malaria)

A.thaliana

D.discoideum

H.sapiens

D.melanogaster

C.elegans

T.cruzi (agente del chagas)

S.pombe

Archaebacteria

Bacteria

Baldauf, Science 2003 Este árbol está basado en un consenso a partir de datos moleculares y ultraestructurales

Similitud entre funciones básicas en levaduras y en eucariotas “superiores”

Caminos biosintéticos y catabólicos, y su regulación Biosíntesis y degradación de organelas Ciclo celular y división celular Replicación del ADN, recombinación y reparación Regulación transcripcional y activación Caminos de transducción de señales: receptores acoplados a proteína G, cascadas de MAP kinasas, PKCs, IP 3 , Ca +2 , cAMP, etc. Secreción y endocitosis Efectos regulatorios mediados por estructura de la cromatina:

silenciamiento, epigenética Priones Respuestas al estrés

El ciclo de vida de S.cerevisiae

ASCO
ASCO

Sexo/MATING en S.cerevisiae

a

factor a

factor α

α

Arresto en G1 (START)

Cigota

a/ α

Sexo en S.cerevisiae (cont)

adhesión

fusión

fusión

nuclear

Sexo en S.cerevisiae (cont) adhesión fusión fusión nuclear Nolan et al, MBC 2006

Nolan et al, MBC 2006

Determinación genética del tipo sexual en S.cerevisiae

El tipo sexual está determinado por qué alelo se expresa en el locus MAT (mating type) ubicado en el cromosoma III

El locus MAT codifica factores de transcripción, o sea, proteínas cuya función es la de controlar la expresión de otros genes.

El MATa codifica al activador transcripcional a1 y a la proteína de función desconocida a2.

El MATalfa cofica al activador α1 y al represor α2

El locus MAT funciona como un regulador maestro controlando la expresión de muchos genes.

α 2 •   El locus MAT funciona como un regulador maestro controlando la expresión de

Chr III

Chr III

factor a a α factor α Arresto en G1 (START)
factor a
a
α
factor α
Arresto en G1
(START)

Expresión génica que determina el tipo sexual

Cigota

a/ α

factor a a α factor α Arresto en G1 (START) Expresión génica que determina el tipo

El material genético

Posee alrededor de 6200 genes, pero la anotación todavia continúa.

Debido a una duplicación ancestral del genoma, muchos de los genes poseen una copia muy parecida, en algunos casos con aparentemente la misma función, en otros claramente cada copia se especializó.

Sólo un muy pequeño número de genes posee intrones. Sin embargo, aproximadamente el 50% de los mRNAs sufree splicing… Eso es porque los genes con intrones resulta que son genes que se expresan mucho: la mayoría de los genes de proteínas ribosomales tiene intrones.

Análisis “completo” del organismo

En un esfuerzo conjunto de la comunidad de S.cerevisiae, se pretende determinar la función de todos y cada uno de los genes.

Para esto hay multiples proyectos y varios ”approaches” diferentes:

Análisis por microarrays para determinar el patrón de expresión de todos los genes en múltiples condiciones experimentales o para determinar todos los sitios de unión en el genoma de todos los factores de transcripción

Colecciones genómicas completas disponibles para la investigación:

de mutantes de deleción de cada uno de los genes de fusiones C-terminales con GFP a cada gen para estudios de localización de fusiones C-terminales con epítopes para purificación

Varios métodos para analizar el fenotipo y mecanismo de acción de mutantes

Diferentes proyectos de determinación de interacciones proteína-proteína: 2-híbridos,

espectroscopía de masa, interacciones genéticas.

Nomenclatura en S.cerevisiae

Los genes se nombran con 3 letras seguidos de hasta 3 números:

CDC28, HSP12, ACT1, STE5…A veces el nombre es una abreviatura, a veces no Genes wild type se escriben en mayúscula e itálica

Mutantes recesivos se escriben en minúscula itálica: tps1, rho1, cdc28

El producto del gen, la proteína, se designa con mayúscula la primera letra sólamente, y sin

Alelos mutantes se designan con un guión seguido de un número: tps1-1, rho1-23, cdc28-2

Si la mutación fue construida por deleción, esto se designa y se incluye el marcador de

selección usado para la deleción: ste5Δ::HIS3

itálica (a veces se agrega una ”p” luego del nombre: Tps1p, Rho1p, Cdc28p Los genes de los que lo único que se conoce es la secuencias se nombran con un código

que habla de su ubicación en el genoma:YDR518C, YML016W

,

donde:

Y es por ”yeast”

La segunda letra corresponde al cromosoma (D=IV, M=XIII

)

L o R es por el brazo cromosómico “left” o “right” (el cromosoma se pone con su brazo

corto a la izquierda) El número de 3 dígitos corresponde al número de ORF contando desde el centrómero

C o W corresponde a ”Crick” o ”Watson”, indicando la cadena superior o inferior, respectivamente

Algunos genes especiales no siguen esta nomenclatura: HO, MATa, MATα

Marcadores genéticos y cepas

Los marcadores genéticos se utilizan (entre otras cosas) para:

1-seleccionar diploides (las cepas haploides deben llevar distintos marcadores)

2-seguir cromosomas cuando uno hace cruces genéticos

3-seleccionar cepas transformadas con plásmidos o integraciones de genes en el genoma

Los marcadores más utilizados son: HIS3, URA3, TRP1, LEU2, LYS2, ADE2

ADE2 es especialmente útil porque la mutación ade2 hace que las cepas se pongan rojas en medio con baja adenina

URA3 es especialmente útil porque se puede “contra-seleccionar”: matar a aquellas células que poseen el gen normal (wild-type).

También se usan marcadores que confieren resistencia a antibióticos:

Resistencia a G418 (neomicina), kanR; resistencia a higromicina, hygB

Una de las cepas más comunes es la W303, cuyo genotipo se escribe así:

MATa leu2-3/112 ura3-1 trp1-1 his3-11/15 ade2-1 can1-100

De cómo hacer trabajar a la genética para uno: más genes…

1-Generación de mutantes por:

a.Mutagénesis al azar b.Mutagénesis dirigida c.Deleción dirigida

2-Métodos para aislar el gen mutado: clonado por complementación 3-Métodos para estudiar al gen de interés:

a.Reporteros transcripcionales b.Reporteros de localización y nivel intracelular c.Fusión a epítopes para purificación (TAP tag)

2-Cómo usar la genética para:

a.Dado un gen involucrado en un proceso de interés, aislar otros genes que codifiquen para proteínas involucradas en este u otro proceso celular paralelo o relacionado.

b.Organizar el modo de acción de varios genes involucrados en un mismo proceso, por ejemplo, transducción de una señal. Supresores multicopia Mutaciones supresoras Interacciones sintéticas entre genes Doble híbrido