Aislamiento del ADN de una cebolla.

Fundamentos de microbiologa.
Resumen
En la industria es necesario que se utilicen de procesos biolgicos dados por
microorganismos y donde se empleen biomolculas de gran inters. En la prctica se realiz
la extraccin de ADN+ARN de clula vegetal de una cebolla, lo cual se permiti entender los
procedimientos para su debida obtencin, observndose una interfaz en forma de burbuja
incoloras insolubles en etanol. Luego se caracterizaron dos tipos de microorganismos como
E. Coli y Saccharomyces Cerevisiae segn su estructura en la pared celular por medio de la
coloracin de Gram donde se determin que una es Gram positiva y la otra Gram negativa,
respectivamente. Por ltimo, se realizaron dos siembras por agotamiento con los
microorganismos anteriormente mencionados y dos siembras masivas con saliva humana,
cada una en agar nutritivo.

Objetivos
o Conocer el fundamento y los procedimientos requeridos para el aislamiento de los
cidos nucleicos (ADN +ARN) del tejido vegetal de una cebolla.
o Realizar una coloracin de Gram de un cultivo bacteriano y de hongos en medio
slido para determinar su morfologa.
o Realizar una siembra por diferentes tcnicas.
1. Introduccin
La aplicacin de procedimientos con el fin de poner al descubierto las molculas de ADN
para este caso de una cebolla y reconocer la importancia de los procesos de extraccin y
aislamiento como parte esencial en la descripcin del genoma, representan el punto de
partida para numerosas aplicaciones en el campo de la investigacin y en la industria en la
elaboracin de nuevos productos y en la innovacin. Tcnicas sencillas como la extraccin la
cual comprende el rompimiento mecnico de tejido, la degradacin de las membranas
lipdicas con el uso de detergentes, filtracin, y principios de solubilidad permiten hacer un
acercamiento a la informacin contenida en las clulas y de esta forma determinar
caractersticas como tamao, forma, funcin entre otras.
Por otro lado, la biodiversidad requiere de tcnicas de identificacin y caracterizacin que
permiten hacer la distincin en cuanto a gnero y especie de microorganismos y de esta
manera conocer su morfologa, metabolismo entre otras propiedades que puedan ser
aprovechadas en diferentes campos y finalidades.

1.1 Marco Terico

1.1.1 ADN
El ADN es la abreviatura del cido desoxirribonucleico, es el componente qumico primario de
los cromosomas y el material del que los genes estn formados. Fue identificado por primera
vez en el ao de 1868 por un bilogo suizo llamado Friedrich Miescher.
Segn Curtis [1] El ADN es un polmero de alto peso molecular formado por dos cadenas o
hebras de monmeros llamados nucletidos. Cada nucletido est conformado por molculas
ms pequeas: una base nitrogenada (adenina, guanina, citosina o timina), un hidrato de
carbono (desoxirribosa) y un grupo fosfato; adems contiene toda la informacin necesaria
para dirigir numerosos procesos tales como las sntesis de protenas y la duplicacin.
1.1.2 Tincin de Gram
Esta tincin desarrollada por el doctor Christian Gram en 1884, es la ms utilizada en los
laboratorios de bacteriologa y permite, de acuerdo con la estructura y grosor de la pared
bacteriana, agrupar las bacterias en Gram positivas y Gram negativas. Las Gram positivas
poseen una capa gruesa de peptidoglican y carecen de membrana externa, mientras que las
Gram negativas tienen una capa ms delgada de peptidoglican y poseen una membrana
externa. [2]
En trminos generales la tincin de Gram involucra varios pasos:
* Tincin inicial: las clulas se tien con cristal violeta, el cual es el colorante primario, en
este caso todas las clulas se tien de morado.
* Mordente: Se adiciona yoduro (Lugol) que reacciona con el cristal violeta formando un
complejo que se adhiere a la capa de peptidoglican.
* Decoloracin: se adiciona un solvente no polar el cual acta lavando el complejo de las
clulas Gram negativas. De esta manera la bacterias Gram positivas se mantienen moradas
mientras las Gram negativas se decoloran.
* Contratincin: se vuelve a teir con safranina o fucsina de manera que las bacterias Gram
negativas se tien de rosado a fucsia segn el colorante empleado.
1.1.3 Mtodos de siembra
El mtodo de siembra a emplear tal como lo describe Gonzales [3] depender de los objetivos
que se pretendan alcanzar con el cultivo, ya que en ocasiones se requiere que el desarrollo
del microorganismo se produzca de forma masiva, mientras que en otras resulta
indispensables que las colonias queden aisladas o que las manifestaciones del metabolismo
tengan lugar con tensiones reducidas o privadas de oxgeno, los mtodos de siembra ms
empleados son los siguientes:

Siembra por estras: Este mtodo de siembra se realiza sobre la superficie de los medios de
cultivo slidos distribuidos en placas de "Petry" o en tubos de ensayo solidificados en forma
de cua. (Slam)
Siembra masiva: Cuando se desea realizar una siembra masiva se puede utilizar la esptula
de Driglaski. En este caso la gota de muestra liquida se esparce con la esptula por toda la
superficie del medio de cultivo slido imprimiendo un movimiento en espiral. La siembra
masiva tambin se puede realizar con un hisopo grueso embebido de un cultivo lquido,
procediendo a su deslizamiento sobre toda la superficie de una placa de agar. [3]
Con independencia del tipo de medio y el mtodo de siembra a emplear sta debe realizarse
en las proximidades de la llama del mechero y a que el calor emanado reduce el nmero de
microorganismos presentes en sus inmediaciones, lo cual es utilizado como un recurso a favor
del proceder asptico.

2. Resultados y anlisis
2.1 Extraccin de ADN
El uso del detergente en solucin y la sal disuelven la grasa, la cual es el componente
principal de la membrana plasmtica y nuclear, al romperse las membranas se libera el ADN
hacia el exterior. A su vez la mezcla de sal y detergente disminuyen la solubilidad de las
protenas, desnaturalizndolas ocasionando la precipitacin y la separacin de las molculas
de ADN; adems, la adiccin de calor contribuye en la desnaturalizacin de protenas en
especial las adenasas, las cuales podran degradar el material gentico. El bao con hielo es
indispensable puesto que impide el dao de los cidos nucleicos por causa del aumento de
la temperatura. [4]

Figura 1. Extraccin de
ADN

El licuado secciona las clulas en, en este punto es importante

controlar el tiempo ya que si es demasiado pueden seccionarse las
cadenas de ADN, Seguidamente la filtracin permite separar los
fragmentos de la clula, los cuales se retienen en el papel filtro
quedando en la solucin el ADN y las protenas, estas ltimas, se
rompen cuando se adiciona la enzima proteasa.

Finalmente el etanol frio contribuye a que el ADN insoluble en el

solvente empiece a suspenderse mientras que otras protenas y
compuestos quedan en solucin. Existen otros procesos que permiten
obtener de manera ms eficiente el ADN.
Quesada [5] propone un procedimiento de separacin de las fases, el
cual consiste en homogenizar la muestra usando hidrxido de sodio
(NaOH) y sodio duodecilfosfato (SDS), este tratamiento favorece la
ruptura de la pared celular y la membrana adems de contribuir a la
desnaturalizacin de las protenas. Con el fin de liberar el ADN la autora
sugiere usar agentes desnaturalizantes como el perclorato de sodio y
la mezcla de cloroformo y alcohol isoamilico.
Despus de
agregar los agentes
desnaturalizantes, se centrifuga la solucin se obtiene dos fases: una orgnica y una acuosa,
separadas por una interfase de protenas desnaturalizadas, en la fase acuosa se encontrara
el ADN. La mezcla de cloroformo y alcohol aumenta la separacin de las fases. El ADN en
fase acuosa se recupera por precipitacin y luego se disuelve en disolucin salina para
poder ser almacenado.
La extraccin de ADN es de gran importancia en el campo de los bioprocesos y la
biotecnologa en cuanto estudio de las causas genticas de las enfermedades, para el
desarrollo de diagnsticos y medicamentos, produccin de alimentos, etc... Tambin es
esencial para la realizacin de la ciencia forense, la secuenciacin de genomas, la deteccin
de bacterias y virus en el medio ambiente y para la determinacin de la paternidad. Muchas
aplicaciones prcticas adicionales de ADN se encuentran en la industria, agricultura y la
bioingeniera. Un ejemplo de la aplicacin en bioprocesos es la utilizacin del ADN extrado de
diferente microorganismos con el fin de ser mezclado y de esta manera obtener un producto
con caractersticas de ms complejas y funciones de vital importancia tal como es el caso de
la insulina humana. [6]
2.2 Caractersticas morfolgicas (Tincin de Gram)

Figura 3. E. Coli

Figura 2. Levadura
Saccharomyces cerevisiae

El mtodo de tincin de Gram permiti evidenciar el tipo de bacterias gracias a la coloracin

obtenida en cada uno de los procedimientos. Tal como se muestra en la figura 2, pequeos
bacilos de coloracin fucsia hacen referencia a una bacteria Gram negativa (capa de
peptidoglicano delgada) que corresponde a Escherichia Coli una bacteria anaerobia
facultativa comnmente usada en fermentacin de carbohidratos en condiciones anaerobias.
Por otro lado la figura 3 muestra una coloracin azul violeta correspondiente a un
microorganismo que dependiendo de la composicin de la pared celular puede ser llamado
Gram positivo (capa de pptidoglicano gruesa) que para el caso se trata de levadura
(Saccharomyces Cerevisiae) la cual es capaz de crecer de forma anaerobia realizando
fermentacin alcohlica. [7].
Cavallini [2] Habla sobre los factores de confiabilidad del mtodo los cuales radican en
prestar atencin a los lavados que se realizan al ir agregando los diferentes reactivos, si se
deja un exceso de agua los reactivos se diluirn. Adems, la excesiva decoloracin puede
influir a que las bacterias gran positivas se vean parcial o totalmente rosadas, pudiendo ser
causa de clulas viejas que tienden a perder su capacidad de retener el complejo cristal
violeta. Otro factor de variabilidad podra ser el estrs durante el cultivo los cuales generan
formas Gram negativas no viables.
La observacin al microscopio ptico con distintas coloraciones y de los cultivos bacterianos,
tienen un rol importante en la identificacin de los microorganismos y su ubicacin
taxonmica. A su vez, la clasificacin y caracterizacin de los microorganismos es de suma
importancia en el campo de los bioprocesos, microbiologa ambiental, industrial, mdica y
agrcola, entre otros campos. Pirez [8] Dice En las ltimas dcadas se han hecho importantes
avances en el estudio de la estructura de los microorganismos, logrndose una identificacin
bioqumica de muchas fracciones celulares. El conocimiento de las diferentes estructuras y
composicin ha permitido comprender como muchos microorganismos se relacionan con el
hombre. El descubrimiento de muchas estructuras bien identificadas, permiti el desarrollo de
vacunas que han sido verdaderos avances en la medicina de los ltimos aos. [8]. El
conocimiento de la composicin bioqumica de las diferentes estructuras de microorganismos,
junto al conocimiento del metabolismo, permite hoy la comprensin del mecanismo de accin
de los diferentes antibiticos, vitaminas, enzimas, aminocidos, cidos orgnicos, etc. Es aqu

donde radica la importancia en los bioprocesos en conocer como los microorganismos

asimilan, regulan, producen, transforman, degradan, resisten, clasifican, entre otras funciones,
para poder aprovechar bien sea el microorganismo totalmente, algn componente importante
en su metabolismo, o simplemente una parte de su ADN con el fin de obtener algn producto
con valor agregado.
2.3 Siembra en diferentes tcnicas
A continuacin se muestra los diferentes tipos de cultivo, medio y tcnicas de siembra usadas.
Tabla 1. Muestras de microorganismos en diferentes medios de cultivo

Muestra

Caja de Petri 1
E-Coli en agar
nutritivo-Siembra
por estra

Caja de Petri 2
Levadura en agar
nutritivo-Siembra
por estra

Caja de Petri 3
Saliva en agar
nutritivo-Siembra
masiva

Resultados
Se observa una coloracin
blanca sobre superficie del
agar nutritivo en la caja de
Petri, en donde se observa
agotamiento
del
microorganismo
en
cada
terminacin. La forma de la
colonia es granular y su
margen es lisa.

En esta siembra no se dio

ningn
crecimiento
microbiano, esto debido a una
mala manipulacin del asa,
ya que el agar se observa con
fisuras, lo cual impide el
crecimiento
del
microorganismo.
La muestra a sembrar fue
sacada de las paredes de la
boca de un estudiante. El
crecimiento
del
microorganismo se da de
forma granular con bordes
lisos.

Imagen

Caja de Petri 4
Saliva en agar
nutritivo-Siembra
masiva

La muestra a sembrar fue

sacada de las paredes de la
boca de un estudiante. El
crecimiento del
microorganismo se da de
forma granular con bordes
lisos.

Para observar de manera correcta si hubo o no crecimiento microbiano es necesario incubar

la siembra a 37C por un tiempo de 24 a 48 horas. De las cuatro siembras realizadas, la nica
que no evidenci crecimiento fue la de Saccharomyces Cerevisiae, esto, posiblemente, debido
a un mal manejo de los instrumentos de siembra, como el asa, ya que en la imagen se puede
evidenciar un rompimiento del agar, lo cual puede dificultar el crecimiento microbiano.
Una buena tcnica garantiza la identificacin de la estructura morfolgica, ya que slo existe
una sola especie de microorganismo, lo cual facilita en gran manera su estudio, puesto que
ser mucho ms fcil poder realizar todo tipo de pruebas, bioqumicas, fisiolgicas, fsicas,
adems de permitir el recuento de microorganismos viables para poder comprender su
funcionamiento. [9]

Conclusiones

El procedimiento de extraccin de ADN fue llevado acabo correctamente ya que

permiti finalmente separar las molculas del material gentico de la cebolla.
La tincin de Gram permiti distinguir las bacterias utilizadas segn el Tipo (Gram
positivas o Gram negativas) segn la naturaleza de la pared celular. No obstante, con
la distincin del tipo fue posible discernir algunas de las caractersticas tales como la
forma.
El cultivo de microorganismos en diferentes medios requiere de un gran cuidado en
cuanto a la asepsia del lugar de trabajo, ya que cualquier descuido podra contaminar
la muestra o impedir el crecimiento microbiano, tal como ocurri con la Saccharomyces
Cerevisiae.

Referencias

[1] H. Curtis , S. Barnes y A. Schnek, Biologia: conceptos y principios, Septima ed., Mxico:
panamericana S.A., 2008, p. Capitulo 9.
[2] E. Cavallini, M. d. m. Gamboa , F. Chavarria y J. Garcia, Bacteriologa general, San Jos:
San Jose costa rica: Editorial de la universidad de costa rica , 2005.
[3] J. Gonzales Alfaro, BVS Cuba, 22 Junio 2004. [En lnea]. Available:
http://gsdl.bvs.sld.cu/cgi-bin/library?e=d-00000-00---off-0preclini--00-0----0-10-0---0--0direct-10---4-------0-1l--11-1l-50---20-about---00-0-1-00-0-0-11-1-0000&a=d&cl=CL1&d=HASH01ebc63ab80c0bbb5a182dab.20.4. [ltimo acceso: 08 Febrero
2016].
[4] Newsletter Microbial, Microbial Systems, 08 Febrero 2016. [En lnea]. Available:
http://www.microbial-systems.com/web/docs/Newsletter_Microbial_03.pdf.
[5] S. Quesada Mora, Manual de experimentos de laboratorio para bioqumica, Segunda ed.,
San Jos: EUNED, 2007, pp. 53-56.
[6] t. y. salud, actualidad en ciencia, salud, Biotecnologa y ambiente, 2014. [En lnea].
Available: http://tecnocienciaysalud.com/insulina. [ltimo acceso: 08 Febrero 2016].
[7] R. Vizuate, Universidad latina de Panam, 2012. [En lnea]. Available:
http://laboratoriodemicrobiologia.weebly.com/tincioacuten-de-gram--tincioacutendiferencial.html. [ltimo acceso: 08 Febrero 2016].
[8] M.
Pirez
y
M.
Mota
,
CEFA,
2008.
[En
lnea].
Available:
http://www.higiene.edu.uy/cefa/2008/MorfologiayEstructuraBacteriana.pdf. [ltimo acceso:
08 Febrero 2016].
[9] A. f. Rios y D. d. Mora , Scrib, 2014. [En lnea]. Available:
http://es.scribd.com/doc/91839312/DIFERENCIACION-DE-CRECIMIENTO-BACTERIANOPOR-SIEMBRA-EN-ESTRIA#scribd. [ltimo acceso: 08 Febrero 2016].