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INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

Unidad Profesional Interdisciplinaria de Ingeniera


Campus Guanajuato
Laboratorio de Biotecnologa Molecular
5BM2

Prctica no. 5

REACCIN EN CADENA
DE LA POLIMERASA
(PCR).
EQUIPO 4
Aragn Lpez Jovana Sarahy
Chagoya Snchez Cynthia Karen
Franco Garca Valeria Guadalupe
Ramrez Morales Mara Antonieta
PROFESORES:
Dr. Csar Aza Gonzlez
Dra. Karla Lizbeth Macas Snchez
M.C. Julieta Seplveda Angulo

05 de Octubre de 2015.

OBJETIVO GENERAL

Amplificar un fragmento de ADN mediante la tcnica de PCR y visualizarlo en gel de agarosa.

OBJETIVOS ESPECFICOS

Conocer el fundamento de la tcnica PCR.


Determinar el tamao promedio del fragmento de ADN teniendo como referencia un marcador
de peso molecular y compararlo con el tamao reportado.

RESULTADOS

TCNICA DE PCR
Para la presente prctica se generaron dos mezclas de reaccin de PCR con distintas
concentraciones (Tabla 1) empleando como templado el gen GFA1 producto de una PCR de
ADN de Sporotrix shenckii.
El gen fue proporcionado por los profesores el mismo da de la prctica. Las muestras y los
reactivos se mantuvieron a 4C aproximadamente durante toda la prctica.
Tabla 1. Mezclas de reaccin de PCR

Reactivo

Volumen (L)

Concentracin final

Mezcla 1

Mezcla 2

Mezcla 1

Mezcla 2

Agua

17

15

62%v/v

60%v/v

Regulador de PCR (10x)

2.5

2.5

0.92x

1x

MgCl2 (50 mM)

3.7 mM

4 mM

Oligo directo (10 M)

0.37 M

0.4 M

Oligo reverso (10 M)

0.37 M

dNTPs (2.5 mM)

0.18 mM

0.2 mM

ADN plasmdico (100 ng/L)

3.7 ng/L

4 ng/L

0.5

0.5

2.5 unidades

2.5 unidades

Taq polimerasa

El termociclador fue programado para 30 ciclos siguiendo las condiciones mostradas en la


Tabla 2.
Tabla 2. Condiciones para la amplificacin por PCR del gen

Ciclos

Accin

Temperatura (C)

Tiempo

Desnaturalizacin inicial

94

5 min

30

Desnaturalizacin

94

45 s

Alineacin

59

1 min

Extensin

72

1 min

Extensin final

72

5 min

Final

Mantenimiento

ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA AL 1%


Para corroborar que se amplific el gen de inters se continu con una corrida electrofortica
en gel de agarosa durante 40 min a 110 V, se observ el gel bajo luz ultravioleta en el
transiluminador obteniendo los resultados visualizados en la Figura 1.

600pb

Figura 1. Electroforesis del Gen GFA1 amplificado por PCR. a) Marcador Hyperladder 1Kb BIOLINE,
b) Mezcla de reaccin sin oligonucletido reverso, c) Mezcla de reaccin completa,
d) ADN templado (GFA1).

Se observ una banda de aproximadamente 600 pb en el carril correspondiente a la mezcla 1,


mientras que en el carril b) y d) no se observa ningn producto de amplificacin
correspondientes a la mezcla 2 y al templado respectivamente.

DISCUSIONES
REACCIN EN CADENA DE POLIMERASA
El mtodo de amplificacin de cidos nucleicos usado fue el de reaccin en cadena polimerasa
(PCR), ya que este mtodo combina los principios de la hibridacin de cidos nucleicos
complementarios con los de la replicacin que se aplican repetidas veces en numerosos ciclos.
Segn Forbes en (2009) al usar este mtodo, una sola copia de ADN templado, a menudo no
detectable por los mtodos de hibridacin estndares, se multiplica a 10 7 o ms copias en un
periodo relativamente breve. Esto proporciona gran cantidad de templado, que puede
detectarse con facilidad por varios mtodos.
En la tabla 3 se muestra una comparacin de las concentraciones utilizadas en distintos
protocolos para realizar PCR, es posible observar que las diferencias no son tan significativas a
excepcin de MgCl2.
Tabla 3. Comparacin de protocolos de PCR.

continuacin se presenta la importancia y funcin de cada uno de los reactivos necesarios para
la reaccin de PCR:

Agua desionizada estril


Dadas las bajas concentraciones de sales que posee ste tipo de agua, es ampliamente usada
para tcnicas que requieren alta esterilidad, como lo es la PCR, as se evitan variaciones
inicas en la reaccin y posibles interferencias (Eguiarte et al., 2007).
Cloruro de magnesio (MgCl2)
La enzima Taq DNA polimerasa requiere la presencia de magnesio para actuar como un
cofactor durante el proceso de reaccin. Su funcin es similar a la de un catalizador, en el
sentido que el magnesio no se consume en la reaccin, pero la reaccin no puede proceder sin
la presencia del mismo, es importante considerar para la concentracin final en la mezcla de
reaccin, pues altas concentraciones de este metal inhiben la accin de esta enzima,
generando productos inespecficos (Eguiarte et al., 2007), regularmente se trabaja con un
rango de concentracin entre 1 y 3 mM, sin embargo puede variar de acuerdo a la casa
comercial ya que el buffer para PCR puede contener tambin MgCl2 (Harris, 1998).
Desoxirribonucletidos trifosfatados (dNTPs)
Los dNTPs son los bloques para construir el ADN duplicado en la reaccin. Se incluyen
cantidades iguales de cada nucletido (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), usualmente a una
concentracin de 200M. Concentraciones bajas de dNTPs disminuyen el ndice de
incorporacin errnea de los nucletidos, mientras que concentraciones altas disminuyen la
especificidad de la reaccin (Torres et al, 1995; Harris, 1998).
Otro factor a considerar es la inestabilidad de los dNTPs, ya que estos son sensibles a los
ciclos de fundicin-congelamiento, y es a partir de 3 a 5 ciclos que desaparece casi por
completo la amplificacin en la reaccin de PCR (Henegariu et al. 1997), por lo que si las
alcuotas empleadas fueron sometidas a descongelamientos anteriormente, estos pudieron
haber estado daados.
Oligonucletidos (Directo y Reverso)
Los oligonucletidos hibridan con regiones especficas del ADN, delimitando la regin de
inters. Tienen una longitud de 15 a 30 nucletidos y su secuencia es lo que confiere
especificidad a la amplificacin, la concentracin ptima para PCR usualmente est entre 0.1 y
1M (Torres et al, 1995; Harris, 1998).

Templado (ADN)
La calidad del material gentico afecta directamente el resultado de la reaccin, si ste
presenta contaminacin, con protenas o detergentes, la reaccin puede inhibirse (Eguiarte et
al., 2007).
Buffer 10X
La mayora de los buffers contienen Tris 10mM y KCl 50mM; el pH vara de 8.2 a 9 a 25C sin
embargo ste se reduce conforme aumenta la temperatura por lo que vara de 6.8 a 7.6. El pH
ptimo para la Taq polimerasa se encuentra entre 7.0 y 7.5. Tambin pueden contener algn
detergente o MgCl2. Es importante utilizar el buffer proporcionado por el fabricante ya que la
preparacin ha sido optimizada para la Taq polimerasa correspondiente (Harris, 1998)
Taq ADN polimerasa
La Taq polimerasa se debe mantener en congelacin (-20C) hasta su uso, y posteriormente en
hielo. Debe agregarse como ltimo reactivo a la reaccin para evitar que la misma comience
antes de llegar a las condiciones ptimas y origine productos no especficos de la amplificacin
(Zavala, 2005).

Esta enzima puede resistir a temperaturas de 95C, necesarias para la separacin de las dos
hebras de ADN y permite manejar la astringencia de la reaccin y as acceder nicamente a
las secuencias de ADN especficas de la zona utilizada (Sforza, 2007).
El principio de la PCR se basa en la amplificacin de un fragmento especfico de ADN a travs
de ciclos sucesivos en los que se multiplica exponencialmente hasta acumular suficiente
producto para ser visualizado. Este proceso se logra a travs de tres etapas: desnaturalizacin,
hibridacin y extensin.
La primera de ellas, la desnaturalizacin permite iniciar la reaccin ya que es preciso que las
molculas de ADN molde se encuentren en forma de cadena simple. Esto se consigue
calentando a temperatura de 94C, para que produzca la rotura de los enlaces puente de
hidrgeno intercatenarios y la separacin de ambas cadenas. Esta temperatura se mantuvo por
5 min para asegurar la completa separacin de la doble cadena de todo el ADN presente en la
muestra, pues si ste slo se desnaturaliza parcialmente tender a hibridar nuevamente
dificultando con esto la alineacin de oligonuclotidos (Harris, 1998).
En cuanto a la hibridacin segn Brown (2008) una vez que el ADN est desnaturalizado se
disminuye la temperatura de la reaccin hasta un rango comprendido entre los 40 y los 60C,
esta temperatura depende directamente de la temperatura de alineamiento de los
oligonuclotidos.
Para la amplificacin del gen GFA1, se usaron oligonucletidos especficos con las siguientes
secuencias:
Oligo Directo
Oligo Reverso

5 CGCTCCATACTAGCCCGT 3
5 GCAACCTTGCCAACCTCCT 3

Se realiz un anlisis de stos con la herramienta Primer Design and Search Tool de
BiSearch (Tabla 4) para conocer la temperatura de hibridacin ptima, la cual regularmente se
considera 5C por debajo de la temperatura de fusin de los oligonucletidos (Winkler, 2014).
Tabla 4. Caractersticas de los oligonucletidos utilizados

Oligo

Tamao

Tm (C)

%GC

Directo

18

66.2

61.1

Reverso

19

64.6

57.9

Tm promedio (C)

65.4

T alineamiento (C)

60.4

La temperatura de alineamiento utilizada fue de 59C, que est 1.4C por debajo de la
temperatura ptima terica, sin embargo sta se puede variar de 2 a 5C para optimizar la
amplificacin del ADN de inters (Harris, 1998).
Finalmente durante la etapa de extensin, la ADN polimerasa termoresistente incorpora
nucletidos en el extremo 3 del cebador utilizando como molde la cadena de ADN previamente
desnaturalizada. La temperatura a la que se realiza esta etapa de la reaccin es de 72C ya
que es la temperatura a la que la Taq polimerasa alcanza su mxima actividad (Fernndez,
1994; Garca, 2006; Rojo, 2014; Winkler, 2014; Harris, 1998). El tiempo de esta etapa depende
del tamao previsto del fragmento a amplificar considerando que la velocidad promedio de
polimerizacin es de 1 Kb por minuto (Sforza, 2007; Winkler, 2014).

VISUALIZACIN EN GEL DE AGAROSA AL 1%

Despus de que se completa la reaccin de amplificacin de ADN, debe analizarse el producto


de amplificacin. La electroforesis en gel es una de las formas ms simples de adquirir
informacin acerca del amplicn. Se pueden usar diferentes tipos de geles para la
electroforesis, pero a menudo se usa un gel simple de agarosa.
Es necesario comparar cualitativamente el producto de PCR, con otros ya reportados, en la
Figura 2 se observa el resultado de la amplificacin del gen RPL32. Al igual que en la Figura 1,
carril c, el gen amplificado es visualizado como una sola banda, producto de una PCR
realizada correctamente.

Figura 2.Electroforesis en gel de agarosa al 1%. 1) Marcador de peso molecular, 2) Control negativo,
3 y 4) gen RPL32 amplificado (Prez et al, 2014).

De acuerdo con Winn y col (2006), la presencia de una banda nica del tamao esperado es
una buena evidencia preliminar de la especificidad de la reaccin de PCR, lo cual puede
observarse en los resultados obtenidos, la nica banda visualizada en el gel present poca
intensidad lo que indica que la concentracin de amplicn es baja, pues existe una relacin
proporcional entre la intensidad de la banda y la cantidad de producto amplificado (Muoz,
2015). En teora, es suficiente con una molcula de ADN para amplificar un fragmento por PCR
sin embargo, el rendimiento a pequeas concentraciones de templado es bajo (Jimnez, 2003),
de modo que si se hubiese utilizado una mayor cantidad de ADN se esperara obtener una
banda de mayor intensidad.
Desde el punto de vista experimental, la sensibilidad y la especificidad en el anlisis de una
muestra por PCR pueden ser aumentadas si se realiza un segundo PCR o n-PCR. El ensayo
por n-PCR consiste en dos reacciones de PCR consecutivas. En la primera reaccin de
amplificacin se utilizan cebadores especficos de la secuencia por analizar. El producto de
esta reaccin sirve como templado para una segunda reaccin de PCR. La sensibilidad en la
deteccin se ve aumentada ya que al final del ensayo la secuencia blanco ha sido amplificada a
lo largo de dos rondas de PCR (Maldonado, 1998). Esto puede observarse en la Figura 1
comparando los carriles c y d, ambas muestras se tratan del gen GFA1, sin embargo ste solo
es visible en el carril c que corresponde a la PCR consecutiva de la muestra en el carril d.
De acuerdo con la base de datos de NCBI el gen GFA1 cuenta con una secuencia de 598 pb
(Figura 3), este tamao es muy cercano a la banda observada en el carril c de la Figura 1 que
corresponde a aproximadamente 600 pb con lo que se puede decir que la PCR fue realizada
exitosamente.

Figura 3. Secuencia del gen GFA1.


* La secuencia del oligo es el reverso complementario de la seccin resaltada.

Cuando no se observa producto luego de una PCR se puede deber a fallas en 3 parmetros
principales: qumicos, fsicos o trmicos. Uno de los errores qumicos ms comunes en el
proceso se da al omitir alguno de los ingredientes de la mezcla de reaccin (Harris, 1998). En
el caso del carril b en la Figura 1, no se esperaba observar producto debido a la ausencia de
oligo reverso en la preparacin.
Otra forma de explicar la ausencia de producto es mediante la frmula para calcular el nmero
de copias segn los ciclos de reaccin (Horton et al, 1994):
Copias de ADN amplificado:

n1

donde se consideran las cadenas que se forman a partir del segundo ciclo con ambos
oligonucletidos, en nuestro caso, al aadir nicamente el oligo directo, la frmula se
modificara de la siguiente manera:
Copias de ADN amplificado:

n1

De donde es bien sabido que el valor de uno elevado a cualquier potencia seguir siendo uno
(Graham, 1989), lo que significa que independientemente del nmero de ciclos, siempre se
obtendr una sola cadena, que es una concentracin mnima y no puede ser visualizada.

CONCLUSIONES

Se amplific el gen GFA1 mediante PCR consecutiva.


Se determin el tamao del gen mediante la visualizacin en gel de agarosa
coincidiendo con el tamao consultado en la base de datos de NCBI.
Se comprendi el fundamento terico de la PCR.

CUESTIONARIO

Calcula a partir de la frmula adecuada la Tm de los oligonucletidos proporcionados.


La temperatura de alineamiento, es la temperatura a la que hibridan los oligonucletidos, y
depende directamente del porcentaje de cada una de las bases, mejor dicho de las uniones
entre las bases.
= 4(+) + 2 (+)

(Entrala, 2000)

Oligonucletido directo

+=11 +=7

= 4(11)+ 2 (7)=58

Oligonucletido reverso

+=11 +=8

= 4(11)+ 2 (8)=60

promedio= 59C
Mencione que sucedera si se utiliza una temperatura de alineamiento muy inferior o
muy superior a la temperatura ptima.
La temperatura de alineamiento depende de la longitud del primer, si dicha est por encima o
por debajo de la ptima funcionar incorrectamente. En caso de que sea alta es posible que no
se realice la unin con la regin complementaria del primer, por el contrario, al ser muy baja
ser una unin inespecfica (Arredondo, 2001).
Mencione las principales causas a las que atribuira.
a. Ausencia de amplificado
Degradacin del ADN: puede ocurrir cuando se manipula la muestra en condiciones subptima
o bien prdida de un alelo, que se puede llegar a confundir con ser homocigtico para dicho
alelo y resulta en ausencia de amplificacin o resultados parciales.
Modificacin del ADN: la luz ultravioleta modifican el ADN, alterando as los resultados de la

amplificacin.
Inhibicin de la PCR: puede haber agentes que interfieren en el correcto transcurso de la PCR.
Requerir un procesamiento adicional de la muestra para eliminar estos compuestos del medio
antes de preparar la mezcla de PCR.
(Butler, 2005).
b. Amplificacin en un control negativo.
El control negativo se utiliza para comprobar que ninguno de los componentes de la
reaccin est contaminado con ADN de otra procedencia y que no se han producido
errores de manejo que hayan provocado la contaminacin cruzada entre muestras.
Sin embargo puede darse contaminacin (arrastre de productos amplificados o cidos
nucleicos) por:
-Inhibidores de la PCR en la muestra (ej. grupo hemo, heparina)
-Extraccin del ADN defectuosa
-Mutacin en el sitio de hibridacin del cebador
-Baja concentracin o calidad del templado
-Concentracin incorrecta de Mg2+ o primers
(Ogawa et al., 1980).
Investigue qu podra hacer para corregir los siguientes resultados.

a. Presencia de productos inespecficos de amplificacin.

Ajustar la temperatura de annealing: La optimizacin de la temperatura de annealing es


particularmente importante segn aumenta la complejidad gentica de la muestra. Una mayor
complejidad favorece el annealing inespecfico y bajo condiciones no muy estrictas la baja

especificidad puede provocar la amplificacin de productos inespecficos que se observan en


los geles como bandas de pesos moleculares superiores o inferiores a los esperados. Para
tales casos es necesario ajustar dicha temperatura, como regla general, conviene empezar por
la temperatura obtenida de frmulas matemticas e irla incrementando varios grados; a la
primera seal de prdida de sensibilidad se debe elegir la temperatura inmediatamente inferior.
Ajustar la concentracin de los primers: Si la concentracin de primers es baja puede ocasionar
un pobre rendimiento de la reaccin. Si es demasiado alta puede ocasionar una disminucin de
la especificidad que se manifiesta por un incremento en los productos de amplificacin
inespecficos; adems, puede favorecer la formacin de dmeros de primers (Roca et al.,
2004).

b. Baja cantidad del amplificado.

Ajuste de la concentracin de Mg2+: El aumento de la [Mg2+] tiene el efecto neto de disminuir


la severidad de la unin de los primers y, por lo tanto, una baja especificidad de la reaccin; las
bajas [Mg2+] pueden originar una pobre eficiencia de la reaccin.
La [Mg2+] debe calcularse como funcin de la concentracin de nucletidos; para la
mayora de protocolos, debe probarse un rango de [Mg2+] entre 0.5 y 3.0 mM por
encima de la concentracin de nucletidos.
El ajuste de los Desoxinucletidos Trifosfato (dNTPs): La concentracin ptima de dNTPs debe
determinarse empricamente y conjuntamente con la [Mg2+]. De forma general, la [dNTPs]
vara entre 20 y 200 mM, teniendo en cuenta que concentraciones demasiado elevadas pueden
originar una menor especificidad y concentraciones demasiado bajas pueden provocar un bajo
rendimiento de los productos de amplificacin.
Eleccin y concentracin de la enzima: Las concentraciones de las diferentes polimerasas
utilizadas en la PCR varan significativamente, pero para la Taq polimerasa vara entre 1.0 y
2.5U por cada 100 L de reaccin. Para optimizar la concentracin de enzima, se debe testar
empricamente el protocolo variando la concentracin entre 0.5 y 5.0 U por cada 100 L de
reaccin. Cuando la concentracin de enzima es muy elevada se produce la unin inespecfica
de los primers y cuando es demasiado baja se obtiene una baja eficiencia de amplificacin.
(Roca et al., 2004), (Carzoglio et al., 2007).

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