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Laboratorio de Bioqumica

Ingeniera en Biotecnologa de los RR.NN


Docente: Valentina Venturi.
PRCTICA No. 1 TITULACION DE AMINOCIDOS
Fecha de realizacin: 11/Noviembre/2015 Fecha de entrega: 16/Noviembre/2015
Pamela Elizabeth Logroo Lpez, Johana Maricela Lozano Calva, Bryan Alonso Montero, Esteban Andrs Rojas
Chvez, Bryan Vergara.
EQUIPOS.
La medicin del pH de la solucin B se efectu mediante en un pHmetro, de marca Mettler Toledo, modelo Seven Multi
S47K, serie 0031. A partir de estas mediciones se pudo realizar la curva de calibracin e identificar el tipo de aminocido
al que perteneca la dicha solucin.
REACTIVOS.
Se prepar una solucin madre, a partir de sosa caustica al 0,5 molar (5ml), conjuntamente con una solucin de
fenolftalena (5ml), ambos de marca desconocida. A partir de esta solucin madre, se procedi a la titulacin de la
solucin B para determinar qu tipo de aminocido fue el que se analiz en la prctica de laboratorio.
PROCEDIMIENTO
Para la realizacin de la prctica de laboratorio (Titulacin de aminocidos), se dispuso de2 tipos de soluciones A y B,
de las cuales se escogi la solucin B para la titulacin. Para esto se tom 20 mL de dicha solucin en una probeta
graduada y se lo verti dentro de un vaso de precipitacin. Tambin se prepar la solucin buffer, a partir de la mezcla de
5ml de NaOH (0,5 M) con 5 mL de fenolftalena, esta solucin se coloc en la bureta para que acte como titulante de la
solucin B. Finalmente se afor, comenzando con 5 gotas de la solucin tampn, luego se aument la cantidad de las
mismas (15) mientras que simultneamente se iba midiendo el pH cada cierta cantidad de gotas, hasta llevar a la solucin
B a un pH de 12 y as poder determinar a qu tipo de aminocido corresponda la solucin utilizada.
RESULTADOS Y DISCUSIN.
Tras realizar la titulacin de la solucin escogida por el grupo de trabajo (solucin B) para identificar el tipo de
aminocido al que perteneca dicha solucin, se midi el volumen de la sustancia titulante simultneamente al igual que
el pH de la mencionada solucin. Los datos obtenidos se observan en la tabla N1.
Tabla N1: Volumen de titulante NaOH y el pH generado en cada medicin.
Volumen de pH
NaOH
0.00
2.261
0.25
2.388
0.90
2.570
1.55
2.801
2.20
3.174
3.50
7.750
3.85
9.297
3.95
9.712
4.15
10.006
4.80
10.295
5.45
10.606
6.10
11.067
6.75
11.740
7.40
11.928
7.65
12.001

A partir de estos datos, se realiz la curva de titulacin, la cual se muestra en la figura N1, tomando los datos de
volumen de NaOH y pH del aminocido generado. As, al observar la grfica y compararla con el anexo N1, se puede
determinar que el aminocido problema es histidina. De esta manera, la curva de titulacin proporcion la siguiente
informacin:
Medida del pK de los grupos ionizables: se localizan en el punto medio de la zona tampn.
Regiones de capacidad tampn: mesetas donde se localizan los pKs; dichas regiones se encuentran en el intervalo pK
1 unidad de pH.
pI: se localiza en el intervalo de viraje.
Formas ionizables del aminocido en cada rango de pH.
Carga elctrica del aminocido en cada rango del pH
Solubilidad relativa del aminocido en cada rango de pH.

Figura N1: Curva de titulacin de histidina, en relacin del volumen de NaOH (mL) y el pH generado.
Se debe tener en consideracin el hecho de que este aminocido presenta tres grupos ionizables: el grupo carboxilo, el
grupo imidazol de la cadena lateral y el grupo -amino (Navas, 2010). Por lo tanto, la adicin de equivalentes de base
produce la liberacin secuencial de protones al medio, y estos equilibrios estn determinados por sus correspondientes
constantes: el grupo carboxilo (pKC), el grupo imidazol (pKR) y el grupo amino (pKN). En este caso, existen tres
regiones de capacidad tamponante, una de ellas localizada cerca del pKR=6, por lo que la histidina acta como tampn a
pH fisiolgico. A su vez, el pI se calcula como el promedio del pKN y del pKR. As, el pI terico de la prctica realizada,
fue de 6.59, tomando en cuenta el valor de pKR=3.174, que es el ms prximo a y de pKN=10.006, (Ver Anexo N2). Al
compararlo con el punto isoelctrico de la titulacin que se observa en la figura N1, 7,750, se pudo comprobar la
veracidad de la determinacin del pI de la histidina, que tomando en cuenta datos tericos establecidos no presenta una
diferencia significativa entre ambos valores (pI= es de 7.58).
Con los valores de pKN, pKR y pI, se puede determinar la estructura de la histidina en cada una de estas condiciones,
tomando en cuenta tambin el valor inicial del pH (Vase Anexo N4).
El aminocido problema presenta un grupo amino adicional en la cadena lateral, que puede comportarse como una base
(captando un protn para quedar como -NH3+), as se encuentra el ciclo con un grupo amino secundario (Ver Anexo N3).
En el caso de la histidina, el hecho de que su pKR est muy prximo al pH fisiolgico, implica que este aminocido
puede actuar como cido como base en los medios biolgicos. Por lo tanto, la hemoglobina, que es una protena rica en
histidina, es capaz de tamponar los excesos de cido de base en la sangre, constituyendo uno de los sistemas tampn
del organismo (uno de los ms importantes junto al tampn bicarbonato). Adems, la histidina forma parte del centro
activo de muchas enzimas que catalizan reacciones que cursan con transferencia de protones (Nuez, 2012).
Comparando la grafica de titulacin del aminocido obtenida de acuerdo a los valores de pH y volmenes de NaOH con
una grfica presentada por Lpez y sus colaboradores (1974) (Vase Anexo N5), los cuales hicieron uso de clorhidrato
de histidina para realizar la curva de titulacin; no existe una diferencia significativa entre las mismas, por lo cual se
puede asegurar que la prctica realizada en el laboratorio fue un xito, ya que se pudo identificar con precisin a que tipo
de aminocido perteneca la solucin B que se utiliz en el laboratorio.

Conclusin.
De acuerdo al punto isoelctrico (punto de equivalencia, en el que se titul la solucin) que se determin
experimentalmente mediante titulacin de la solucin B (7,75), se pudo identificar que dicha solucin corresponda a la
histidina, que es un aminocido esencial para la vida.

Bibliografa
Barbosa-Corona, E., Guadalupe, O., & Salcedo-Hernandez, R. (2007). Manual de
Practicas de Bioquimica. Mxico: Universidad de Guanajuato.
Departamento de Bioquimica y Biologia Molecular- Universidad de Salamanca. (2012).
pH y Equilibrios cido-Base. Espaa: Universidad de Salamanca.
Harris, D. (2003). Anlisis qumico cuantitativo. Barcelona: Revert S.A.
Lehniger. A, Nelson. D, Cox. M. (1993). Principios de Bioqumica. 2da edicin. Ediciones
Omega. Barcelona. Espaa.
Lopz. J, Gomz. C, Rivas. J, Losada.M. (1974). Prcticas de Bioqumica II: pH-Metra.
Departamento de Bioqumica. Facultad de Ciencias. Universidad de Sevilla.
Mndez, E., Cruz, J., & Cano, H. (2002). Manual de Practicas de Bioquimica. Colombia:
Universidad Industrial de Santander.
Navas, J. (2010). Problemas de ionizacin de aminoacidos . Departamento de
Bioqumica y Biologa Molecular. universidad de Alcal.
Nuez, V. G. (2012). Curvas de titulacin de aminocidos. Espaa : Departamento de
Bioqumica y Biologa Molecular. Universidad de Salamanca.

ANEXOS.
Anexo N1: Curva de titulacin de histamina tomada como referencia para la evaluacin del aminocido problema.
Anexo N2: Clculo del pI terico de histamina.

pI =

pKR + pKN 3.174+10.006


=
2
2

pI =6.59
Anexo N3: Estructura cclica de la histamina.

Anexo N4: Estructura de la histamina de acuerdo a la variacin de pH.

Anexo N
5: Curva de titulacin utilizando clorhidrato de histamina.

Cuestionario.
1.

Si usted va a evaluar el efecto de pH sobre la actividad enzimtica Qu criterios debe tener presente
para seleccionar los Buffers a utilizar?
La actividad de un enzima se ve afectada por el pH al cual se lleva a cabo la reaccin, el valor de pH al cual la actividad
enzimtica es mxima se denomina pH ptimo; dicho pH no tiene por qu coincidir con el pH intracelular. La relacin
entre el pH y la actividad depende del comportamiento cido-base del enzima y del propio sustrato (Barbosa-Corona,
Guadalupe, & Salcedo-Hernandez, 2007).
Las consideraciones que se deben tomar en cuenta al momento de trabajar con enzimas son: evitar altas temperaturas y
acides o alcalinidad extrema (evitar pH mayor a 9 o menor a 5); evitar la formacin de espuma, ya que la misma es
indicador de desnaturalizacin proteica.
Para que una solucin buffer sea ptima para su utilizacin esta debe cumplir con las siguientes caractersticas:
Las soluciones buffer deben prepararse de manera que las concentraciones iniciales de las especies conjugadas
estn entre 0,05 M y 1,0 M y que la relacin entre sus concentraciones (Ca / Cb) est comprendida entre 0,1
y10.
El intervalo de pH para el cual un sistema buffer regula adecuadamente es:pKa 1 < pH < pKa + 1.
El sistema buffer ms adecuado es aquel cuyo valor de pKa est lo ms cerca posible del pH que se desea
regular.
La dilucin no cambia el pH de la solucin buffer pero disminuye considerablemente su capacidad reguladora
(Mndez, Cruz, & Cano, 2002).
2. Cmo demuestra en el laboratorio el rango ptimo de capacidad tamponante de un buffer?
Podemos definir a la capacidad amortiguadora de un tampn como la cantidad de cido o base fuerte que puede
neutralizar sufriendo un desplazamiento de pH de una unidad.
Resulta evidente que la eficacia amortiguadora est vinculada a dos factores: La concentracin absoluta del sistema y la
proporcin relativa de las formas disociada y sin disociar.
A nivel de laboratorio es posible determinar el rango ptimo de capacidad tamponante de un buffer mediante la
realizacin de una curva de titulacin, ya que la misma nos servir para determinar la eficacia mxima del amortiguador,
tanto para neutralizar cidos como bases, esta capacidad se ve reflejada en la zona de pH de mayor pendiente.
3. Cul es el objetivo de titular con hidrxido de sodio aminocidos desconocidos?
Los aminocidos son compuestos anfteros, lo que significa que muestran al mismo tiempo un carcter cido y bsico.
El objetivo de titular (acido-base) con hidrxido de sodio, es identificar o analizar en qu forma de ionizacin se
encuentra el aminocido a ser estudiado ya sea este: protonado, de ion doble (zwitterin) y desprotonado. Un modo de
hacerlo es disolver el aminocido a un pH muy bajo (por ej., pH=1) e ir aadiendo poco a poco una base fuerte en este
caso el hidrxido de sodio, a la vez que se va midiendo el pH. As se obtiene una curva de calibracin, en donde gracias a
la misma se determina el tipo de aminocido estudiado.
4. Qu significa cuando ocurren cambios bruscos de pH durante la titulacin de algn aminocido?
Cuando ocurren cambios bruscos de pH durante la titulacin es posible determinar en la curva de titulacin el punto
isoelctrico, valor del pH en que la carga neta del aminocido es cero. En este punto, pequeos cambios en la
concentracin de equivalentes cidos o bsicos en la solucin ocasionan cambios bruscos de pH, por lo tanto el
aminocido no tiene capacidad amortiguadora.
5. Para qu se emplea la ecuacin de Handerson-Hasselbalch?
La ecuacin de Handerson-Hasselbalch es una forma transformada de la expresin de la constante de equilibrio Ka.
Se emplea la ecuacin de Henderson-Hasselbalch para calcular el pH, de una solucin buffer, siempre que se conozca la
relacin de concentraciones del cido y base conjugados y el Pka, del cido (Harris, 2003).
6.

Cmo distinguir la curva de valoracin de un aminocido bsico de la obtenida con un aminocido


neutro?
En el caso de los aminocidos, las curvas de titulacin proporcionan la siguiente informacin (o bien se puede deducir a
partir de las mismas):
a) Medida del pK de los grupos ionizables: se localizan en el punto medio de la zona tampn.
b) Regiones de capacidad tampn: mesetas donde se localizan los pKs; dichas regiones se encuentran en el
intervalo pK 1 unidad de pH.
c) Punto isoelctrico: se localiza en el intervalo de viraje.
d) Formas ionizables del aminocido en cada rango de pH.
e) Carga elctrica del aminocido en cada rango del pH
f) Solubilidad relativa del aminocido en cada rango de pH.

Para distinguir una curva de titulacin de un aminocido neutro, se tomara como referencia a la glicina.
1. A pH cido la glicina se encuentra como un cido diprtico, ya que tanto el grupo amino como el carboxilo se
encuentran protonados, es decir, a pH = 1, el 100% de las molculas de aminocido se encuentran en forma
de catin.
2. Al ir aadiendo equivalentes de base, el grupo -carboxilo (-COOH) se disocia, cediendo protones al medio y
transformndose en un grupo carboxilato; este equilibrio viene descrito por el pKC. Cuando pH = pKC, la
glicina se encuentra como 50% cation + 50% zwitterion. Por lo tanto, el par -COOH/-COO- puede servir
como un tampn amortiguador en la regin de pH cerca del valor pKC.
3. En el punto isoelctrico, prcticamente el 100% del aminocido se encuentra como ion dipolar o zwitterion,
de forma tal que el aminocido presenta una carga neta nula (el aminocido es elctricamente neutro).
4. Si se siguen aadiendo equivalentes de base, el grupo amino (-NH3+) se disocia tambin, obtenindose la
forma totalmente desprotonada de la glicina; este equilibrio est definido por el pKN. Cuando pH = pKN, la
glicina se encuentra como 50% zwitterion + 50% anion. Por lo tanto, el par -NH3+/-NH2 puede actuar como
un sistema tampn disolucin amortiguadora en la regin de pH cerca del pK N.
5. A pH muy elevados, el 100% de las molculas de aminocido se encuentran en forma de ion negativo o
anin. (Departamento de Bioquimica y Biologia Molecular- Universidad de Salamanca, 2012)
Para distinguir una curva de titulacin de un aminocido bsico, se tomara como referencia a la histidina.
Las premisas establecidas para la glicina son igualmente vlidas. Simplemente hay que tener en consideracin el hecho
de que este aminocido presenta tres grupos ionizables: el grupo carboxilo, el grupo imidazol de la cadena lateral y el
grupo -amino.
Por lo tanto, la adicin de equivalentes de base produce la liberacin secuencial de protones al medio, y estos equilibrios
estn determinados por sus correspondientes constantes: el grupo carboxilo (pKC), el grupo imidazol (pKR) y el grupo
amino (pKN). En este caso, existen tres regiones de capacidad tamponante, una de ellas localizada cerca del pK R = 6, por
lo que la histidina acta como tampn a pH fisiolgico. A su vez, el punto isoelectrico se calcula como el promedio del
pKN y del pKR. En el caso de la histidina, el hecho de que su pK R est muy prximo al pH fisiolgico, implica que este
aminocido puede actuar como cido o como base en los medios biolgicos. (Departamento de Bioquimica y Biologia
Molecular- Universidad de Salamanca, 2012)